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实验七 荧光定量PCR
简介
定量PCR：检测PCR反应指数期某一点的PCR产物数量，由此 确定初始模板的数量。
荧光定量PCR （real-time Q-PCR）：是指在PCR反应体系中加 入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后 通过标准曲线或内参基因对未知模板进行定量分析的方法。
1996年由 Applied Biosystems公司推出该技术 实现了PCR从定性到定量的飞跃 特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点
熔解曲线分析引物二聚体
Product of Interest Primer dimers
TaqMan探针法
➢ 5’端标记有报告基因（Reporter，R），如FAM、VIC等 ➢ 3’端标记有荧光淬灭集团（Quencher，Q） ➢ 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与
Q分开，发荧光 ➢ Taq酶有5’→3’外切核酸酶活性，可水解探针
荧光定量PCR的优点
❖ 荧光信号的强弱可实时反映DNA的扩增 ❖ 灵敏度极高，用于准确定量初始模板数量 ❖ 既能用于定性，判断一段DNA序列的有无，
也可用于定量，确定起始DNA拷贝数
荧光定量PCR扩增曲线
✓ 荧 光 定 量 PCR扩 增 曲线并非标准的指 数曲线，而是S形曲 线，并可分为反应 早期、指数期和线 性期和平台期。
每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步
TaqMan探针法
荧光标记物的选择
不同定量方法的比较
定量方法
绝对定量：指的是用已知的标准曲线来推算未 知的样本的量，绝对定量则需要使用标准曲线 确定样本中基因的拷贝数或浓度
相对定量：在一定样本中靶序列相对于另一参 照样本的量的变化，相对定量常见于比较两个 样本中基因表达水平的高低变化
荧光定量PCR实验技术干货

荧光定量PCR实验技术干货

（探针法不需要） • 一组标准样本（有些分析方法不需要）
37
相对定量分析－－管家基因筛选
• 管家基因
– 维持细胞基本代谢活动所必须的基因，
– 如：GAPDH、Actin、18S rRNA等
• 筛选方法
– 根据文献提供 – 通过具体实验筛选
实验值
6 5 4
Pβ-Actin PGAPDH
3 2 1
Oβ-2-microglobulin PHPRT
荧光定量PCR原理－－Ct值的重现性
纵 轴 ： 荧 光 信 号 量
横轴：PCR反映循环数
➢ Ct值的特点： • 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； • Ct值极具重现性
19
荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理 理想的PCR反应 Xn＝X0 * 2n
n：扩增循环数 X0 ：起始模板数量 Xn：第n次循环后扩增产物数量
• 方法：检测毕赤酵母的A基因 • 标准品：质粒标准品浓度为5个浓度；3个重复；设阴性空白对照 • 实验步骤：
提取A DNA； 设计特异引物； 设计TaqMan探针并标记探针； 荧光定量扩增； 结果分析：获取毕赤酵母的A的精确copy数。
31
绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量
32
绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量
➢ 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量
Sample
2 5
27
绝对定量分析几要素
• 一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。 • 一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒
、PCR产物、基因组DNA等。 • 重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统
(完整版)荧光定量PCR简介

(完整版)荧光定量PCR简介

Real time Q-PCR 通过对 PCR 扩增反应中每一次循环 产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的 分析。
1.3 数学原理
Real time Q-PCR动力学曲线可以分成四个阶段：基线阶段 , 指 数增长期、线性增长期和平台期。
定量PCR的几个重要的参数：
基线→阈值→CT值→ [DNA]0 基线就是扩增曲线的水平部分。
1化.4.1学染原料理法化—学—原理染料法
SYBR Green I 是一种结合于DNA双链小沟的染料。游离时不 发光，与DNA结合时发光。每形成一个DNA双链，就有一定 数量的染料结合上去。所以荧光信号强度与DNA分子总数目成 正比。
1化.4.2学探原针法理化—学—原理探针法
TaqMan探针是一种寡核苷酸探针。每产生一条 DNA链，就切断一条探针，然后产生一个单位信 号，信号强度与结合探针的DNA分子数成正比。
• 3、其它。例如SNP检测，性别鉴定等。
5曲、Q线PC成R定弯量曲的的常见原问因题
5.1 扩增曲线弯曲
➢原因：样品浓度跨度太大，有的样品浓度太高，在同一基线 设置情况下，会导致Ct值太小（小于基线右侧）的样品的曲线 在右侧下跌。 ➢解决方案：对于能检测出Ct的样品，读出数据；浓度太高的 样品，需稀释后另做实验。
VS
StepOnePlus™ System
Life Tech-ViiA7
4.1 S两tep种On仪e P器lus及比V较iiA7对比
4.荧2 荧光光定定量量的的应用应用
• 1、DNA或RNA的定量分析。包括病原微生 物或病毒含量的检测，转基因动植物转基 因拷贝数的检测等。
• 2、基因表达差异分析。例如比较经过不同 处理样本之间特定基因的表达差异（如药 物处理、物理处理、化学处理等），特定 基因在不同时期的表达差异以及cDNA芯片 的确认。
整理)荧光定量PCR

整理)荧光定量PCR

荧光定量PCR（qPCR）一、所需试剂1、模版DNA（一般为RTPCR产物）2、引物：详见引物设计（需要内参和目的基因的引物）3、（RR820A试剂盒，4℃避光6个月保存，-80℃长期）①SYBR® Premix Ex Taq II（TliRNaseH Plus）（2×Conc.）：含有以下成分（1）Ex Taq HS：一种耐热性DNA聚合酶，具有3′→5′核酸外切酶活性（校正活性）；PCR 产物3′端附有一个“A”碱基。

（2）dNTP Mixture：扩增的原材料（3）Mg2+：影响聚合酶的活性，增加扩增效率；影响引物复性和解链温度；浓度太高却会降低特异性（4）TliRNaseH：抑制cDNA 中残存 mRNA 对 PCR 反应造成的阻害作用（5）SYBR® Green I：与双链DNA结合后发出荧光。

检测PCR产物扩增量的目的②ROX Reference Dye（50×Conc.）使用仪器：Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System、StepOnePlusTM③ROX Reference Dye II（50×Conc.）：浓度比②低使用仪器：Applied Biosystems7500 Real-Time PCR System和 7500 Fast Real-Time PCR System、ABI QuantStadio DX用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差，无需使用②/③的仪器：Thermal Cycler Dice Real Time System II、LightCycler®/ LightCycler®480 System(Roche Diagnostics) 或CFX96™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)二、操作步骤（冰上进行）1、反应体系构建（）(除DNA模版外，同一基因的其他试剂配成总管*1通常引物终浓度为 0.4 μM 可以得到较好结果。

荧光定量PCRPPT课件

荧光定量PCRPPT课件


仪器设备
确保PCR仪、荧光检测器 等设备正常运行，并按照 实验要求进行参数设置。
实验设计
根据研究目的和样本特性， 设计合理的荧光定量PCR 实验方案。
样本处理
样本收集
采集具有代表性的样本， 并妥善保存以备后续实验。
样本处理
将样本进行适当的处理， 如细胞分离、DNA/RNA 提取等，以获得足够的核 酸模板。
荧光信号检测
在PCR循环过程中，实时监测荧光 信号的变化，收集数据以供后续分 析。
结果分析
数据处理
结果应用
对荧光定量PCR实验数据进行处理， 如阈值设定、循环阈值（Ct值）计算 等。
将荧光定量PCR实验结果应用于后续 的研究或实际应用中，如基因表达分 析、病原体检测等。
结果解读
根据实验目的和预期结果，对荧光定 量PCR实验结果进行解读，并评估其 可靠性。
02
该技术利用荧光染料或荧光探针 标记特异性检测目标，通过荧光 信号的累积和检测，实现对目标 序列的实时定量分析。
荧光定量PCR技术的原理
在PCR反应过程中，随着DNA 的合成，荧光染料或荧光探针与
DNA结合，产生荧光信号。
随着DNA的扩增，荧光信号也 相应增强，通过实时监测荧光信 号的变化，可以计算出目标序列
基因突变检测
总结词
荧光定量PCR技术可用于检测基因突变，通过对基因序列的变异进行分析，有助于遗传性疾病的诊断、药物疗效 评估和个性化治疗。
详细描述
荧光定量PCR能够高特异性地检测基因序列的变异，包括点突变、插入和缺失等。通过比较正常组织和病变组织 的基因突变差异，有助于了解疾病的发生和发展机制，为遗传性疾病的诊断和治疗提供依据。同时，基因突变检 测还可用于药物疗效评估和个性化治疗方案的制定。
齐全版(荧光PCR技术)ppt课件

齐全版(荧光PCR技术)ppt课件

实时荧光定量PCR技术
一、荧光定量 PCR仪
荧光定量PCR仪是一种 带有激发光源和荧光信 号检测系统的PCR仪， 通常配有电脑系统及相 应的分析软件。
与普通PCR的区别（一）
❖ 普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析。
❖ 实时定量PCR技术： 实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对 起始模板进行定量。
❖ MGB探针在检测SNP和定量分析甲基化等位 基因方面具有优势。
TaqMan MGB 探针法
❖ TaqMan MGB 探针能分辨一个碱基的差别
TaqMan MGB 探针法原理图示
❖ 优点：
❖ 1.NFQ为非荧光基团，大大降低测定中荧光的本底值，有提 高了淬灭效率。
❖ 2.MGB结合在探针与靶基因杂交形成的双螺旋的小沟中，促 进探针与靶基因杂交的稳定性和特异性，又使探针的Tm值 大大提高，从而使杂交温度的选择余地更大。
❖ 缺点：
❖ 1.合成TaqMan探针价格昂贵。（一条探针约3000~5000元 ）
❖ 2.中国地区仅有基康生物公司（ABI）提供合成服务，合成 时间长，周期需要1~2个月.
与TaqMan探针相比，MGB探针长度更短，淬灭效率更高。
案例分析
❖ 1.应用SYBR Green I 荧光实时定量PCR检测 成蚊携带的登革病毒。
实时荧光PCR的理论基础
❖ 荧光共振能量转移（FRET）：当一个荧光基 团与一个荧光淬灭基团（可以淬灭前者的发 射光谱）的距离邻近至一定范围时，就会发 生荧光能量转移，淬灭基因会吸收荧光基团 在激发光作用下的激发荧光，从而使其发不 出荧光。但如果荧光基团一旦与淬灭基团分 开，淬灭作用即会消失。所以，利用核酸杂 交和核酸水解所致荧光基团和淬灭基团结合 或分开的原理，建立各种实时荧光PCR。
荧光定量PCR操作规程(组织)

荧光定量PCR操作规程(组织)

附录1第一步：RNA的提取材料：灭菌过的枪头、匀浆器、EP管、去离子水；TRIzol Reagent、三氯甲烷、异丙醇、、无水乙醇、离心机。

步骤：1）将大约100mg组织加入研磨器，加入1ml的TRLzol Rengent研磨20-30min；直到看不到大块的组织。

2）将液体倒入灭菌后的EP管内，加三氯甲烷250 μl，上下颠倒充分混匀，静置5min，4℃离心，13000×g，10min。

3）取上清液500 μl于另一灭菌过的EP管内，加入等量的异丙醇，混匀后放入4℃的冰箱15min后取出，4℃离心，13000×g，10min；倾倒出上面的液体，留在管底的白色沉淀即为RNA。

5）加入75%的乙醇1ml，4℃离心，7500×g，5min。

6）将上面的液体倒出，只剩白色沉淀；再瞬时离心，尽量吸干管内的液体，晾干，再加入适量的去离子水加以溶解。

第二步逆转录准备材料：逆转录试剂盒（TOYOBO，日本）反应体系：5×RT Buffer 4 μldNTP 2 μlOliga(dT)20 1 μlRNase free H2O 1μlRnase inhibitor 1μlReverTra Ace 1μlRNA 10μl总体系20μl 反应条件：42℃20min95℃5min4℃5min第三步Real-time PCR材料：SYBR Green mix（TOYOBO公司，日本）、上下游引物、cDNA、ddH2O 步骤：1、反应体系SYBR Green mix 12.5μlPlus solution 2.5μl上游引物（10pmol/μl）1μl下游引物（10pmol/μl）1μlddH2O 5.5μlcDNA（10倍稀释） 2.5μl总体系25μl2、反应条件50℃2min；95℃2min95℃15s Array退火15s72℃45s72℃10min；3. 扩增程序图：。

荧光定量PCR技术原理及应用课件

荧光定量PCR技术原理及应用课件

详细描述
VS
荧光定量PCR技术在病原体检测和耐药基因研究中具有高灵敏度、高特异性和快速检测的优势，有助于及时诊断和治疗相关疾病。
详细描述
针对不同病原体，荧光定量PCR技术可以设计特异性引物和探针，实现对病毒、细菌、寄生虫等病原体的快速检测。同时，该技术还可以用于耐药基因的检测和研究，为抗生素的合理使用和疾病治疗提供科学依据。
总结词
荧光定量PCR技术在基因表达分析中具有重要作用，能够检测基因在不同条件下的表达水平，有助于深入了解基因的功能和调控机制。
详细描述
通过荧光定量PCR技术，可以设计特异引物，对目的基因进行扩增，并实时监测扩增过程中的荧光信号，从而计算出目的基因的起始拷贝数和相对表达量。这种方法广泛应用于基因表达谱分析、转录因子研究、药物筛选等领域。
荧光定量PCR技术原理及应用课件
荧光定量PCR技术概述 荧光定量PCR技术原理 荧光定量PCR技术的应用 荧光定量PCR技术的优缺点 荧光定量PCR技术的实验操作流程 荧光定量PCR技术的应用案例
contents
目 录
01
荧光定量PCR技术概述
荧光定量PCR技术的定义
荧光定量PCR技术是一种在PCR反应过程中，通过荧光染料或荧光探针标记特异性寡核苷酸，实时监测PCR产物量的变化，实现定性和定量分析的技术。
根据实验需求，准备PCR引物、探针、DNA模板等必要材料。
对采集的样品进行预处理，如DNA提取、纯化等，确保样品质量满足PCR扩增要求。
实验准备和样品处理
样品处理
实验材料准备
按照PCR反应体系的要求，将引物、探针、DNA模板等组分加入到反应液中。
反应液配制
确保反应液中的组分充分混匀，以保证PCR扩增的均匀性。
荧光定量PCR

荧光定量PCR

荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，简称qPCR）是一种分子生物学技术，用于精确测定样本中特定核酸序列的数量。

其基本原理基于PCR（聚合酶链式反应）技术和实时荧光检测，能够在PCR扩增过程中连续监测荧光信号的变化，从而实现对起始模板量的定量分析。

荧光定量PCR原理简述：1.PCR扩增：qPCR采用传统的PCR方法，包括变性（DNA双链解开成单链）、退火（引物与靶序列配对）和延伸（DNA聚合酶合成新链）这三个基本步骤，反复进行使得目标序列指数级扩增。

2.荧光标记与检测：SYBR Green法：SYBR Green是一种非特异性的双链DNA结合染料，在游离状态下几乎不发出荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光强度显著增强。

因此，随着PCR过程中的产物增加，荧光信号也相应增加，荧光强度与PCR产物的数量成正比。

TaqMan探针法：此方法更为特异，使用一种特殊的寡核苷酸探针，其两端分别标记了荧光报告基团和淬灭基团。

在PCR反应中，当探针与靶序列配对时，位于中间的探针被Taq 酶水解，导致荧光报告基团与淬灭基团分离，从而产生荧光信号。

只有当特定的扩增产物生成时才会释放荧光。

荧光定量PCR实验步骤概览：1.样品制备：RNA提取：从组织、细胞或其他生物样本中提取总RNA，常用TRIZOL或类似试剂进行裂解、离心分相和乙醇沉淀来纯化RNA。

cDNA合成：对于mRNA的定量，需要先将RNA逆转录为cDNA。

2.设计与合成引物：针对目标基因设计一对特异性的PCR引物，用于扩增目的片段。

3.PCR反应体系构建：将纯化的cDNA或DNA模板、特异性引物、Taq聚合酶、缓冲液、dNTPs和其他必要成分如SYBR Green染料或TaqMan探针等加入至PCR管中，配置成最终的PCR反应体系。

4.实时荧光PCR扩增与检测：在荧光定量PCR仪上进行PCR反应，仪器在每次循环的适当阶段收集荧光信号，并记录下来。

万字长文讲清荧光定量pcr

万字长文讲清荧光定量pcr

万字长文讲清荧光定量pcr荧光定量PCR（Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）是一种基于PCR技术的快速、高灵敏度和高特异性的DNA 定量方法。

它利用DNA扩增和荧光探针结合的原理，可以快速准确地定量目标DNA的含量。

荧光定量PCR主要分为两个步骤：扩增和检测。

在扩增步骤中，通过PCR反应使目标DNA被放大成大量的拷贝，并引入荧光标记的引物。

在检测步骤中，通过荧光探针与扩增产物结合，并测量荧光信号的强度，从而确定目标DNA的含量。

具体步骤如下：1. 反应体系的准备：根据实验需要，制备PCR反应液，包括引物、荧光探针、缓冲液、dNTPs、酶等。

2. DNA模板的准备：从待测样本中提取DNA，并进行纯化和浓缩。

3. PCR扩增反应：将DNA模板与引物和荧光探针加入PCR反应液中，进行PCR扩增反应。

PCR反应可以选择不同的温度程序，包括变性、退火和延伸等步骤。

4. 荧光信号检测：在PCR扩增反应过程中，荧光探针与目标DNA 结合形成双链结构，荧光信号被激发并发射。

荧光信号可以通过荧光实时定量PCR仪器进行检测和记录。

5. 数据分析：根据荧光信号的强度，可以计算目标DNA的含量。

通常，荧光信号的强度与目标DNA的初始浓度成正比。

荧光定量PCR的优势在于其高灵敏度、高特异性和高准确性。

由于荧光信号可以实时检测和记录，所以可以在PCR反应过程中实时监测目标DNA的含量变化。

此外，荧光定量PCR可以同时检测多个目标DNA，并且可以定量非常低浓度的DNA样本。

荧光定量PCR在生物医学研究、临床诊断、基因表达分析等领域得到了广泛的应用。

它可以用于检测病原体、基因表达水平、突变等，对于研究疾病的发生机制、筛选药物靶点、预测疾病进展等具有重要意义。

同时，荧光定量PCR也是一种常用的基因分型方法，可以用于DNA指纹鉴定、亲子鉴定等。

荧光定量PCR作为一种快速、高灵敏度和高特异性的DNA定量方法，已经成为生命科学研究和临床诊断的重要工具。

荧光定量PCR检测技术程序免费全文阅读

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兽医现所开展的检测项目
■ 禽流感病毒（ALV）荧光定量 PCR检测
■ 新城疫病毒（NDV）荧光定量 PCR检测
■ 蓝耳病病毒（PRRSV）荧光定 量PCR检测
普通PCR临床检测技术的缺点
普通PCR临床检测技术虽然解决了检 出率低 、周期长的问题 ，但由于假阳 性率高 ， 不能正确指导临床实践。
因此国家卫生部曾在1997年行文禁 止将普通PCR技术用于临床诊断。
FQ-PCR与普通PCR的区别
■
■ 1 、采用闭管检测 ，不需PCR后处理， 并采用dUTP-UNG酶的防污染系统 ，扩 增和检测一次同时完成 。不需开盖 ， 不 产生污染 ，避免了假阳性。
（三）选择引物
■ 探针选好之后 ，在探针的上下游分别选 择合适的引物序列 ， 引物应满足如下的 条件 : ■ 1 、在靶基因保守和无二级结构的区域；
■ 2 、与探针所在区域不重叠；
（三）选择引物
■ 3 、与靶基因其他区域配对较少； ■ 4 、G+C含量在40%以上； ■ 5 、相同碱基连续不超过4个；
FQ-PCR与普通PCR的区别
■ 2 、探针与被检DNA序列特异杂交， 增强了特异性。
■ A 、上下游引物和探针三道关卡控制其 特异性；
■ B 、引物和探针都比较长 ， 退火温度较 高 ， 非特异性扩增几率减少。
FQ-PCR与普通PCR的区别
3 、可定量结果 ，准确灵敏地反应了 病原体的感染和治疗恢复情况。
■ 是一种完全闭管式的PCR和荧光探针杂 交技术相结合的定量PCR方法。
■ PCR的高效扩增特性 ■ 核酸探针的高特异性
■ 光谱技术的高灵敏性和可计量性
实时荧光定量PCR
■ 定义
利用荧光信号对PCR反应的过程进行实时监控

荧光定量PCR


C(t) value
Threshold line
18.12 +/- 0.04
C(t) value
Ct值的重现性
纵 轴 ： 荧 光 信 号 量
横轴：PCR反映循环数
Ct值的特点：
相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；
Ct值极具重现性
CT
• 基线代表背景信号，一般前3～15循环所产生的信号 被背景掩盖，这些循环的荧光信号可用基线信号表示。 • 一般选定基线信号标准偏差的10倍作为荧光信号的阈 值，荧光信号到达阈值时的循环数为CT值，该值和初 始DNA模板数目的对数成反比。
Cycle number
Ck
104
Log模板起始浓度与Ct 值呈线性关系。
Lg of DNA concentration
★
荧光标记原理
非特异性荧光标记：SYBR Green
只与双链DNA结合后发光
信号强度与双链DNA分子数 目成正比 便宜、灵敏、使用便捷 对DNA模板没有选择性，容 易产生假阳性结果，对模板 纯度、PCR引物的特异性要 求很高
解链后不能结合发光
SYBR Green I染料法——问题点与关键点
问题点： 此如 也将 SYBR Green I与双链DNA进行结合后散发荧光，因
果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，
同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。
关键点： 设计合适引物，防止非特异性扩增！
SYBR Green I染料法——融解曲线
PCR扩增实际过程
PCR扩增的理论模式
PCR扩增为指数扩增，每一扩增周期后产物的量可以下式表达： Xn=Xn-1· (1+E) = Xn-2· (1+E)2=…= X0· (1+E)n 其中E表示扩增效率，指一条单链变成一条双链DNA分子的几率，通常0≤E≤1。 如果将1+E看成整体作为扩增效率，则其值为1-2。Xn表示在n个周期后PCR 产物的分子数量，Xn-1为n-1个周期后PCR产物的分子数量。 等式仅在限定的扩增周期数（通常为20或30）内成立。超过此周期数， 扩增过程即由指数扩增降低至稳定的扩增速率，最终达到平台，不再扩增.

荧光定量PCR

一、样品RNA的抽提1.匀浆将-80℃冻结的RNA提取样品迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状，向研钵中加入与样品匀浆量匹配的适量的RNAiso Plus，并将组织样粉末覆盖。

2.抽提室温放置5min，使核蛋白复合物完全溶解后转移至1.5mL无酶离心管中，室温静置5min，12000r/min，4℃离心15min；小心吸取上清液移入新离心管，加上清液的1/5体积量的氯仿，静置10min；12000 r/min，4℃离心10min。

（此时分三层：无色上清液、白色蛋白层、带颜色的下层有机相）；3.RNA沉淀吸取上清液移至新离心管，切勿吸入中间蛋白层，向上清液中加入与上清液等量体积的异丙醇。

颠倒混匀后室温静置10min，12000r/min，4℃离心5min （此时底部会出现沉淀）；4.RNA洗涤移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入1 ml的75%乙醇（用DEPC水或无酶无菌水配制，超净台中配制），清洗RNA沉淀。

混匀后，4℃下12000r/min离心5分钟。

5.RNA溶解吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

加入无RNA酶的水20-40μL用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

二、RNA浓度和质量的测定1. 1%-1.2%琼脂糖电泳检测RNA的完整性：将从肌肉中提取的总RNA吸取5μＬ，加入1μL 6 X Loading Buffer,混匀，点入1%琼脂糖凝胶点样孔中，120V电压电泳，经凝胶成像系统检测条带。

2. 核酸蛋白分析仪检测OD；吸取2μL的RNA检测OD260/OD280检测含量与纯度，A260／A280在1.9-2.1之间，说明提取的总ＲＮＡ质量很好，记录稀释后RNA的Conc值（浓度）。

三、实时定量引物实时定量引物根据NCBI公布的基因序列，依据实时定量引物设计原则，使用软件Primer5.0设计，管家基因引物引用参考文献所列，引物由上海生工有限公司合成。

荧光定量pcr

荧光定量pcr1、总RNA抽提（*头和离心管均经过湿热灭菌，无RNA酶）1）取匀浆器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上预冷。

2）取100mg组织，加入到匀浆器中。

3）充分研磨直至无可见组织块。

4）13000g离心10min取上清。

5）加入250 μl三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min。

6）4℃下13000g离心8min。

7）将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。

8）-20℃放置15min。

9）4℃下13000g离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。

10）吸除液体，加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。

11）4℃下13000g离心5min。

12）将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min。

13）加入20μl无RNA酶的水溶解RNA。

14）55℃孵育5min。

2、反转录（*头和PCR均经过湿热灭菌，无RNA酶）1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。

2）加入1μl oligo(dT)15。

3）用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。

4）于PCR仪上70℃保温5min，迅速置冰上冷却。

5）依次加入4μl 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反转录酶，用*抽吸混匀。

6）于PCR仪上42℃保温60min，结束后80℃保温5min灭活反转录酶。

3、定量PCR1）取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。

2× qPCR Mix 12.5μl7.5μM基因引物2.0μl反转录产物 2.5μlddH2O 8.0μl2）取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。

2×qPCR Mix 12.5μl7.5μM内参引物2.0μl反转录产物 2.5μlddH2O 8.0μl3）PCR扩增预变性 95℃，10min循环（40次） 95℃，15s→60℃，60s溶解曲线 75℃→95℃，每20s升温1℃4、结果处理ΔΔCT法：A=CT(目的基因，待测样本)- CT(内标基因，待测样本) B=CT(目的基因，对照样本)- CT(内标基因，对照样本) K=A-B表达倍数=2-K注意事项1、长度：15—30bp。

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08 年第一期螺旋课堂--“荧光定量 PCR 技术”
在介绍荧光阈值之前，先了解一下荧光本底信号（图 3），我们一般把荧光 PCR 的前 15 个循环信号作为荧光本底信号（baseline，基线期），即样本的荧光 背景值和阴性对照的荧光值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。荧光阈值 是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任 意位置上，荧光域值的缺省设置是 3～15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍 （机器自动设置）。我们在做荧光定量 PCR 实验时，经常采用手动设置，手动设 置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进 入指数期的最初阶段，真正的信号是荧光信号超过域值（图 4）。
图 2 终点法定量 PCR 的缺陷
理论上 PCR 是一个指数增长的过程，但是实际的 PCR 扩增曲线并不是标 准的指数曲线，而是 S 形曲线。这是因为随着 PCR 循环的增多，扩增规模迅速 增大，Taq 酶、dNTP、引物，甚至 DNA 模板等各种 PCR 要素逐渐不敷需求， PCR 的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的 Taq 酶都被饱和 以后，PCR 就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的 PCR 反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以， 即使是 96 次 PCR 重复实验，各种条件基本一致，所得结果有很大差异（图 2）。
图 3 荧光定量 PCR 扩增曲线示意图
荧光阈值
从图 3 可以很直观的看出，荧光定量 PCR 扩增曲线可以分成三个阶段：荧 光背景信号阶段（基线期），荧光信号指数扩增阶段（对数期）和平台期。在基 线期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而 在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR 的终产物量与起始模板量之 间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只 有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性 关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。 3．2 荧光阈值
1995 年美国 PE 公司成功研制了 TaqMan 技术，1996 年又推出了首台荧光 定量 PCR 检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，并使用 Ct 值进行分析， 荧光定量 PCR 才很快得到大家的接受，并广为应用。
近年来，荧光定量 PCR 技术不断完善，取得了突飞猛进的发展。由于其具 有操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等优点，而被广泛应用 于基础科学研究、药物研发、临床诊断、转基因研究、基因检测等各个领域研究 当中。
本文将分为三大部分向大家介绍，首先是理论篇：首先了解荧光定量 PCR 的理论知识，如荧光定量 PCR 技术的原理、方法等；随后为实践篇：如实验的 操作流程、注意事项、方法选择、结果分析与处理等；第三部分为问题分析与解 答篇：荧光定量 PCR 过程中有哪些常见问题，我们如何避免和解决。
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08 年第一期螺旋课堂--“荧光定量 PCR 技术”
2008 年螺旋课堂的课程计划！
2007 年已悄然逝去，2008 年已向我们扑面而来。08 年是共和国发展的关键 一年，也是螺旋网抓住机遇，加快发展的关键一年。今年螺旋网将为各位螺友提 供大量的关于生命科学的讨论主题，让各位螺友对生命科学的灵感相互碰撞，达 到共鸣。还有螺旋网将联合一批一线生命科学人员为您的研究保驾护航。同时还 将为大家提供各种资源包括各类电子书、生命科学研究进展、生物软件等。
前面也提到过，同一模板经过 96 次 PCR 扩增，扩增产物虽然不恒定，但 Ct 值极具重现性。根据这个特点，我们可以利用已知起始拷贝数的标准样品的 Ct 值做出标准曲线，只要在同一次 PCR 实验中得到未知样品的 Ct 值，就可以根 据曲线算出该未知样品的起始拷贝数。
接下来我们就来看看通过 Ct 值算出拷贝数的数学原理是怎样的： 首先我们来回顾一下PCR扩增原理（图 5），从PCR原理图中我们也可以很清
图 4 手工调整荧光阈值示意图
3．3 Ct 值 了解了荧光阈值的概念后，Ct 值就很好理解了。C 代表 Cycle，t 代表 threshold，
所谓 Ct 值就是在荧光 PCR 扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值 时所经过的扩增循环次数。如图 3 所示，黑色的线显示的是荧光阈值，当信号超 过黑色线时所经历的循环数即为 Ct 值。从这也可以了解到 Ct 值是可以变化的， 我们实验时带有一定的人为因素。而荧光定量 PCR 后面的数据处理要用到 Ct 值 来计算，所以有关荧光阈值的设置就显得尤为重要。一般说来，新手按荧光 PCR 仪的自动设置为好，而如果你非常有经验，一般会手动设置荧光阈值。因为 Ct 值即达到荧光阈值所经过的循环数，所以它就与模版的拷贝数存在着线性关系， 起始拷贝数越多，经过的循环数就越少，Ct 值也就越小，反之亦然。正常的 CT 值范围在 18-30 之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。
08 年第一期螺旋课堂--“荧光定量 PCR 技术”
论依据。 前面我们对荧光定量 PCR 的历史、荧光定量 PCR 概念和与常规 PCR 区别
有了大致的了解，但你可能心中存在许多疑惑：什么是扩增曲线？什么是 Ct 值？ 它们有什么特点？我们如何来判定荧光定量 PCR 反应中的 Ct 值，原理是什 么？。。。。。。
为了使大家更好的理解、掌握荧光定量 PCR 技术，在介绍荧光定量 PCR 检测方法、动力学原理和数据分析方法前，有必要先介绍几个最基本的概念。 3、荧光定量 PCR 的几个基本概念 3．1 扩增曲线
为了更好的理解荧光定量 PCR 原理，我将用样品扩增曲线来进行说明。描 述 PCR 动态进程的曲线即扩增曲线。PCR 的扩增曲线实际上并不是一条标准的 指数曲线，而是呈 S 型曲线（图 3）。图 3 中，X－轴表示 PCR 循环数，Y－轴 表示扩增反应的荧光值，与反应管中扩增产物的量有比例关系。
08 年第一期螺旋课堂--“荧光定量 PCR 技术”
第一章 理论篇
一、荧光定量 PCR 技术发展史
1993 年，日本 Higuchi 等人首次采用动态 PCR 方法和封闭式检测方式对 目的核酸数量进行定量分析，首次提出了荧光定量 PCR 技术的概念。当时他使 用了 EB（溴乙锭）作为荧光标记染料，采用一台经过改良的热循环仪，用 UV 射线照射样品然后通过 CCD 相机检测产生的荧光值，利用了 PCR 反应中的数 学函数关系，再结合加入标准品的方法，达到了对检测样品进行准确定量的目的， 但由于这种方法由于有着在实验仪器资金上巨大的耗费，一些非特异的 PCR 产 物同样能被检测到并包含在被测的荧光信号值总量之中而导致定量不准确等因 素，最终使这种实验技术在当时没能成为主流的实验技术。
为此，螺旋课堂 08 年的课程将围绕着最新的研究方法、研究进展进行课程 设置。具体安排如下：
第一期：荧光定量 PCR 技术 第二期：原位杂交技术 第三期：引物的设计原理及方法 第四期：BAC 库的构建技术 第五期：手把手教你进行序列分析 ..................... 除以上技术外，欢迎大家点播！ 以上讲座的具体时间详见论坛通知!
08 年第一期螺旋课堂--“荧光定量 PCR 技术”
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08 年第一期螺旋课堂--“荧光定量 PCR 技术”
楚的知道理想的PCR反应是以 2n次方增长的方式扩增，即： X=X0×2n 但由于 PCR 反应体系是一个有限的体系，也就是我们加入到 PCR 反应体系
中的物质是有限的，例如酶、引物、Buffer 等，只有在对数增长期时，PCR 的扩 增效率才等于 1，大部分时候扩增效率小于一，有时甚至等于零。因此 PCR 扩 增的真正情况是：
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08 年第一期螺旋课堂--“荧光定量 PCR 技术”
螺旋课堂第一课－－荧光定量 PCR 技术
Janson
PCR 技术的发明极大地推动了分子生物学的发展，而且迅速被推广和应用 到生命科学的各个领域，可以说它是目前核酸分子水平的基础及应用研究中使用 最广泛的一项技术。
X=X0 (1+Ex)n 其中 n：扩增反应的循环次数；X：第 n 次循环后的产物量 X0：初始模板量；Ex：扩增效率 在扩增产物达到阈值线时所经历的循环数为Ct个循环，此时的产物量为 XCt=X0 (1+Ex)Ct =M 其中XCt：荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量，在阈值线设定以后, 它是一个常数，我们设为M， 对方程式两边同时取对数得 logM=logX0 (1+Ex)Ct，我们对该方程式做简单 的数学运算后得到： log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M 其中 M 为常数，Ex 为常变数，也就是说 Ex 在 PCR 反应中的某一个循环中 是一个常数，但不同的循环数中，Ex 的数值会发生变化。因此从上式可以推出： Log 浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即 Ct 值就可计 算出样品中所含的模板量。
常规 PCR 的定量方法，测定的都是 PCR 的终产物，而不是起始 DNA 拷贝 数。由于 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系（图 2），所以不能根 据最终 PCR 产物的量直接计算出起始 DNA 拷贝数。虽然加入内标后，可部分 消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作 半定量、粗略定量的方法。