诺唯赞反转录试剂盒 说明书

Code No. RR047A 研究用PrimeScript™RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书目录内容页码●制品说明1●制品内容 1 ●试剂盒外必备材料 1 ●保存 1 ●特长 2 ●使用注意 2 ●操作方法 2 ● Real Time PCR 4 ●实验例 6 ●附录7 ●关联产品8●制品说明为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有cDNA作为模板检出的先决条件，但Total RNA中常常混有基因组DNA，并可以直接作为PCR反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。

为了避免这种情况发生，通常将检测用引物设计在内含子前后的外显子上，使基因组DNA得不到扩增。

但是，此方法不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因，同时当基因组上有伪基因存在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本方法。

在这种情况下，我们常常需要对Total RNA样品进行DNase I处理，以除去残存的基因组DNA。

而DNase I处理通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成RNA的降解和损失。

PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser是可以除去基因组DNA进行Real Time RT-PCR反应的专用反转录试剂。

Kit中使用了具有较强DNA分解活性的gDNA Eraser，通过42℃，2 min即可除去基因组DNA。

同时由于反转录试剂中含有抑制DNA分解酶活性的组分，经过gDNA Eraser处理后的样品可以直接进行15 min的反转录反应合成cDNA，因此，20 min内即可迅速完成从基因组DNA去除到cDNA合成的全过程。

使用本制品合成的cDNA适用于SYBR® Green分析法和TaqMan®探针分析法，可以根据实验目的，选择与SYBR Premix Ex Taq™ II（Tli RNaseH Plus）（Code No. RR820Q/A/B）、Probe qPCR Mix（Code No. RR391S/A/B）组合使用。

诺唯赞C112说明书
非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒
产品优势：
•简单、快速、高效，适用于任何载体
•无需考虑插入片段携带的酶切位点
•可高效克隆 50 bp-10 kb 的 DNA 片段
•线性化克隆载体和 PCR 产物可不纯化直接克隆
•无连接酶，无自连，阳性率 >95%
•提供在线引物设计软件CE Design
产品描述：
ClonExpress®技术是一种简单、快速并且高效的 DNA 无缝克隆技术，可将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点。

ClonExpress®II 是新一代重组克隆试剂盒，包含增强的重组酶 Exnase®II。

使用任意方式将载体进行线性化；在插入片段正 / 反向 PCR 引物5’ 端引入线性化载体的末端序列，使得 PCR 产物5’ 和3’ 最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列 (15 bp-20 bp)。

这种两端带有载体末端序列的 PCR 产物和线性化载体按一定比例混合后，在Exnase®II 重组酶的催化下，仅需反应 30 min 即可进行转化，完成定向克隆，阳性率可达 95% 以上。

实验案例：
1.克隆效率高
图1
重组产物转化后平板上一般可形成数千个单克隆，而无插入片段的阴性对照反应转化后只有数个单克隆形成。

因此ClonExpress®系统的自连背景会大大降低连接酶依赖的克隆方式。

2.克隆阳性率95%以上
图2
鉴定酶切结果表明，克隆阳性率可达95%以上。

贮存条件：
- 30℃～-15℃保存。

山东农业大学学报(自然科学版),2021,52(2):163-167VOL.52NO.22021 Journal of Shandong Agricultural University(Natural Science Edition)doi:10.3969/j.issn.1000-2324.2021.02.001本氏烟NbHSP90基因的克隆及初步功能分析杨磊1,盛慧2,张金凤2,田辉2,张修国2*,孙文秀1*1.长江大学生命科学学院,湖北荆州4340252.山东农业大学植物保护学院,山东泰安271018摘要:辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）通过与植物互作调节植物的免疫反应，进而引起植物感病。

前期实验证明辣椒疫霉效应分子RxLR19781与本氏烟（Nicotiana benthamiana）热激蛋白90（NbHSP90）可以发生相互作用。

利用RT-PCR技术从本氏烟中克隆得到基因NbHSP90，通过农杆菌介导的瞬时表达技术，验证NbHSP90在辣椒疫霉侵染本氏烟过程中的作用。

研究结果表明：NbHSP90基因的cDNA序列全长1005bp，编码含334个氨基酸的蛋白质，不含信号肽，无跨膜结构，具有典型的HATPase保守结构域和C端基序MEEVD。

瞬时表达结果表明，NbHSP90能显著减弱辣椒疫霉在本氏烟中的定殖。

研究结果为进一步阐明辣椒疫霉效应分子RxLR19781靶向本氏烟HSP90促进自身侵染的分子机制提供了依据。

关键词:辣椒疫霉菌;本氏烟;基因克隆中图法分类号:R379文献标识码:A文章编号:1000-2324(2021)02-0163-05 Cloning and Primary Functional Analysis of NbHSP90Gene from Nicotiana benthamianaYANG Lei1,SHENG Hui2,ZHANG Jin-feng2,TIAN Hui2,ZHANG Xiu-guo2*, SUN Wen-xiu1*1.College of Life Science/Yangtze University,Jingzhou434025,China2.College of Plant Protection/Shandong Agricultural University,Tai’an271018,ChinaAbstract:Phytophthora capsici pathogen interacts with plant to manipulate plant immune responses and promote infection.Previous experiments demonstrated that the effector RxLR19781of P.capsici could interact with heat shock protein90(NbHSP90)of Nicotiana benthamiana.NbHSP90was cloned from N.benthamiana by RT-PCR.NbHSP90of transient expression mediated by Agrobacterium on N.benthamiana to explore the role of NbHSP90in the pathogenesis of P.capsici.The results showed that the full-length cDNA of NbHSP90was1005bp,encoding a protein with334amino acids,no signal peptide,no transmembrane structure,with typical conserved HA TPase domain and C-terminal MEEVD motif.The results of transient expression illustrated that NbHSP90could significantly reduce the colonization of P.capsici on N.benthamiana.The results provide a basis for further elucidating the molecular mechanism of RxLR 19781targeting HSP90to promote infection.Keywords:Phytophthora capsici;Nicotiana benthamiana;gene cloning疫霉菌属于卵菌，是危害大豆、番茄、辣椒等经济作物的毁灭性病原菌。

使用说明书Version 22.101/产品概述 02/产品组分03/保存条件04/适用范围05/自备材料06/注意事项07/实验原理与流程概要08/实验流程08-1/线性化载体制备08-2/插入片段获得08-3/线性化载体与插入片段的使用量08-4/重组反应08-5/重组产物转化08-6/重组产物鉴定09/常见问题与解决方案.....................................................................................................02 .................................................................................................... 02.................................................................................................... 02..................................................................................................... 02.................................................................................................... 02.................................................................................................... 03.................................................................................. 04.................................................................................................... 04.. (04) (04) (06) (07) (07) (07).................................................................................. 09目 录 Contents*所有商标均属于各自商标所有者的财产。

b、按以下条件进行PCR反应94℃3m i n94℃30s25-35循环***37℃-65℃**30s72℃****45s-7min72℃5min注：*RT产物可增加至5μl 。

**退火温度根据引物Tm值调整，一般为Tm-5℃。

Control引物退火温度为55℃。

*** 当实验样品RNA特别稀少时，可将循环数增加至40-45循环。

**** 延伸时间根据PCR产物大小确定，一般1kb/min 。

Control引物延伸时间45s。

c、反应结束后，取3-5 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR反应产物。

如果此PCR产物需用于以后实验，应将PCR产物冷冻保存。

RNA control反应时，退火温度55度，30个循环，扩增片段大小为500bp。

使用提示1. RNA模板可以采用总RNA或mRNA，建议使用Biozol(BSC51M1)制备高质量RNA；2. RT实验应避免RNase污染，可采用以下措施：1）因人的皮肤表面和唾液都有RNase，因此实验中应戴一次性手套和口罩；2） RT实验应使用专门的仪器和耗材，建议在专门区域操作RNA；3） RT实验相关耗材应使用干热灭菌（180℃，60分钟）或用0.1％ DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12小时后在121℃高压灭菌30分钟；3. AMV逆转录酶，DNA聚合酶和RNase抑制剂在取用之前应离心后再吸取，吸取时动作要慢，使用后应尽快放回-20℃；4. dNTP应避免反复冻融以免失效；5. 引物的选择可根据具体情况，Oligo-dT适用于具有PolyA尾的RNA(一般是真核生物的mRNA)，Random Hexamer Primer适用于所有RNA(包括mRNA,rRNA,tRNA等)，尤其适用于有复杂二级结构的RNA，特异性引物适用于已知模板序列的RNA；6. PCR反应中MgCl2浓度可依据不同条件进行调整，当目的片段长度大于2kb时，我们建议增加MgCl2浓度，以0.5mM间隔梯度增加。

使用说明书Version 20.1目 录 Contents *所有商标均属于各自商标所有者的财产,某些商标并未在全部行政区注册01/产品概述 02/产品组分03/保存条件04/适用范围05/自备材料06/注意事项07/实验原理与流程概要08/实验流程 08-1/样本处理 08-2/RNA 提取09/常见问题及解决方案................................................................................................... 02................................................................................................... 02................................................................................................... 03................................................................................................... 03................................................................................................... 03 (03) (04) (04) (04) (05) (06)01/ 0201/产品概述本试剂盒适用于植物组织，特别是富含多糖多酚或淀粉的植物组织（如棉花叶片、成熟水稻叶片、松针、杨树、枇杷叶片、马铃薯块茎、棉叶根、香蕉、葡萄、苹果、梨、月季、荞麦种子、拟南芥种子、烟草等）中快速提取总RNA ，可同时处理大量不同样品。

使用试剂盒时所有的试剂要放置在冰上转录反应步骤和孵育1.解冻冷冻的试剂把RNA聚合酶混合物放置在冰上，它在甘油中保存，没有被保存在-20。

vortex10×reaction buffer和2×NTP/CAP至完全溶解，一旦解冻，反应过程中把2×NTP/CAP 放在冰上，10×reaction buffer保存在室温，所有的试剂在打开之前都应该短暂的微微离心，以防丢失或污染到离心管边缘的物质。

2.室温下转录反应如果反应在冰上进行，10×reaction buffer中的亚精胺可以与模板中的DNA共沉淀，离心管中加入水和核苷酸后再加入10×reaction buffer。

以下是一个20ul的反应体系，可按需要放大或缩小。

当RNA长度为300base-5kb时采用以下反应体系(用0.1-0.2ug PCR产物模板或0-1ug线性质粒模板）对于更长或更短的转录，参考20页的“Optimizing yield of long transcripts’’和“Optimizing yield of short transcripts”部分。

当合成转录的长度大于5或6KB时，限制GTP生成率，会导致产量降低、过早终止转录。

为了避免这种情况，可能需要补充额外的GTP支持反应。

下面是添加特定体积的GTP对普通转录反应的影响。

（对于T7和T3试剂盒，提供的GTP为30mM。

对于SP6，为20mM.）应该添加多少额外的GTP?对于5-8KB的长度，我们建议最初测试加入1ul的GTP，对于更长的模板应该试试滴定额外的GTP确定所需的最小值。

添加GTP将减少转录合成加帽的比例，但将引起产量升高。

加帽转录的比例与反应中GTP中CAP的模拟物的比率成正比。

RNA产量与良好的加帽效率之间的平衡在网织红细胞溶解物中，我们测试了GTP不同比例的CAP模拟物对转录反应的RNA产量和产生RNA的翻译效率的影响。

RT-PCR实验步骤一．实验器具：1.移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2.5μl2.吸头：1ml、200μl、20μl3.匀浆管：5ml4.EP管：1.5ml、500μl、200μl5.试剂瓶：棕色试剂瓶(广口，放75%乙醇)6.量筒：100ml7.容量瓶：1000ml8.试管架：5ml、1.5ml、20μl9.铝制饭盒：1-2个10.大瓷缸：1个11.锡泊纸：一卷12.卷纸：2卷13.三角烧瓶：带盖，稍大二．实验器具处理1.塑料制品：(包括枪头、EP管、匀浆管等)先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中(注意：小枪头要充分浸泡，必要时需要针筒打入DEPC水)，过夜后取出(注意：DEPC水很难自然晾干，所以建议先将刚取出的DEPC物品甩干，枪头装入枪头盒后甩干，EP管和匀浆管装入饭盒后甩干，然后在37度孵箱烘干)。

高压后烤干备用。

如果DEPC处理过的物品时间已超过一个星期，再次使用前应再次高压。

2.玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，先泡1‰DEPC过夜，再蒙锡纸烤干备用。

3.匀浆器：(包括剪刀、镊子)先洗净后，超声消毒即可(不需要泡DEPC)。

三．试剂配制1．DEPC水：吸出1ml DEPC放在1000ml容量瓶中加双蒸水定容至1000ml，配成1‰DEPC水，并充分振荡混匀备用。

2．75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存(DEPC水需先高压，高压时注意：1.装DEPC水的瓶子在盖子和瓶之间要放上线头；2.高压时间在40-45分钟，所以水要适当多加一点；3.高压结束后，不要强行放气，要让压力自然下降，不然水会喷出)。

3．异丙醇：放入棕色瓶中。

4．氯仿：放入棕色瓶中。

5．琼脂糖四．缓冲液配制1．电泳缓冲液(5×TBE贮存液)：Tris 54g、硼酸 27.5g、0.5M EDTA 20ml pH8.0、加蒸溜水至1000ml。

使用时，将5×TBE稀释10倍成0.5×TBE就可以在电泳时使用(工作浓度) 2．上样缓冲液(6×缓冲液，4℃保存)：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、30%甘油五．琼脂糖凝胶配制1．1.0%：1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉加热至沸腾(如果首次煮胶，一定要煮透，以不出现泡沫为标志)，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min(可以放入4度冰箱加快琼脂糖凝固)后现进行电泳。

诺唯赞5×逆转录说明书XXX5×逆转录适用于：Two-step RCR；37RT；蛋白变性。

蛋白变性。

所所用用体体系为系为15-100l，根据我们的体系根据我们的体系设置为设置为20l。

按按F1 protocol library 键出现，选择所需程序，出现，选择所需程序，按enter键键按按enter键后，键后，出现选择view protocol，查看程序检查程序按F5 back键，返回上一级，返回上一级，选择选择run protocol按按enter键。

2、选择Algorithmic measurement向右移动输入体积（输入体积（15-100l）按F5 start键，开始运行。

F1 protocol library 选择程序按Enter键选择view protocol确定程序后F5 back选择run protocol按enter键选择Algorithmic measurement输入体系入体系20lF5 startGeneAmp* PCR system 9700打开开关，按F5 user键。

3、蛋白变性。

所用体系为系为5-100l，根据我们的体系根据我们的体系设置为设置为10l及及20l。

按F5键后出现此画面，选择文件夹chen按F1 accept键按F1键后出现此画面，按F3 edit键按F3键后键后出现此画面，选择所需程序按F2 view键按F2键后键后出现此画面，确定程序后按F1 edit键按F1键后出现此画面，按F1 start键输入体积（5-100l）按F1 start键开始。

F5 userChen F1 acceptF3 edit选择程序选择程序后后F1 editF1 start。

产品特点：1.高效的XXX5×逆转录效率：新颖突变位点大幅提升酶活性能，获得更高产量的cDNA。

2.良好的延伸能力：点突变消除RNase H活性，改善逆转录酶与RNA模板的亲和力，可获得长至12 kb的cDNA。

逆转录技术手册本文档中的信息如有更改，恕不另行通知。

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目录逆转录 | iii仅供科学研究使用1 逆转录 (1)1.1 发现 (1)1.2 发展 (1)1.3 应用...........................................................22 建立逆转录反应 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32.1 步骤 (3)2.1.1 RNA 模板制备 (3)2.1.2 基因组DNA 去除 (6)2.1.3 选择引物 (6)2.1.4 进行逆转录 (8)2.1.5 基因组DNA 去除 (9)2.2 常见逆转录酶及性质 (9)2.2.1 DNA 聚合酶活性 (9)2.2.2 RNase H 活性 (10)2.2.3 热稳定性 (11)2.2.4 持续合成能力 (12)2.2.5 保真度 (14)2.2.6 末端转移酶（TdT ）活性 (14)2.3 常见问题及解决建议 (15)2.3.1 RT -(q)PCR 扩增量低或未扩增 (15)2.3.2 RT -(q)PCR 非特异性扩增 (16)2.3.3 cDNA 截短 (17)2.3.4 cDNA pool 覆盖率低 (18)2.3.5 cDNA 测序错误 (19)3 应用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203.1 逆转录聚合酶链式反应（RT -PCR ）. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203.1.1 RT -PCR (20)3.1.2 定量RT -PCR (27)3.1.3 直接RT -qPCR (28)3 .2 cDNA克隆和文库构建 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .293.3 cDNA末端快速扩增 (32)3.4 基因表达芯片 (34)3.5 RNA测序 (36)3.6 逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP） (38)iv | 逆转录仅供科学研究使用1 逆转录本章内容涵盖逆转录基础、cDNA合成、酶选择、常见问题处理技巧以及cDNA在分子生物学研究中的应用，是适用于各种层级研究人员的学习资源。

Version 9.2Vazyme biotech co., ltd.产品概述本产品包含Taq DNA Polymerase 、dNTP 以及优化的缓冲体系，只需加入引物和模板即可进行扩增，减少了移液操作，提高了检测通量和结果的重现性。

扩增体系中加入的保护剂使得2 × Master Mix 反复冻融后仍可保持稳定活性。

本品提供含有电泳缓冲液和染料的版本，可在反应结束后直接进行电泳，使用方便。

PCR 产物的3’端带A ，可直接克隆至T 载体，并适用于ClonExpress ®和拓扑克隆试剂盒(C112/C113/C115/C601)。

质量控制核酸外切酶残留检测：20 μl 本品与50 pmol 单链DNA 底物和双链DNA 底物在37℃下孵育16 h ，经变性PAGE 电泳，DNA 的电泳谱带不发生变化。

核酸内切酶残留检测：20 μl 本品和0.3 μg pBR322 DNA 在37℃下孵育4 h ，经琼脂糖凝胶电泳，质粒的电泳谱带不发生变化。

大肠杆菌DNA 残留检测：20 μl 本品中残留的核酸经E.coli gDNA 特异性的TaqMan qPCR 检测，E.coli 基因组残留低于10拷贝。

功能检测：50 μl PCR 体系中，分别以1 μl HeLa cDNA 、100 ng 人基因组DNA 、5 ng λDNA 为模板，扩增长度分别为2 - 10 kb 的5个不同目的片段，延伸时间设置为 1 min/kb 。

35个循环后取1/10 PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，EB 染色，可见有单一的相应条带。

保存条件-30 ~ -15℃保存；运输条件：≤0℃。

产品组分2 × Taq Master Mix 5 × 1 ml 15 × 1 ml 50 × 1 ml组 分P111-01P111-02P111-032 × Taq Master Mix (Dye Plus) 5 × 1 ml 15 × 1 ml 50 × 1 ml组 分P112-01P112-02P112-03* 不同模板最佳反应浓度不同，下表为50 µl 反应体系推荐模板使用量：反应体系ddH 2O2 × Taq Master Mix Primer1 (10 µM)Primer2 (10 µM)Template DNA*To 50 µl 25 µl 2 µl 2 µl x µl动植物基因组DNA 大肠杆菌基因组DNA cDNA 质粒DNA λDNA0.1 - 1 µg 10 - 100 ng1 - 5 µl (不超过PCR 反应总体积的1/10)0.1 - 10 ng 0.5 - 10 ng实验流程a.该预变性条件适合绝大多数扩增反应，可根据模板结构复杂程度修改。

河南农业科学，2023，52（11）：33⁃41Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi:10.15933/ki.1004-3268.2023.11.004利用CRISPR/Cas9技术创制小麦耐低肥Taaap 3突变体李艳1，2，陈艳艳1，2，华夏1，2，方宇辉1，2，王玉民1，2，巩晨1，齐学礼1，2，胡琳1，2（1.河南省作物分子育种研究院/河南省小麦生物学重点实验室/河南省麦类种质资源创新与改良重点实验室，河南郑州450002；2.神农种业实验室，河南郑州450002）摘要：为了创制耐低肥、高产小麦（Triticum aestivum L.）新种质，利用CRISPR/Cas9技术编辑小麦中氨基酸透性酶基因TaAAP 3，明确突变体类型，并分析突变体在低肥条件下的产量，筛选耐低肥、高产小麦新材料。

结果表明，共获得了1个小麦TaAAP 3基因单亚基因组纯合突变体和2个三亚基因组纯合突变体，主要发生的突变是单个碱基的插入和小片段DNA 的插入、缺失，其导致了移码突变，使翻译提前终止，造成蛋白质序列完全被改变。

突变体Taaap 3幼苗叶片中TaAAP 3基因的表达水平显著低于野生型，且TaAAP 3在三突变类型中的表达量显著低于单突变类型。

低肥条件下，3个Taaap 3突变体产量均显著高于野生型，且TaAAP 3基因表达水平越低，增产幅度越大。

综上，在小麦中敲除TaAAP 3基因后，其表达水平显著降低，且低肥条件下籽粒产量显著增加。

关键词：小麦；TaAAP 3；突变体；基因表达；籽粒产量；CRISPR/Cas9中图分类号：S512文献标志码：A文章编号：1004-3268（2023）11-0033-09收稿日期：2023-08-13基金项目：河南省科技攻关项目（232102110251）；神农种业实验室“一流课题”项目（SN01-2022-01）；国家小麦产业技术体系项目（CARS-3-7）作者简介：李艳（1978-），女，河南新乡人，副研究员，博士，主要从事小麦遗传育种研究。

一、RNA提取（1）实验材料准备1. Trizol （全式金，4 ℃保存）2. 氯仿、异丙醇、无水乙醇（专门用于RNA提取，4 ℃）3. 75 %的乙醇（RPE）：75 %无水乙醇+25 %DEPC水4. DEPC水：999mL高压过的三蒸水中加入DEPC（焦碳酸二乙酯）原液1mL，摇匀过夜，4 ℃保存。

5. 无RNA酶的EP管及枪头（天净沙RNase清除剂购于恩硕公司，天净沙RNase清除剂和单蒸水以1:1000比例泡5 min，倒掉后，再以1:1000比例配比，浸泡过夜，倒掉，以1:10000比例浸泡3-5 min，尽量倒净，高压30 min，放烘箱烘干。

）6. 移液器、振荡器、高速离心机（最好为4 ℃离心机）、瞬时离心机、封口膜。

（2）实验步骤组织样品研磨过程取新鲜采集或保存于-80 ℃或液氮中的组织200 mg（黄豆样大小），放入盛有1/5液氮的研钵中，先用研杵将组织块敲碎（注意不要让组织和液氮溅出），然后开始研磨，及时补充液氮以防组织暴露于空气中，将组织研磨成无明显颗粒的粉末状后加入液氮，将组织液氮混合液倒入预冷的EP管中待液氮挥发完组织还未融化时加入1 mL Trizol（或在液氮即将挥发完毕时，用不锈钢小勺将研磨好的组织加入到盛有1mL Trizol的EP管中），震荡混匀，-80 ℃保存备用。

注意事项一定研磨充分，不要求研磨成奶粉状，但至少得看不到明显的颗粒，这样Trizol才能充分和组织接触，快速裂解组织，也能防止组织的降解（Trizol内含RNA酶抑制剂）。

研磨时注意安全，不要使液氮溅出。

1. 取800 μL Trizol加入到400 μL病毒液（血清、奶汁、稀释处理过的仔猪肠内容物和粪便）中，振荡器震荡15 sec，使其充分混匀，室温静置8 min，使得核酸蛋白复合物完全分离。

（超离纯化的病毒，可按原液、1:10、1:50、1:100不同浓度稀释按梯度进行抽提。

不同的样品视情况选择稀释度）2. 可选步骤：4 ℃ 12 000 r/min 离心5 min，取上清。

反转录试剂盒TAKARA6210A操作步骤Code No. 6210A 研究⽤PrimeScript? II 1st StrandcDNA Synthesis Kit说明书⽬录内容页码●制品说明 1 ●制品内容 1 ●保存 1 ●1st-strand cDNA合成反应 2 ●RT-PCR反应 2 ●RNA样品的制备 3 ●相关产品 3●制品说明本制品是使⽤PrimeScript II RTase从Total RNA或Poly (A)＋ mRNA合成1st Strand cDNA的试剂盒。

含有1st Strand cDNA合成所需的全部试剂。

以结构复杂的RNA或长链RNA为模板进⾏cDNA合成时，cDNA合成受到抑制的主要原因是RNA⾼级结构与反转录酶的⾮特异性结合。

并且，由于反转录酶的错配引起的⾮特异性延伸，对RT-PCR或全长cDNA的合成极为不利。

PrimeScript II RTase是对PrimeScript RTase进⾏进⼀步改良的反转录酶，本反转录酶可以极⼤限度地抑制RNA⾼级结构与反转录酶的⾮特异性结合。

本制品使⽤了PrimeScript II RTase，利⽤Oligo dT从PolyA开始进⾏延伸反应，使⽤标准反转录温度42℃，不仅能维持PrimeScript RTase原有的卓越的cDNA合成效率和cDNA合成速度，同时可以合成本底低、纯度⾼、完整性好的cDNA。

另外，反转录反应液配制时所产⽣的⾮特异性延伸是抑制cDNA合成的主要原因，本制品能有效控制这⼀现象。

反应液配制后，冰上放置直⾄反转录反应开始，不会发⽣抑制cDNA合成的现象。

合成的1st Strand cDNA可⼴泛应⽤于2nd Strand cDNA合成、杂交、PCR法扩增等。

特别适⽤于全长cDNA⽂库制作、⾼纯度全长cDNA合成等。

●制品内容(50次量)PrimeScript II RTase (200 U/µl) 50 µl5×PrimeScript II Buffer 200 µl RNase Inhibitor (40 U/µl) 25 µl dNTP Mixture (10 mM each) 50 µl Oligo dT Primer (50 µM) 50µl Random 6 mers (50 µM) 100 µl RNase free dH2O 1 ml【各种引物序列】* 该序列与RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0 (Code No. RR019A)中的Oligo dT Adaptor Primer不同，不含有与M13 Primer M4匹配的序列。

诺唯赞r323说明书
1.简便快捷的操作
HiScriptRll RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) (Vazyme #R323)包含基因组清除模块，可彻底去除RNA模板中残留的基因组DNA;同时Vazyme #R323包含逆转录反应所需的所有组分，只需加入模板RNA，20 min 内即可完成逆转录反应，操作简便快捷。

2.广泛的模板兼容性
分别以HeLa 细胞、小鼠肝脏、拟南芥叶片的完整RNA与降解RNA 为模板，使用HiScriptRIll RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(Vazyme#R323)以及市售常见品牌逆转录试剂(Supplier T)进行逆转录。

将得到的cDNA进行多个基因的qPCR定量分析，以不同基因为横坐标，扩增CT值为纵坐标绘图，比较不同产品的逆转录效率。

以HeLa细胞、小鼠肝脏、拟南芥叶片完整RNA以及降解RNA为模板进行逆转录定量，Vazyme #R323的扩增C┐值小于或等于T公司相关产品，说明Vazyme#R323逆转不同物种RNA、完整度较差的RNA模板皆具有卓越的逆转录效率。

3.超强的杂质耐受度
在RNA的提取过程中常常因操作或样本的特殊性导致RNA中混有有机试剂或杂质，这些物质的残留会严重影响逆转录效率。

乙醇、异丙醇、水平衡酚、异硫qing酸胍、腐殖酸是RNA提取过程中较为常见的杂质，测试其对逆转录效率的影响。