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细胞培养方法
细胞培养是生物学实验中常用的一种技术手段，它可以提供大量的细胞用于实验研究。
正确的细胞培养方法对于细胞的生长、增殖和实验结果的准确性都至关重要。
下面将介绍一些常用的细胞培养方法及注意事项。
首先，准备培养基。
培养基是细胞生长所必需的营养物质和生长因子的混合物。
常用的培养基有DMEM、RPMI-1640等，根据不同细胞类型的要求选择适当的培养基。
在制备培养基时，需要注意无菌操作，避免细菌和真菌的污染。
其次，处理细胞。
从细胞库中取出细胞后，需要进行细胞的处理和传代。
处理细胞时，要注意细胞的密度和活性，避免细胞凝集和死亡。
传代时，要根据细胞的生长状态和密度进行适当的稀释，以保证细胞的健康生长。
接着，进行细胞的接种和培养。
将处理好的细胞按照一定的比例接种到预先涂有培养基的培养皿中，然后将培养皿放入培养箱中进行培养。
在培养过程中，需要定期观察细胞的生长状态，及时更换培养基，避免细胞过度生长或死亡。
最后，进行实验。
当细胞达到所需的数量和状态后，就可以进行相关的实验。
在实验过程中，需要注意培养皿的无菌操作，避免细菌和真菌的污染。
同时，要注意细胞的处理和操作方法，避免对细胞造成损伤。
总之，正确的细胞培养方法对于细胞的生长和实验结果至关重要。
只有严格遵守操作规程，做好无菌操作，才能得到可靠的实验结果。
希望本文介绍的细胞培养方法能够对大家有所帮助。
细胞培养方法与步骤细胞培养是指将细胞从一个生物体中取出并在实验室中培养繁殖的过程。
细胞培养可用于各种实验研究，如细胞生物学、分子生物学、药物筛选等。
细胞培养的方法多种多样，下面将介绍常见的细胞培养方法及其步骤。
一、原代细胞培养方法原代细胞培养是指将从组织或器官中分离的细胞直接进行培养。
原代细胞培养是建立细胞株的重要步骤，一般需要一定的技术和设备。
步骤：1.组织分离：从动物或人体中取得组织，如肝脏、心脏等，并用生理盐水或细胞培养基洗刷组织的表面。
2.细胞分离：将组织切割成小块，并用胰蛋白酶或胰酶进行消化，使细胞分散。
3.细胞收集：用细胞培养基冲洗消化后的组织碎片，将细胞收集到离心管中。
4.离心：将离心管放入离心机中进行离心，分离出细胞沉淀。
5.细胞培养：将细胞沉淀重新悬浮在细胞培养基中，然后转移到培养皿中进行培养。
二、细胞株培养方法细胞株培养是指将原代细胞培养到一定数目并进行传代培养的过程。
步骤：1.细胞传代：细胞达到一定密度后，用胰蛋白酶或胰酶等对细胞进行消化，将细胞分离。
2.细胞计数：用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，得到细胞浓度。
3.细胞培养：将分散的细胞与新鲜的培养基混合，然后转移到培养皿中进行培养。
4.细胞增殖：培养皿中的细胞经过一段时间的培养，可以看到细胞开始增殖，形成细胞集落。
5.细胞传代：当细胞集落接近充满培养皿时，需进行细胞传代，即将细胞分散到新的培养皿中。
6.细胞冻存：当细胞达到所需数量后，可以进行细胞冻存，以备之后的使用。
三、细胞培养技术要点1.无菌操作：细胞培养需要在无菌条件下进行，避免细菌或真菌的污染。
操作前需做好洗手消毒，使用无菌操作台，并加入适量的抗生素或抗菌剂到培养基中。
2.培养液选择：根据不同细胞的需要，选择适合的培养基和生长因子，以提供细胞的生长所需的营养物质。
3.培养条件控制：温度、湿度、CO2浓度等因素对细胞生长有重要影响，需根据具体要求进行调节。
4.细胞检测：在细胞培养过程中，需要定期观察和检测细胞的形态、生长情况、细胞浓度等指标，以确保细胞的正常生长和状态。
动物细胞培养的条件与方法动物细胞培养是生物科学研究中重要的一部分，可以为细胞生物学、分子生物学和生物医学研究提供重要的实验材料和平台。
在动物细胞培养过程中，为了保证细胞的生长和繁殖，需要创造适宜的条件和选择合适的方法。
本文将介绍动物细胞培养的条件和方法，并探讨其在生物科学研究中的应用。
一、细胞培养的条件1. 培养基培养基是细胞培养中必不可少的基础物质，它提供了细胞所需的养分和生长因子。
常用的细胞培养基包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）、RPMI（Roswell Park Memorial Institute）、MEM （Minimum Essential Medium）等。
这些培养基中含有适宜的氨基酸、糖类、维生素、微量元素等成分，能够满足细胞正常的生长和代谢需求。
2. pH值和温度细胞培养的过程中，pH值和温度的控制非常重要。
一般来说，细胞培养的pH值范围为7.2-7.4，温度常在37摄氏度左右。
过高或过低的pH值或温度都可能导致细胞受损或死亡。
3. CO2浓度大部分哺乳动物细胞需要适量的CO2浓度来维持其生长和代谢的平衡。
一般情况下，细胞培养使用的培养箱或培养器会控制CO2浓度在5%左右。
CO2的存在可以帮助维持培养基的酸碱平衡，有利于细胞的正常生长。
4. 营养物质和血清除了基础培养基外，细胞培养中的营养物质和血清也是细胞正常生长所必需的。
营养物质主要包括氨基酸、葡萄糖、维生素等，而血清则是提供生长因子和其他重要成分的来源。
细胞培养中常用的血清包括胎牛血清（FBS）和新生牛血清（NBS）等。
二、细胞培养的方法1. 传代培养传代培养是细胞培养中常用的方法之一，可以使细胞持续增殖。
具体步骤包括将细胞从原培养瓶中解离并收集，然后经过计数后按照一定比例重新接种到新的培养瓶中。
传代培养的频率取决于细胞的生长速度和需求。
2. 凝胶培养凝胶培养是一种将细胞培养在凝胶基质中的方法。
36细胞培养旳过程及注意事项细胞旳培养过程及注意事项；根据培养过程中与否需要分割培养物进行再培养而将细；一、原代培养；（一）过程；原代培养旳基本过程包括取材、培养材料旳制备、接种；1.组织块培养法；(1)基本操作过程；1）、用培养液湿润所取组织材料, 并用锋利旳眼科剪；2）、用湿润旳吸管吸取切碎旳组织块, 清清吹到培养；3）、将培养瓶翻转, 使瓶底朝上, 在种植了组织块一；4）、将种植了组织块细胞旳培养过程及注意事项根据培养过程中与否需要分割培养物进行再培养而将细胞培养分为原代培养和传代培养。
一、原代培养（一）过程原代培养旳基本过程包括取材、培养材料旳制备、接种及培养等环节。
原代培养旳措施诸多, 基本和最常用旳是组织块培养法和分离细胞法。
1.组织块培养法(1)基本操作过程1）、用培养液湿润所取组织材料, 并用锋利旳眼科剪将附在其上旳脂肪和结缔组织清除洁净。
再用平衡液（PBS）或Hanks液漂洗；用锋利旳眼科弯剪将组织块剪成小块；再用PBS或Hanks液漂洗多次, 直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止。
2）、用湿润旳吸管吸取切碎旳组织块, 清清吹到培养瓶皿中, 并将其按一定间距均匀放在培养瓶底壁上, 量不要过多, 要将组织块切面贴在培养瓶底壁上；3）、将培养瓶翻转, 使瓶底朝上, 在种植了组织块一侧旳对侧面加足培养液, 勿使组织块与培养液接触, 塞紧瓶塞；4）、将种植了组织块旳一侧朝上, 静置于37℃培养箱中；待组织块贴壁1 h到3h后翻瓶, 使贴壁旳组织块浸没与培养液中, 静置；5）、每隔2到3天更换一次培养液, 或者根据培养瓶种颜色旳变化确定换液时间。
2.注意事项1）、组织块接种后旳前3天, 从组织块向外迁徙旳细胞数很少, 组织块旳黏附不牢固, 在观测和移动旳过程中, 注意不要引起液体旳振荡。
要防止常常翻动和振动, 否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。
2）、加入旳培养液不适宜过多, 防止浸泡旳组织块受轻微旳波动而脱落下来。
细胞培养的方法与注意事项细胞培养是将动物某一器官、组织如肝脏、肺、肾脏等取出，将其分散成单个细胞，在人工条件下，使之存活、生长和增殖的技术。
细胞培养可分为原代培养和传代培养。
原代培养：第一次培养，将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物，不更换培养物的生长器皿的培养过程。
传代培养：在培养过程中培养物分裂生长，长满培养空间，细胞之间相互接触而发生接触抑制，生长速度减慢甚至停止。
在这种情况下，需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿中，再进行培养一、原代培养的方法：1、取材对于水产动物，取材的方法为：无脊椎动物取材用消毒海水或淡水暂养24小时；用酒精棉消毒体表；解剖需培养的组织和器官，放到消毒液中处理一段时间；取出，用灭菌BSS清洗3次鱼的取材用酒精棉消毒体表；打开腹腔（注意不能碰破肠道）；体表组织，处理方法同无脊椎动物。
原代培养过程技术路线图：①准备工作：实验台面用紫外灯照、70%酒精棉球擦；所用各种器械、培养液无菌；操作者用新洁尔灭和酒精擦手，穿衣、戴帽、口罩；实验动物体表用酒精消毒或放入无菌海水中。
②取材：在无菌条件下取出需要培养的器官或组织；如果是有菌的器官或组织需进行灭菌处理；取材要准确③培养材料的制备：欲培养的器官或组织洗去血污，剔掉多余成分。
剪成1mm3大小，用于外置块培养。
用胰蛋白酶消化，终止消化后，机械法吹打组织块，筛网过滤，过滤液离心1000rpm,10min，用培养液悬浮细胞，计数细胞密度，用于细胞培养。
④接种：外植块：用吸管将小的组织块均等地在培养瓶底排列好；反过培养瓶加入培养基，或5-6h后再加培养基；放入CO2培养箱培养；2-3d更换培养液或颜色变黄时更换；记录、每2-3d观察。
结果：1-3d，细胞从外植块中迁移出来分离细胞：将已分散的细胞悬液加到培养瓶或培养板中，并加少量培养液,细胞浓度为105-106个/ml。
不能少于5000个。
24h后加足培养液（防漂浮）。
一、培养细胞常用配置培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml冻存液的配置：10 % DMSO + 90%胎牛血清依次比例酌量配置。
超净工作台常规配置移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个，常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，冻存管所需试剂：培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，75%酒精……实验前准备：所需的各项高压后的耗材及污物缸放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。
培养基及胰酶恢复常温后使用，可37℃水浴5-10min二、细胞复苏步骤：1. 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。
2. 培养液（DMEM），恒温水浴箱37℃预热20min，备用。
超净台内准备一支15ml离心管备用。
3.将所需的培养基确保瓶身干净后酒精消毒放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后需再次分别消毒瓶口和瓶盖。
4. 从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴中，快速摇晃，直至冻存液融化至黄豆粒大小后迅速取出。
5. 将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。
6. 取出2个培养皿并做好标记（复苏日期等），提前加入5-10ml培养液；离心结束后用1ml培养液悬液混悬沉淀细胞后分别加入培养皿内。
7. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。
8. 将培养瓶放入培养箱内培养注意事项：1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套。
此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。
常用的细胞培养方法、污染及污染处理一、本文概述细胞培养是生物学和医学领域中一种重要的实验技术，广泛应用于基础研究和实际应用。
通过模拟细胞在体内生长的环境，细胞在体外得以繁殖、分化并维持其特定功能。
本文旨在概述常用的细胞培养方法，包括培养基的选择、细胞传代、细胞冻存与复苏等，同时探讨细胞培养过程中可能出现的污染问题，包括细菌、真菌和支原体等微生物污染，以及污染的检测和处理方法。
通过本文的阐述，读者可以对细胞培养的基本流程和污染防控有更为全面的了解，为实验操作提供指导和参考。
二、常用的细胞培养方法细胞培养是生物学和医学研究中的核心技术，用于模拟体内环境，研究细胞生长、分化和功能。
以下是几种常用的细胞培养方法：贴壁培养法：这是最常见的细胞培养方法。
细胞在培养瓶或培养板的表面上贴壁生长，形成单层细胞。
这种方法适用于大多数哺乳动物细胞系。
悬浮培养法：某些细胞，如血液细胞、肿瘤细胞和某些干细胞，可以在液体培养基中悬浮生长。
这种方法不需要细胞贴壁，可以方便地扩大细胞数量。
微载体培养法：微载体是一种微小的、可以悬浮在培养基中的颗粒，通常用于大规模细胞培养。
细胞可以在微载体的表面上贴壁生长，从而增加细胞与培养基的接触面积，提高细胞生长效率。
三维培养法：这种方法模拟体内组织的三维结构，使用支架或凝胶等基质支持细胞生长。
它有助于研究细胞间的相互作用和组织的形成。
共培养法：将不同类型的细胞放在同一个培养环境中进行培养，以模拟体内细胞间的相互作用。
例如，将内皮细胞和肿瘤细胞共培养，可以研究肿瘤血管生成的过程。
在进行细胞培养时，需要选择适合细胞类型和实验目的的培养方法，同时严格控制培养条件，包括温度、湿度、pH值、营养成分等，以确保细胞的正常生长和繁殖。
三、细胞培养污染及其影响在细胞培养过程中，污染是一个常见且严重的问题，可能对细胞生长、实验结果和细胞治疗产生负面影响。
污染主要来源于微生物，包括细菌、真菌、支原体和病毒等。
raw细胞培养方法细胞培养是生物学研究中常用的实验技术，它允许研究人员在控制条件下观察和研究细胞的生长、增殖、分化以及与环境之间的相互作用。
在细胞培养中，raw细胞是常用的细胞系之一。
本文将介绍raw细胞培养的方法，包括准备培养基和培养器具、细胞的分离和传代，以及培养条件的控制等。
一、准备培养基和培养器具1.1 选择适合raw细胞培养的细胞培养基。
在raw细胞培养中，常用的培养基包括DMEM（Dulbecco最小培养基）、RPMI 1640（Roswell Park细胞文化基）、FBS（胎牛血清）等。
根据实验需求，可以添加适量的抗生素如青霉素和链霉素等来防止细菌污染。
1.2 准备培养器具。
培养器具包括培养皿、培养瓶、离心管、培养箱等。
这些器具必须经过高温高压灭菌处理，以确保无菌状态。
二、细胞的分离和传代2.1 准备细胞原料。
选择合适的动物（如小鼠）进行实验，将其牺牲并收集组织样本（如脾脏、肾脏等）。
将组织样本放入含有消化酶（如胰蛋白酶）和酶解缓冲液（如PBS）的离心管中，进行组织分离。
2.2 细胞的分离。
将组织分离液通过过滤网筛除多余的细胞块和组织残渣。
再利用无菌注射器将细胞分离液吸入离心管中，在低速离心下将细胞沉淀。
2.3 细胞的传代。
通过显微镜观察细胞密度和活力，根据需求调整培养基中细胞的密度。
将细胞悬液分装到新的培养器具中，添加新鲜的培养基，进而使细胞继续增殖生长。
三、培养条件的控制3.1 培养温度和湿度的控制。
对于raw细胞的培养，通常在37摄氏度和5%二氧化碳气氛下进行。
可以通过培养箱、CO2孵化器等仪器设备来控制培养温度和湿度。
3.2 培养基的更换和补充。
细胞在培养基中不断耗用营养物质，同时释放代谢产物。
为了保证细胞的生长和增殖，必须定期更换培养基，并添加适量的胎牛血清、细胞因子等营养物质。
3.3 细胞的监测和形态观察。
在培养过程中，需要对细胞的形态和状态进行监测。
利用显微镜观察细胞的形状、大小、颜色等变化，及时评估细胞的健康状况。
2007-10-03 | 软琼脂集落形成率实验(软琼脂克隆)将1.2％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合制备0.6％的底层琼脂，6 孔板中每个孔1.4ml 温室凝固，取对数期细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，计数，并调细胞浓度为10000 个/ml，将0.6％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合，制备0.3％的上层琼脂，每孔加1ml 上层琼脂和100ul 单细胞悬液（约1000cell/well)，混匀，室温凝固。
置于37℃，5％CO2 的细胞培养箱中培养2－3 周，计数含50 个细胞以上得克隆，计算细胞集落形成率，SpotII 采集图像。
2007-10-03 | MTT检测细胞增殖及见解细胞以每孔3000个接种至96孔板，分成不同组，每组3孔，利用含有10％胎牛血清的DMEM培养液培养24 h之后，向培养液中加入一定工作浓度的药物（单体或混合物），继续培养24 h或48h。
培养结束，直接向每孔加入5mg/ml的MTT 10μl，孵育2－4小时（应常在显微镜下观察）。
去除培养液，每孔加入DMSO 100μl，充分振荡3分钟，立即在酶标仪上测定490nm的吸光度值。
由于这种方法基于琥珀酸脱氢酶的活性，因而加入MTT之后应该在显微镜下观察，药物是否可以改变细胞琥珀酸脱氢酶的活性。
若是改变则不可以使用此种方法。
另有根据细胞ATP含量测定细胞增殖的方法，但是都要考虑药物对细胞ATP是否有影响。
所以测定细胞增殖，最简单，最原始，最麻烦的方法，进行细胞计数我们感觉还是最好的方法。
细胞培养方法哺乳动物细胞培养规则：1，严格按照细胞培养室规则进行哺乳动物细胞，由于细胞为整合生物中心共用，使用紧张，在使用时尽可能提高速度，保证操作规范。
2，使用细胞间之后，主动将安全柜台面和桌面等清理整齐干净。
3，在自己培养细胞出现污染之时，及时通报同一培养箱培养细胞者，并将培养相关细胞的培养液/PBS/胰酶等全部清出细胞培养室，以减轻对细胞培养的影响。
4，实验所用细胞培养原则要求：A，细胞复苏之后两代开始使用；B，保证细胞每次传代前密度不超过90%；C，细胞使用最多12代（约2个月）。
5，最好每天观察细胞生长状态，若有异常及时处理。
6，具体参照中细胞培养要求。
细胞传代方法1，将长至80-90%细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
2，加入0.5—1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。
3，瓶口用瓶盖盖好，放在倒置镜下观察细胞。
随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入适当体积的培养液终止消化。
观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。
一般室温消化时间约为1—3分钟。
根据不同细胞而异。
4，用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，尽可能的避免气泡产生，分到另外两到三瓶中，置37℃下继续培养。
第二天观察贴壁生长情况。
5，细胞培养液参照，一般含有10%胎牛或小牛血清。
96/24孔板传代：1，前同于普通细胞传代方法。
2，细胞吹打均匀后，对细胞进行计数，根据需要调至适当浓度。
例如：每孔传代10000个细胞，可以将细胞调至浓度十万，之后利用排枪，吸取100ul，至96孔板中。
3，24孔板，采用1ml移液器进行传代。
细胞冻存方法1，预先配制冻存液：含90%FBS，10%DMSO的冻存液，DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞；2，取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1×106～5 ×106细胞/ml)；3，加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称/冷冻日期/操作者。
4，放于程序降温盒，之后在-80℃冰箱过夜。
5，将程序降温盒中细胞放于液氮保存。
6，要保证冻存细胞数量。
细胞复苏方法1，从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38 ℃水浴中，不断摇动使其融化（1分钟左右）；2，尽快用培养液稀释至原体积的10倍以上；3，低速离心10分钟，1000转；4，去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。
5，尽快对复苏细胞进行换液。
6，扩大培养后，再冻存至少复苏数量的细胞，以保证细胞库的完整。
细胞计数1、将血球计数板及盖片用双蒸水擦试干净，并将盖片盖在计数板上。
2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。
3、静置3分钟。
4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。
然后按下式计算：细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×10000实验前准备下列物品：双蒸水瓶子（500ml、250ml），离心管，tip头，Eppendorf管，滤纸，餐巾纸，微量加样器20-50µl。
具体实验步骤如下：细胞总蛋白的提取利用RIPA细胞裂解液，提取经处理细胞的总蛋白，根据RIPA试剂盒提取步骤如下：1，收集细胞，加入300µlRIPA和3µlPMSF（不可以预先加入PMSF），利用枪头吹打，放置于冰上30min2，将样品于4℃、30min、20000g离心3，小心将上清液转移到新的离心管中，分装成每管25µl，于－70℃保存4，两份5µl的细胞裂解液，稀释10倍之后，利用BCA法测定蛋白质浓度。
利用BCA－100蛋白质定量测定试剂盒（购自上海申能博采生物科技有限公司）测定蛋白质浓度，步骤如下1，SolutionA and SolutionB混合液（根据需要确定混和量，A：B＝50：1）A，绘制标准曲线和加样，如下表3－4：B, 将上述加好的样品放于酶标板C，将酶标板放于37℃摇床放置30minD，取出酶标板，利用酶标仪测定其OD570E，绘制标准曲线，如图：3－1E，根据标准曲线测定样品的浓度。
F，稀释之后样品浓度测定值如下表3－5：配制SDS－PAGE胶将垂直电泳用玻璃，先用自来水冲洗多次，之后利用蒸馏水冲洗干净，放置于烘箱中烤干，将玻璃放置在制胶架上，根据上述PAGE胶的配置方法配制分离胶，之后将配制胶灌于两个玻璃之间至距梳齿0.5cm或距玻板1.5cm处标记(胶会收缩)。
加入一层异丁醇厚约1cm，置30-45min,两者之间会出现一条明显的界线，量分离胶的宽度，倒出，冲洗（1×Tris/SDS，PH8.8）未聚合的丙烯酰胺，滤纸（普通）吸干（带手套，Whatman3mm滤纸）。
加入积层胶，插梳子，置30-45min，拔梳子，冲洗（蒸馏水）未聚合的丙烯酰胺，把凝胶固定于电泳装置，加入1×电泳缓冲液，排出凝胶底部两玻板间的气泡（注射器弯90℃），不要预电泳，以免破坏缓冲系统的不连续性。
加样（冰上）加样缓冲液用前加50µl β-巯基乙醇至950µl sample buffer（5µl-95µl，10µl-190µl，15µl-285µl，20µl-380µl），sample buffer稀释样品（100µg总蛋白，至少30µg）至少1：2，总体积<25µl（30-45µl），约20µl（可用水试验一下），100℃5min,冲洗加样孔，加样，注意加样均匀，水冲洗枪头于餐巾纸。
最外侧加等量样品缓冲液，避免边缘效应，或MARK （预染蛋白质marker）加样孔。
电泳和取胶正负极正确连接，80v，90-120min(1h)，电泳至溴酚蓝到达凝胶底部为止；关闭电源，带手套（防止油脂阻碍蛋白转膜）将胶取出放于一吸水纸上，备盒子，转移液多一点，撬玻璃，浸湿一下，刮下最左边的两个加样齿做标记，玻璃作尺子，切积层胶，垫片挑下，转移缓冲液，摇30min。
电转（带手套，油脂阻碍蛋白转膜）利用电转缓冲液浸泡滤纸15min，并利用甲醛浸泡PVDF膜5min，再用电转缓冲液浸泡PVDF 膜10min，之后按照大滤纸-膜-胶-纸(试管赶气泡)放置于电转设置，于冰中电转，350mA，120min，看电流，取膜，切硝酸纤维膜的右上角标记（参考分子克隆红皮P366）此步之后可以利用丽春红染液检测转膜效果，并记录蛋白Marker的位置，确定电转效果。
然后再利用蒸馏水洗涤多次，可以将丽春红染液洗掉，继续进行下面实验。
封闭将膜浸于封闭液（含有5％脱脂奶粉，0.1％（v/v）的PBS－T或者TBS－T）中，在水平脱色摇床上，室温2.5h。
之后快速利用wash buffer洗涤一次15min,再洗两次各5min。
加入一抗首先按要求将一抗利用PBS－T或TBS－T稀释，将PVDF膜放于杂交袋中，按0.1ml/cm2比例加入一抗稀释液，放于4℃冰箱过夜；之后浸于Wash buffer，按照>4ml/cm2室温洗涤一次15min，之后利用新鲜的Wash buffer2×5min洗涤。
加入二抗将二抗按照要求进行稀释于PBS－T或TBS－T中，室温将膜浸于二抗，放于脱色摇床2.5h，之后和步骤8一样洗涤。
染色将kit中的solution1和solution2等体积混和，之后按照0.125/cm2等体积覆盖于膜上（蛋白面向上，膜放于平面上），室温放置1min，将膜利用镊子赶走多余的detecton reagent显影将膜蛋白面向上，放于X－ray Film cassette,在暗室中将film放于膜上，盖上cassette，5分钟。
快速冲洗,之后放于第二个film，放置10min.将冲洗的胶片放于室温凉干。
2007-09-29 | 定量PCR技术思考定量PCR现在已经是一种常规的生物学实验技术手段，俺也有相当一段时间采用这种技术来分析基因的表达。
现将此技术与大家分享。
其实我认为定量PCR最常用的是相对定量，其实和我们以前的半定量PCR一样，只是此技术的升级版本。
定量PCR最大的麻烦是特异性和污染问题。
特异性主要当然是引物的设计，所以我主张：首先采用别人发表的引物为佳。
当然采用的paper的级别要高点为好，例如PNAS以上等，这样的可信度高。
其次就是自己设计，设计的原则在takara的定量PCR宣传册已经非常的详细，但是一般来说很难能够达到完全符合要求。
这样最好设计两对以上的引物，进行定量PCR。
定量PCR是要看溶解曲线的，而且要关心溶解曲线峰的宽度，但是这个不是很准确，从严格的角度来说，还要在定量PCR之后，将产物进行电泳检测，看是否特异。
若是特异才可以采用这种方法。
再次，内参我认为至少应该采用两个，因为现在发现很多的药物等可以改变beta－actin的表达。
最后，做此实验时，一定要独立重复，而不是复孔进行实验。
此实验一定要严格带手套进行，以防污染，一旦污染整个实验便没有意义，即使只是一点点污染。
