紫外诱变酿酒酵母筛选耐高温菌株

聂世现，王钰，黄文静，季必霞0 引言石油是世界经济与发展的基本能源之一，其储备有限。

20世纪70年代世界范围发生石油危机，使利用可再生的资源（如高淀粉作物）发酵生产酒精作为生物能源的研究成为人们关注的焦点。

生物能源与石油相比具有可再生、污染小、减少温室效应等优点，能部分或全部代替汽油。

目前，燃料酒精的生产占世界酒精总产量的66%，并且还有进一步增加的趋势。

发酵法是酒精生产的重要方法，发酵法生产酒精的关键是酵母菌株，酒精酵母的优劣不仅直接影响发酵率的高低，而且会影响酒精的产量和质量。

我国酒精生产行业中普遍存在亟待解决的问题是发酵强度低,生产成本高,能耗大。

因此，高产酒精酵母的选育是提高酒精产率，节约生产能源的关键。

为了开展非粮作物甘薯等转化酒精的研究，本论文探讨了酵母菌A4原生质体制备和再生的适宜条件，并用紫外线作诱变剂，对酵母菌原生质体进行诱变处理，旨在筛选出发酵力强、酒精产量高的优良酵母菌株，为下一步以高产淀粉品种甘薯为原材料生产酒精的研究工作奠定基础。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种酵母菌（A4）为本实验室保藏菌种。

1.1.2 培养基麦芽汁液体培养基：将麦芽汁（购于合肥市华润雪花啤酒厂）糖度调至12°Brix，过滤后121℃灭菌20min。

YPD培养基(g/L)：液体培养基：酵母提取物10，蛋白胨20，葡萄糖20。

固体培养基：在YPD液体培养基中加入琼脂20，NaOH0.1。

原生质体再生培养基：在YPD固体培养基中分别添加KCl至0.7mol/L，山梨醇至0.8mol/L，甘露醇至0.8mol/L，17%的蔗糖。

以上培养基于115℃灭菌20min。

TTC上层培养基(g/L)：TTC（三苯基四氮唑盐酸盐）0.5，葡萄糖5，琼脂15。

TTC下层培养基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨2，酵母膏1.5，K2HPO41，MgSO4·7H2O4，琼脂20，pH5.5。

1.1.3 试剂缓冲液：pH6.8的柠檬酸-磷酸缓冲液。

毕业论文开题报告生物工程耐高浓度酒精的酵母筛选及发酵工艺研究1 选题的背景和意义石油作为国民经济发展的战略物资在经过人类近二百年的开采后，面临全球桔竭的局面。

特别是近年来，随着经济的持续增长和石油需求迅速膨胀，我国已成为继美国之后的第二大能源消费国。

针对我国人多地少、粮食紧缺和石油短缺的国情，依据不与人争粮、不与粮争地，能源原料多元化，实现持续发展的原则，开发非粮燃料乙醇生物能源，降低生产成本，提高转化效率，确保现代社会发展的需求，已成为国家新能源战略发展最紧迫的任务。

传统酿酒酵母的酒精发酵最适温度不高，一般为25℃一30℃；耐酒性较差，耐酒精浓度在10％左右。

一方面，在杂菌污染严重的情况下，生产上不仅要求无菌条件严格，操作难度较大，而且为了控制因发酵热所引起的温度上升，需要加入大量冷却水(甚至在部分气温较高地区，因发酵过程中过热，根本无法进行正常生产)，导致乙醇生产成本增加[1-2]；另一方面，酵母的耐酒精度较低，产物的抑制作用降低乙醇酵母的产乙醇潜力。

因此，耐受性酒精高温酵母的选育研究已成为国内外酒精行业的研究热点[3-4]。

乙醇酵母对生活条件的变化有迅速的适应能力，并且随着外界环境的变化，其群体能迅速产生变种，这为耐酒精酵母的筛选提供了可能[1]。

耐高温酵母不是微生物分类学上的名词，而是从生态方面表达此类酵母对温度的忍耐性与普通酵母的差异。

筛选耐高温的乙醇酵母菌株，其生产上的优势主要体现在：①具有较高的发酵能力，即能快速并完全将糖分转化成乙醇，能够解决糖化温度和发酵温度不协调的矛盾，实现真正意义上的边糖化边发酵，从而减少葡萄糖对纤维素酶的抑制作用，提高纤维素酶的糖化率，进而提高纤维素发酵生产燃料乙醇的得率[2-3]；②繁殖速度快，即具有高的比生长速度，高温发酵还能够提高发酵效率，降低发酵时的冷却成本[4]；③具有高的耐酒精能力，即对本身代谢产物的稳定性高．因而可以进行浓醪发酵；④抗杂菌能力强，即对杂菌代谢产物的稳定性高．耐有机酸能力强；⑤对培养基的适应性强。

紫外诱变法选育高产酒精及酯类酿酒酵母方佩佩;王世清;李静;谭海刚;刘晓莉;付均鹏【摘要】采用紫外诱变法进行酿酒酵母的诱变，选育发酵速度较快、产酒精能力较强的酿酒酵母工业菌株。

以致死率和正突变率为主要指标，以突变株的酒精发酵性能为参考，结合单因素实验和正交实验，确定出紫外诱变法的较佳诱变条件为：辐照功率20 W，紫外灯辐照时间10 min，辐照距离9 cm。

以出发菌株 F1为对照，对7株酵母突变株进一步进行全面的生理性能测试，结果表明，菌株F4的CO2失重量最高、残糖含量低、乙醇和酯类物质的产生量高，是一株优良的正向突变株。

对该菌株进行形态观察，其细胞个体饱满呈卵圆型，群体菌落颜色呈乳白色；用于紫甘薯汁发酵，起酵速度快、发酵液酒精度可达11.08％（V ／V），香气浓郁，具有良好的工业生产潜力。

%Saccharomyces cerevisiae induced by UV mutagenesis to breeding the strains of high fermenta-tion rate and alcohol production are investigated.Regarded fatality rate and percentage of plus mutants as main criterion,ethanol fermentation performance of mutant as reference,the proper condition of UV muta-genesis experimented by single factor and orthogonal experiment are as follows:UV radiation time for 10 min by ultraviolet lamp of 20w,distance from the lamp to sample at 9cm.And with the original strain F1 as control,physiological comprehensive performance tests of the seven mutant stains are conducted.The results are shown that an excellent positive mutated S.cerevisiae F4 is obtained,which has a high loss of carbon dioxide weight,low amount of residual sugar,superior production of ethanol and esters.The cell of this mutated strain F4 is full,its shape isoval,and its color is ivory -white or cream.It could be applied in the wine of purple sweet potato,of which the fermentation rate and alcohol production are high,the al-cohol degree of fermentation broth can reach at 11.08%,the aroma is strong.So the potential industrial production of this mutated strain is well.【期刊名称】《粮油食品科技》【年(卷),期】2016(000)001【总页数】5页(P86-90)【关键词】紫外诱变;酵母菌;育种;紫甘薯【作者】方佩佩;王世清;李静;谭海刚;刘晓莉;付均鹏【作者单位】青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛 266100;青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛 266100;青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛 266100;青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛 266100;青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛 266100;青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛 266100【正文语种】中文【中图分类】TS201.3酵母菌，一般泛指能发酵糖类的各种单细胞真菌[1]。

耐高温、高浓度酒精酵母的选育与耐受性能初步鉴定彭源德;朱作华;唐守伟;严理;温岚;汤清明;熊和平【摘要】针对传统酿酒酵母的酒精发酵温度低、耐酒性差、乙醇产率低和成本高等问题,进行了耐高温、高浓度酒精酵母的选育与耐受性能初步鉴定研究.通过广泛采集菌样,初筛、复筛,从22个样品中经分离得到S11、S12、S15、S17 4株在40℃均能较好生长的耐高温酵母菌:对S15、S17菌株进行紫外诱变育种,获得1株编号为S132的耐受性优良酒精酵母.与对照丹宝利耐高温酵母相比,S132耐受40℃高温和16%(v,v)乙醇的能力分别高出20.9%和15%,是一株良好的高耐受性酒精酵母.【期刊名称】《中国麻业科学》【年(卷),期】2010(032)003【总页数】6页(P135-139,142)【关键词】耐受性;酵母菌;酒精发酵【作者】彭源德;朱作华;唐守伟;严理;温岚;汤清明;熊和平【作者单位】中国农业科学院麻类研究所,湖南,长沙,410205;中国农业科学院麻类研究所,湖南,长沙,410205;中国农业科学院麻类研究所,湖南,长沙,410205;中国农业科学院麻类研究所,湖南,长沙,410205;中国农业科学院麻类研究所,湖南,长沙,410205;中国农业科学院麻类研究所,湖南,长沙,410205;中国农业科学院麻类研究所,湖南,长沙,410205【正文语种】中文【中图分类】Q93-335石油作为国民经济发展的战略物资在经过人类近二百年的开采后，面临全球枯竭的局面。

特别是近年来，随着经济的持续增长和石油需求迅速膨胀，我国已成为继美国之后的第二大能源消费国。

针对我国人多地少、粮食紧缺和石油短缺的国情，依据不与人争粮、不与粮争地，能源原料多元化，实现持续发展的原则，开发非粮燃料乙醇生物能源，降低生产成本，提高转化效率，确保现代社会发展的需求，已成为国家新能源战略发展最紧迫的任务。

传统酿酒酵母的酒精发酵最适温度不高，一般为25℃-30℃；耐酒性较差，耐酒精浓度在10%左右。

酿酒酵母的紫外诱变选育及发酵条件研究作者：杨亚珍，查凡，果然，等来源：《湖北农业科学》 2015年第7期杨亚珍ａ，查凡ａ，果然ａ，张建民ｂ（长江大学，ａ．生命科学学院；ｂ．农学院，湖北荆州４３４０２５）摘要：以果园土为菌种来源，采用平板分离法得到５种酵母菌，对其进行紫外线诱变，筛选出７株酵母菌突变株，通过测定突变株的发酵性能，从中筛选出１株液化酶活力、糖化酶活力、蛋白酶活力及发酵力均较好的酵母突变株Ｎ４－４，其发酵液化酶活力、糖化酶活力、蛋白酶活力和发酵力比对照菌株分别提高了６．７％、７．５％、８．１％和３９．０％，通过单因素和正交试验确定该突变株的最佳发酵条件。

结果表明，在３０℃、１２０ｒ／ｍｉｎ的培养条件下，突变株最佳发酵条件为３％葡萄糖、３％（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ５．０、３％接种量（Ｖ∶Ｖ）。

关键词：酵母菌；紫外线诱变；发酵条件中图分类号：TS261.1；Q93.3文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）07－1664-04DOI:10.14088/ki.issn0439-8114.2015.07.034酵母菌是白酒发酵过程中的一种重要微生物，白酒风味的形成与发酵过程中各种酵母菌息息相关［１］。

酵母菌的主要作用是将原料糖化后的绝大部分糖类物质转化为乙醇和二氧化碳，同时生成甘油、高级醇、酯、醛等代谢产物，直接影响着白酒的色泽、香气及口感，决定着白酒的质量。

酵母菌的发酵特性常常因菌株的不同而存在明显的差异［２］，野生型酵母菌在工业发酵过程中不可避免地受到胁迫条件（如乙醇毒性、高温胁迫等）的影响，最终影响到乙醇产率和白酒品质以及其经济效益。

工业上常常采用紫外线诱变的方法，对酿酒酵母工业菌株进行改良来提高菌株对胁迫条件的耐受性［３］。

本试验采用紫外线诱变的方法对果园土中分离到的５株酵母菌进行诱变，以期筛选出发酵力较高的突变株，为提高白酒的产量和质量提供参考。

１材料与方法１．１材料菌种来源：分离自陕西省周至县邵家堡村苹果园土壤中。

酿酒酵母温度敏感性突变株的选育岳希洁;蒋雪薇;罗晓明;周慧;刘永乐;陈代文;周志明【摘要】为获得酵母胞内产物的高效分泌,以酿酒酵母二倍体(2n)及单倍体(n)为出发菌,经紫外诱变处理,筛选获得5株可能具有温度敏感性的突变株.为进一步鉴定,以野生菌Y1为对照菌,测定其胞外核酸、蛋白质及果糖-1,6-二磷酸(FDP)的含量,发现突变菌株Ts4(2n)自溶程度最高,其核酸、蛋白质渗透率达1.709,1.483,胞外FDP浓度为38 μg/mL,较Y1(2n)提高了24.1％.此外突变株Ts2(n)、Ts3(.)(n)也会发生一定程度的自溶.因此,该试验共获得温度敏感性突变株3株,即Ts4 (2n)、Ts2(.)(n)和Ts3* (n).【期刊名称】《食品与机械》【年(卷),期】2016(032)008【总页数】5页(P9-12,16)【关键词】酿酒酵母;紫外诱变;温度敏感性突变株;自溶【作者】岳希洁;蒋雪薇;罗晓明;周慧;刘永乐;陈代文;周志明【作者单位】长沙理工大学化学与生物工程学院,湖南长沙410004;长沙理工大学化学与生物工程学院,湖南长沙410004;长沙理工大学化学与生物工程学院,湖南长沙410004;长沙理工大学化学与生物工程学院,湖南长沙410004;长沙理工大学化学与生物工程学院,湖南长沙410004;连南瑶族自治县奇乡生物科技有限公司,广东清远 513300;连南瑶族自治县奇乡生物科技有限公司,广东清远 513300【正文语种】中文酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为一种模式生物，具有安全可靠、遗传背景清晰等优点，被认为是外源基因最理想的真核生物表达系统[1-2]。

由于其不能有效释放外源基因所表达的蛋白[3-4]，故在工业中的应用存在着明显的局限性。

近年来国内外开展了一些利用酵母细胞膜通透性提高外源蛋白分泌的研究，多集中在两个方面：① 采用物理方法处理[5-7]，通过超声波、高压脉冲及光照等方法对细胞膜结构产生破坏，提高胞内物质及外源蛋白的分泌能力；② 利用基因工程的手段[8-10]，重组或改造外源基因中的信号肽，增强外源蛋白的分泌能力。

耐高温酿酒酵母菌株的选育
卜文静;段秋虹;杜金宇;王毅;隋继学
【期刊名称】《河南农业大学学报》
【年(卷),期】2016(050)002
【摘要】以酿酒酵母L为研究对象,通过紫外诱变、高温驯化处理的方法,选育出l 株耐高温酿酒酵母L-9a.研究结果表明:处理a在38℃条件下,L-9a生物量为106 mg,乙醇产率为53.02％,平均产量为1.71 mL·100 mL-1,残还原糖含量平均为0.76 9·100 mL-1,解决了同步糖化发酵中糖化和发酵温度不一致的问题.
【总页数】6页(P235-240)
【作者】卜文静;段秋虹;杜金宇;王毅;隋继学
【作者单位】河南牧业经济学院能源与动力工程系,河南郑州450011;郑州科技学院,河南郑州450062;河南牧业经济学院能源与动力工程系,河南郑州450011;河南农业大学机电工程学院,河南郑州450002;河南牧业经济学院能源与动力工程系,河南郑州450011
【正文语种】中文
【中图分类】TS261.1
【相关文献】
1.传统诱变与基因组重排技术相结合选育耐高温酿酒酵母菌株 [J], 董健;李月强;陈叶福;张翠英;肖冬光
2.原生质体复合诱变选育耐高温高产乙醇酵母菌株 [J], 申乃坤;王青艳;秦艳;王成
华;廖思明;朱婧;黄日波
3.基因组改组技术选育耐高温、耐高乙醇酿酒酵母菌株的研究 [J], 王灏;王航;孟春;郭养浩
4.乙醇耐受性酿酒酵母菌株选育的研究进展 [J], 尤亮;丁东栋;崔志峰
5.适量产乙酸酯酿酒酵母菌株的选育 [J], 魏亚楠;王金晓;林良才;陈博超;崔丹瑶;张翠英
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摘要：从野外葡萄园土壤中采集土壤样品，在实验室中通过微生物培养，微生物的富集，菌种的分离、纯化，筛选出纯的酵母菌。

将筛选出的纯的酵母菌分组分别进行培养，进行耐酒精能力的比较。

培养到最佳时期的时候，分别测定各组酵母菌株培养基中酒精含量，筛选出耐酒精性能最好的菌株。

该超强耐酒精能力的优良菌株的成功筛选为酵母菌能高效利用发酵培养液提供了菌种来源，同时也为发酵后的酒精分离降低了难度和成本。

关键词：微生物；耐酒精；酵母；筛选；性能测定前言：随着化石能源的日趋匮乏及环境污染的加剧，开发一种绿色能源势在必行。

乙醇作为一种生产工艺成熟、生产原料来源广的替代能源日益受到人们关注。

尤其是燃料酒精作为清洁能源，原料资源可以再生，大大的刺激了酒精行业的发展。

用微生物法生产酒精的历史由来已久，并且生产工艺早已成熟。

目前乙醇的生产原料为玉米、小麦等粮食产品为主。

尽管用粮食生产酒精成本昂贵，但由于用纤维素作原料生产酒精的方法还不成熟，工艺过程很不完善，所以怎样提高粮食生产酒精过程中原料的利用率，是目前酒精发酵过程研究的一个重要方向，也是降低发酵生产酒精的重要措施。

因为酒精是酵母菌糖代谢产物，对酵母菌的发酵有一定抑制作用，当酒精成分达到10%左右时，酵母菌就停止繁殖，发酵过程也随之放慢。

在酒精发酵过程中，由于一般酒精酵母的耐酒精能力不强（耐酒精度一般为10%），导致酵母菌不能充分利用发酵原料，造成了原料的浪费，同时由于发酵液中酒精含量低，使得酒精后期的分离纯化过程复杂，从而大大增加了生产成本。

因此，耐高酒精度的酒精酵母的筛选具有非常重要的意义。

耐高酒精度的酒精酵母能够减缓产物的抑制作用，提升酒精酵母产酒精的潜力【1】。

耐酒精酵母可以在发酵液中较高浓度的酒精中不会死亡，并且仍然具有利用培养液发酵酒精的能力，从而提高酒精原料的利用率。

同时和一般酵母发酵相比，发酵产物中酒精的含量能达到18%左右，产物中原料和杂质的含量下降，产物中酒精的纯度增加，也使得酒精的分离提纯更加容易进行，从而使粮食生产酒精成本降低。

文章编号：１００２－８１１０（２００６）０５－００３３－０３酒用耐酸酵母菌紫外线诱变育种刘云秀（四川理工学院生物工程系，四川自贡，６４３０００）摘要：从白酒厂采集来的酒糟等相关材料中，经过一系列的分离纯化得到的相关酵母菌株作为出发种，对出发种进行不同剂量的紫外线诱变处理后，用ｐＨ３的选择培养基作为筛选条件，分离，选育适合白酒厂生产工艺条件要求的酒用耐酸酵母菌株。

关键词：酒用酵母菌；耐酸酵母菌；紫外线诱变中图分类号：ＴＳ２６２．３；ＴＳ２６．１１，ＴＳ２６１．１５文献标识码：Ｂ酵母菌是发酵工业上的一种重要真菌类微生物，自古以来就广泛应用在酿造和发酵食品工业上。

到了现代，还广泛应用在石油代粮发酵，单细胞蛋白质，发酵饲料等工业上［１］。

还可以从酵母菌中提取医药，化工方面需要的一些重要原料。

在自然界中，它们多分布在含糖量高。

偏酸性的环境中。

它的最适生长温度为２５￣３０℃，最适生长ｐＨ为ｐＨ５￣６，发酵温度为３０￣３５℃，酵母菌是一种兼性厌氧微生物，在繁殖时需要大量供给空气；在发酵时，不需要空气。

在传统的白酒生产中，窖池内发酵期长达２￣３个月。

酵母菌在整个发酵期中，一般在前１￣２个月产酒精，发酵伴随着产酸过程，其产生的有机酸不断地积累，ｐＨ不断降低，到一定值时，一般的酵母的生长，繁殖就会被抑制，发酵能力也不断降低，直至停止。

从而导致粮食原料的不完全利用，造成浪费。

因此有必要选育一种耐酸酵母菌。

对提高白酒产量，提高粮食利用率，降低成本，达到可观的经济效益。

１实验仪器和材料１．１主要仪器ＤＧ－１多功能恒温箱，ＢＣＤ－１８２杨子电冰箱，ｐＨＳ－３Ｃ酸度计，ＧＢ４０２７．１－８３手提式蒸汽锅ＸＳ－１８双目显微镜，Ｈ２Ｑ－Ｒ振荡器，ＨＨ－ＳＹ２１－ＮＩ４电热恒温水浴锅，８８－１恒温磁力搅拌器，特种工作净化台，ＡＣ９００＋血球计数仪。

１．２材料９５％乙醇，麦芽粉，琼脂粉，碘，盐酸，酒糟，窖泥，黄浆水．麦芽汁液体培养基。

实验一耐高温酵母菌株的诱变选育一、目的要求通过实验，观察紫外线对酵母菌的诱变效应，学习物理因素诱变育种的方法。

二、基本原理紫外线对微生物有诱变作用，主要引起是DNA的分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。

测定紫外光的剂量有直接法（以尔格/平方毫米表示绝对剂量）和间接法（以辐照时间或致死率作为相对剂量）两种。

微生物所受射线的剂量决定于灯的功率、照射距离和时间。

如果功率和距离是固定的话，则剂量就和照射的时间成正比，故照射时间的长短可作为相对剂量。

一般用15W的紫外灯，距离固定在<30厘米>左右，选用致死率达90~99.9%所需的辐射时间进行诱变处理。

但各类微生物所需的最适时间不同，一般营养体需辐照3~5分钟，芽孢要10分钟，芽孢杆菌的营养体要1~3分钟，革兰氏阳性菌和无芽孢菌较易杀死，用30秒，放线菌的分生孢子用30秒~2分钟。

辅射不宜在肉汤等成分复杂的液体中进行，以免化学反应的干扰；同时要有电磁搅拌设备，以求照射均匀，尤其在菌液浓度较大或菌体、孢子等较大而重时很容易在处理期间发生沉降，此时电磁搅拌更显重要。

照射前紫外灯宜先开灯预热20~30分钟，使光波稳定。

三．菌种与仪器菌种：酵母菌仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机四．实验设计（1）菌悬液的制备（a）取培养24小时的酵母菌的斜面1支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的大试管中，振荡30分钟，以打碎菌块。

（b）将上述菌液离心（1500r/min，离心5分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。

（c）用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。

（2）马铃薯琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板，凝固后待用。

（3）紫外线处理（a）将紫外线灯开关打开预热约20分钟。

（b）取直径9cm无菌平皿1套，分别加入上述菌悬液6－7ml，并放入无菌大头针于平皿中。

文章编号 1004 6410(2009)03 0026 04耐高温酒精酵母的筛选易 弋1a ,黎 娅1b ,容元平1a ,李 凯2(1.广西工学院a.生物与化学工程系b.科技处,广西柳州 545006;2.四川省中医药高等专科学校,四川绵阳 621000)摘 要:从酒精厂废液、糖厂废糖蜜、土壤及淤泥等七种不同样品中,经富集、分离、纯化,筛选得到3株耐高温酵母菌T M 6、T M 10和T M 20.实验结果表明,3株菌都能在50 的高温下生长,但高温会明显影响酵母菌的发酵能力.30 下,T M 10的发酵酒精终浓度最高,达到了7.82%(v/v).而在40 下T M 20的发酵能力要高于T M 6和T M 10,且发酵酒精终浓度仅比30 时降低了约6%.关 键 词:耐高温;酒精发酵;酵母;筛选中图分类号:T S262.2 文献标识码:A收稿日期:2009-06-05基金项目:广西工学院博士基金项目(0818001),广西工学院科学基金项目(0840202)资助.作者简介:易弋(1979-),男,四川都江堰人,广西工学院生物与化学工程系副教授,博士.0 引言自20世纪70年代发生石油危机以来,能源短缺已成为我国乃至世界各国经济发展的主要障碍.发展可再生资源以解决我国经济持续发展中的能源问题,已成为全社会的共识.燃料乙醇由于其可再生性,被认为是最有可能代替石油的液体燃料,市场潜力十分巨大.目前工业化生产酒精的发酵温度一般在30~33 左右,在这种温度下发酵需要大量的冷却水.若能使发酵在高温下进行,不但可以减少冷却水的用量,节约生产成本,而且可以从根本上解决糖化与发酵不同步的问题,缩短发酵周期,提高发酵效率[1].同时高温发酵能有效的抑制杂菌生长,减少醪液受污染的机会.但过高的温度会引起酵母细胞内脂肪酸、磷脂等成分的变化,甚至会导致蛋白质变性,这样一来就会影响细胞正常的生理活动,表现出高温对酵母细胞的毒性[2].因此,对于耐高温酒精酵母菌的选育问题一直是酒精酵母研究者的重要研究方向之一.针对这一问题,本文拟从自然界中分离出有较强温度耐受性的酵母菌,并初步研究其发酵及相关性能,为下一步的选育工作打下基础.1 材料与方法1.1 培养基酵母培养基:葡萄糖50g,酵母膏8.5g,NH 4Cl 1.0g,MgSO 4 7H 2O 0.6g ,CaCl 20.6g ,加水溶解至1000mL,调pH =4.5,115 灭菌20m in.固体培养基在液体培养基的基础上添加1.5%的琼脂.发酵培养基:葡萄糖150g ,酵母膏5g,蛋白胨5g,NH 4Cl 1.0g,M gSO 4 7H 2O 0.6g,CaCl 20.6g ,加水溶解至1000mL,调节pH= 4.5,115 灭菌20min.T TC 上层培养基[3]:葡萄糖0.5g,琼脂1.5g,加水至100mL,115 灭菌20min,待冷却至55 左右时,加入TTC(2,3,5!氯化三苯基四氮唑)0.05g.第20卷 第3期 广西工学院学报 Vol 20 No 32009年9月 JO U RNAL OF G UA NG XI U N IV ERSIT Y OF T ECHN OL OGY Sep 20091.2 酵母菌分离和纯化在以前的研究中,从柳州市7个不同地点(酒精厂废液,糖厂废糖蜜,果园土壤,农田土壤,湖水淤泥,2个白酒厂的发酵醪液)采集样品,经分离纯化得到了23株具有典型酵母菌特征的菌株,编号为TM1~23[4].1.3 耐高温酒精酵母菌的筛选将分离得到的23株酵母菌涂布于固体培养基上,于42 下培养.待长出菌落后,倒入一层TTC上层培养基,继续培养2~3h.结束后挑选7株长势好、红色较深的菌落备用.TTC可以和细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应,生成红色的甲月赞,由此可判断酵母细胞中呼吸酶活力的大小,即酵母产酒精能力的高低[5]. 将挑选出的酵母菌接种至液体培养基,分别于42 、44 、46 、48 、50 、52 下培养,根据其生长情况选出3株耐高温特性较强的菌株进行下一步实验.1.4 部分发酵特性的测定初始糖浓度对各菌株的影响:制备葡萄糖含量分别为20%、30%、40%、50%、55%、60%的液体培养基,接入筛选的酵母菌,28 摇床培养,通过测定OD560比较其生长情况,从而判断菌株对渗透压的耐受性.pH值对各菌株的影响:制备pH2 0,pH2 5,pH3 0,pH3 5,pH4 0和pH4 5的液体培养基,接入筛选的酵母菌,培养及检测方法同上.酒精对各菌株的影响:制备含不同酒精浓度分别为3%、5%、7%、9%、11%、13%(v/v)的液体培养基,接入筛选出的酵母菌,培养及检测方法同上.1 5 酒精发酵能力的测定于500mL的三角瓶中加入200mL发酵培养基,按10%的比例接入活化后的酵母菌种,分别于30 和40 下静置发酵,每4h测定一次CO2失重,CO2失重小于0 1g时认为发酵结束.发酵结束后测定发酵醪液酒精浓度、残糖和总酸,测定方法见参考文献[6].2 实验结果2 1 耐高温酵母菌的筛选通过在42 下培养及T TC筛选,从23株酵母菌中选出了7株有一定高温耐受性,且酒精发酵能力较强的酵母菌,其编号及形态特征见表1.表中所列7株菌均具有典型的酵母菌形态,而且经TT C筛选,7株菌都具有较好的酒精发酵性能.为了进一步比较这几株菌的耐高温特性,我们将7株菌分别置于不同高温下培养,实验结果见表2.表1 耐高温酵母菌的初筛菌株编号 菌落形态 菌体形态T M1菌落大,圆形,边缘锯齿形,高凸起,不透明,表面粗糙,不闪光,乳白色圆形/椭圆,出芽生殖T M6菌落大,圆形,边缘整齐,高凸起,不透明,表面光滑,闪光,灰白色圆形,出芽生殖T M10菌落中等,圆形,边缘有齿,高凸起,较透明,表面光滑,闪光,灰白色圆形/椭圆,出芽生殖,芽成串T M15菌落大,圆形,边缘整齐,低凸起,不透明,表面光滑,闪光,乳白色圆形/椭圆,出芽生殖T M16菌落大,圆形,边缘不齐,低凸起,较透明,表面光滑,闪光,乳白色椭圆,略长,出芽生殖T M20菌落中等,圆形,边缘整齐,高凸起,不透明,表面光滑,闪光,乳白色椭圆,出芽生殖T M22菌落大,圆形,边缘整齐,低凸起,不透明,表面光滑,闪光,灰白色椭圆,出芽生殖表2 耐高温酵母菌的复筛菌株温度/42444648 50 5254T M1++++++++---T M6++++++++++++++++-T M10+++++++++++++++-T M15++++++++---T M16++++++++++---T M20+++++++++++++--T M22++++++++---- 注:∀+#表示酵母菌生长情况,∀+#越多,表示生长越好,下同.27第3期 易 弋等:耐高温酒精酵母的筛选酵母菌的正常生长温度在30 左右,当温度超过35 时,其生长和发酵能力大大减弱[7].目前所筛选的耐高温酒精酵母一般在38~40 还有较高的酒精产率,如沈睿等人[8]筛选的耐高温酵母菌YH4.该菌的最适生长温度为35~38 ,最高生长温度为47 .从图中可以看出7株菌都能在46 下生长,说明它们均有一定的高温耐受性.TM6、TM10和T M20的耐高温能力要明显强于其他4株,其中TM6、TM10的耐高温能力最强,能在52 下生长;T M20次之,能在50 下生长.因此,选择这3株菌进行了后续的实验.2 2 部分发酵特性的测定通过筛选,得到了3株具有较强耐高温特性酵母菌.鉴于酵母菌的渗透压耐受性能、耐酸能力以及酒精耐受性在实际生产中是至关重要的,我们测定了3株菌在这几方面的能力,结果见表3、表4和表5.表3 初始糖浓度对各菌株生长的影响菌株葡萄糖含量/%203040505560TM6++++++++++++-TM10+++++++++++--TM20+++++++++++--表4 pH对各菌株生长的影响菌株培养基初始pH值4 54 03 53 02 52 0 TM6+++++++++++--TM10+++++++++++++++-TM20++++++++++++++-2 2 1 初始糖浓度对各菌株影响培养基中的糖浓度对酵母菌生长的影响非常大,糖浓度较低会使酵母菌因营养不足而生长缓慢,糖浓度过高又会因渗透压的增大而抑制酵母菌的增殖.提高初始糖浓度可以提高发酵醪的酒精含量,因此生产用的酵母菌都需要有一定的渗透压的耐受能力.从表3中可以看出当初糖浓度达到40%时,3株菌的生长均受到了明显的抑制.糖浓度达到50%时,生长变得缓慢.相对而言T M6对糖渗透压的耐受性要略高于TM10和T M20,它能在55%的初始糖浓度下缓慢生长.2 2 2 培养基pH值对各菌株生长的影响在酵母菌酒精发酵的实际生产当中,发酵醪液的pH值非常重要,因为较低的pH值可以抑制杂菌的生长,从而提高发酵的效率.酵母菌正常的生长pH在4 5~5 5之间,而如今某些糖蜜酒精厂为了防止发酵过程中杂菌的污染,已将发酵醪液的pH调低至3 2~3 4,这就要求生产菌有非常好的耐酸特性.从表4中可以看出pH4 0以上,3株菌的生长情况都非常良好.当pH降至3 5时,TM6受到了较严重的抑制,它最低生长的pH为3 0.而TM10和TM20的耐酸能力略强于TM6,能在pH2 5的培养基上生长.2 23 酒精对各菌株生长的影响在发酵过程中,酵母自身产生的酒精达到一定浓度时,会对酵母本身产生毒性,影响其生长、细胞发育,以及酒精发酵的能力[9],进一步提高酒精浓度,酵母的发酵便会停止.因此,酵母菌的酒精耐受能力对于能否大幅度的提高酒精发酵终浓度至关重要,是评价酒精酵母菌种好坏的重要指标.从表5可以看出,酒精对酵母菌生长的影响是非常明显的.当酒精浓度提高到5%时,3株菌的生长都受到了明显的抑制.TM10和TM20的酒精耐受性略强于TM6,在含酒精9%的培养基中表现出了微弱的生长.2 3 酒精发酵能力的测定测定了三株菌的部分发酵特性后,按1 5所述的方法比较了各株菌的酒精发酵能力,实验结果如表6所示.表5 酒精对各菌株生长的影响菌株培养基酒精浓度/%,v/v 35791113TM6+++++++---TM10+++++++++--TM20++++++++++--表6 发酵结果菌株酒精浓度/%,v/v残糖/g L-1总酸发酵时间/h30 40 30 40 30 40 30 40 TM66 825 870 380 265 234 854856 TM107 836 340 250 204 515 034452 TM207 226 810 300 345 024 774852从表6中可以看出不管在30 还是在40 下,3株菌对糖的利用率都较高,残糖的含量均低于0 4g/ L.从发酵时间来看,高温下的发酵时间比常温下略长,TM10的发酵速度最快,常温下在44h内就完成了发28广西工学院学报 第20卷酵.常温下TM 10的发酵酒精终浓度最高,达到了7 82%,发酵效率约为84 1%,是一株极具潜力的酒精酵母菌.虽然3株菌在40 下的发酵能力均明显逊于30 ,但值得注意的是TM 20在40 下的发酵酒精终浓度只比30 降低了约6%,是3株菌中降低幅度最小的.这说明TM 20体内与酒精合成相关的酶受高温的影响不大,是一株值得进一步研究的耐高温酒精酵母菌.3 结论经菌种富集、分离、纯化,从自然界中筛选到了3株具有较强高温耐受性的酵母菌TM 6、T M10和T M20.3株菌均能在50 的高温下生长,在耐渗透压、耐酸、耐酒精以及发酵能力方面各有优缺点.同前期的实验结果相比较,发现本次实验筛选出的酵母菌发酵能力均优于之前筛选出的菌株[4].经分析认为本次实验由于在筛选过程中加入了TT C 筛选,因此在初筛的时候就将发酵能力弱的菌株淘汰掉了,这说明TTC 的确是一种筛选酒精高产酵母菌的有效方法,值得推广和研究.虽然TM 20在高温下的生长情况不如TM 6和TM 10,而且常温下TM10的发酵能力也远高于TM 20,但TM20在高温下的发酵能力要明显优于T M6和T M10.此外TM 20在30 和40 下的发酵能力仅相差6%,这说明TM20的发酵能力受温度的影响不大,是一株有潜力的耐高温酒精酵母菌.在后续实验中,希望通过诱变、驯化等方法进一步提高其酒精发酵的能力.参 考 文 献:[1]王瑞明,关凤梅,马霞,等.固态发酵高产酒精酵母菌株的选育[J].酿酒科技,2002(1):20 21.[2]王灏,王航,孟春,等.基因组改组技术选育耐高温、耐高乙醇酿酒酵母菌株的研究[J].微生物学通报,2007,34(4):705 708.[3]毛志群,张伟,檀建新,等.高产酒精酵母的筛选及鉴定[J].食品与发酵工业,2003,29(3):50 53.[4]易弋,伍时华.酒精耐受性酵母菌的筛选[J].广西工学院学报,2008,19(3):42 46.[5]王梅,张彭湃,帅桂兰,等.T T C 在黄酒酵母选育中的应用[J].酿酒,2001,28(5):62 64.[6]王福荣.酿酒分析与检测[M ].北京:化学工业出版社,2005.[7]蒋亚平,蔡金芝,杨宝玉,等.耐高温酵母W VHY8的生物学特性及应用[J].微生物学通报,1992,19(6):328 331.[8]沈睿,诸葛健.固态发酵用耐高温酿酒酵母YH4的筛选及其特性研究[J].食品与发酵工业,1991,4(4):8 15.[9]Pina C,Couto J A ,Hogg T.Inferring ethanol tolerance of Saccharomyces and non Saccharomyces yeasts by progressive inactivation[J].Biotechnol Lett.,2004,26(19):1521 1527.Study on screening of thermotolerant yeast strainsYI Yi 1a ,LI Ya 1b ,RONG Yuan ping 1a ,LI Kai 2(1a.Biological &Chemical Engineering Department,1b.Science and Technology Department,Guangx i University of Technology,Liuzhou 545006,China;2.Sichuan College of Traditional Chinese Medicine,M ianyang 621000,China)Abstract:T hree thermotolerant yeast strains,T M6,TM 10and TM 20,w ere isolated from nature.T he results showed that the three strains can survive at 50 and fermentation would be restrained obviously at high tem perature.T he alcohol ferment strength of T M6w as better than the others at 30 and the alcohol concentration reached 7 82%(v/v).But the ferment strength of T M20was higher than TM 6and T M10at 40 .The alco hol concentration w as just reduced about 6%compared with the concentration at 30 .Key words:thermotolerant;alcohol fermentation;yeast;screening29第3期 易 弋等:耐高温酒精酵母的筛选。

诱变方法：预处理：将诱变所需的仪器设备在无菌操作台上灭菌，紫外灯预热30min，将磁力搅拌器的电压调至4V，将制备好的菌悬液倒入含有磁珠的平皿中，开启磁力搅拌器的电源开关，待菌体均匀混合后，开始诱变。

诱变：将菌悬液用一次性塑料针管吸取5ml于编号的试管中，将紫外灯对准平皿的同时开始记时，每10s取一次样于对应试管中，直至90s停止照射，则得到10种菌悬液。

后处理：将诱变之后的菌悬液依次稀释10倍、100倍，再进行涂布，每次2滴（约0.1ml）即可，再将未做稀释处理的诱变菌株的10种菌悬液依次涂布，再重复一次，10倍、100倍也做同样处理，共60个培养皿，涂好后，放入暗箱（防止光复活）培养箱于25℃培养24h。

分析方法：酵母生长的测定：测生长量，包括称干重法、比浊法、测含氮量法等。

记繁殖数，包括计数板法、菌落计数法等酵母死亡率的测定：耐酒精酵母筛选方法：灭菌麦芽汁→冷却为40℃左右→加入无水乙醇，配成浓度分别为4%vol、6%vol、8%vol、10%vol、11%vol、12%vol、14%vol→紫外照射后的平板→挑取大且光滑的单菌落→接种待测酵母菌→25℃培养24h→观察产气情况→记录结果→分离纯化测定时的菌种→保藏菌种→挑取单菌落→接种针点于TTC下层平板→30℃恒温培养24h→倒TTC上层平板→30℃恒温培养3h→找出TTC上层平板上变红的菌落（候选的突变体）→转接于固体斜面→30℃恒温培养24h→菌落形态观察与鉴定→显微形态的观察→挑出变红（深色）的单菌落→接种于麦芽汁培养基中→扩大培养→分离纯化菌种→不同温度条件下发酵7d→每隔24h测其pH 值、酸度，待发酵结束时测酒精度、耗糖率和总酸度。

镜检方法：用胶头滴管吸取摇匀的菌悬液滴到载玻片上，盖上盖玻片，先用低倍镜观察，待视野清晰之后换高倍镜观察，一般40倍物镜即可，若菌体较密集，则将菌悬液适当稀释，直至稀释度适合为止。

麦芽汁发酵法：初筛选出的菌株活化后，接入麦芽汁培养基中扩大培养酵母菌，使活菌浓度为1.6×108个/ml，然后取5ml接入装有150ml麦芽汁的锥形瓶中，30℃培养7d，每天对发酵液进行分析（可溶性固形物、糖度、酒精度、pH值和酸度）。