目录
1酵母菌的种类 (3)
2 选育技术 (4)
2.1 自然选育 (4)
2.2杂交育种 (4)
2.3原生质体融合育种 (4)
2.4诱变育种 (4)
2.5分子生物学育种 (5)
2.6基因工程育种 (5)
3鉴定及筛选 (5)
3.1 传统鉴定 (5)
3.2 现代分子鉴定 (5)
4 酵母的应用 (5)
4.1 食品工业上的应用 (6)
4.1.1 传统食品 (6)
4.1.2 调味剂 (6)
4.2医疗保健行业上的应用 (6)
4.2.1保健品和营养品 (6)
4.2.2制药 (6)
4.3饲料工业上的应用 (6)
4.3.1酵母培养物 (6)
4.3.2单细胞蛋白 (7)
4.3.3生产食用色素 (7)
4.4酿造工业上的应用 (7)
4.4.1酿酒 (7)
4.4.2制酱油、醋 (7)
5.展望 (7)
参考文献 (8)
酵母菌的研究概况
摘要：对酵母的种类及其育种技术、鉴定及筛选方法、行业中的应用情况等方面作了综述。
关键词：酵母菌；选育；鉴定筛选；生产应用
酵母菌(Yeast)是一类单细胞微生物,但不同于细菌,是一类以出芽生殖为主要繁殖方式的真菌,属真核微生物,yeast源自希腊语zestos,意思是“沸腾”，指酵母利用糖发酵产生二氧化碳形成泡沫的现象。
“酵母菌”这一名词不是分类学上的名词，而是一种习惯上的叫法。酵母菌这一微生物最早是由列文虎克在1680年观察酒精发酵液时发现的。1938年Schwann将此微生物命名为糖真菌(Sugerfungus)。1937年Meyen将葡萄酒酵母命名为Sacharomyces，迄今沿用为酵母属。在分类学上酵母菌属于子囊菌亚门(Ascomycotina)、担子菌亚门(Basidiomycotina)和半知菌亚门(Deuteromycotina)[l,2]。因此,给酵母菌下一个定义很难，目前认为具有以下特点的真菌即为酵母菌：(l)个体一般以单细胞状态存在；(2)多数出芽繁殖，少数裂殖；(3)能发酵糖产能；(4)细胞壁常含甘露聚糖；(5)喜在含糖量高、酸度大的水生环境中生活。
酵母菌广泛分布于自然界，主要生长在偏酸性含糖丰富的环境，必须以有机碳化物，主要是葡萄糖等单糖为碳源物质[3]，特别喜欢聚集于植物的分泌液中，如水果、蔬菜、花蜜、蜜饯上，在果园的土壤中也大量存在[4]。数千年来，酵母就和人类的日常生活有着紧密的联系，人们虽然没有见过酵母是什么样子，但却利用酵母的发酵能力来酿酒、发面。早在史前时期，人类祖先就从成熟的落果自然发酵现象中学会了酿酒，6000年前埃及人就有利用酵母菌生产酸啤酒的记载，公元前1200年，埃及建立了酿酒和制作面包的工艺技术。公元前1000年，我国已有蒸馏乙醇饮料的记载[5]。随着现代微生物学和生物技术的发展,酵母菌在我们的生活中变的越来越重要。
1酵母菌的种类
目前，国内外一般按产品的用途进行分类。根据酵母产品分为以下几大类：
（一）面包酵母类
包括鲜酵母（压榨酵母）和活性干酵母两类。根据面团含糖量的不同，又可分压榨酵母、活性干酵母和快速活性干酵母。
1.压榨酵母：采用酿酒酵母生产的含水分70～73%的块状产品。呈淡黄色，具有紧密的结构且易粉碎，有强的,发面能力。在4℃可保藏1个月左右，在0℃能保藏2～3个月产品最初是用板框压滤机将离心后的酵母乳压榨脱水得到的，因而被称为压榨酵母，俗称鲜酵母。
2.活性干酵母：采用酿酒酵母生产的含水分8%左右、颗粒状、具有发面能力的干酵母产品。采用具有耐干燥能力、发酵力稳定的醇母经培养得到鲜酵母，再经挤压成型和干燥而制成。发酵效果与压榨酵母相近。
3.快速活性干酵母：水分含量为4～6%。它是在活性干酵母的基础上,采用遗传工程技术获得高度耐干燥的酿酒酵母菌株，经特殊的营养配比和严格的增殖培养条件以及采用流化床干燥设备干燥而得。与活性干酵母相同，采用真空或充惰气体保藏,货架寿命为1年以上。
（二）酿酒用活性干酵母类
按产品的用途分为：酒精活性干酵母，白酒活性干酵母，葡萄酒活性干酵母，黄酒活性干酵母和啤酒活性干酵母等。其中白酒活性干酵母分为很少产酯的酒精活性干酵母和产酯能力较强的生香活性干酵母两类。
按发酵温度，酿酒酵母又可分为两类：常温活性干酵母，耐高温活性干酵母。
（三）药用酵母类
用糖蜜，粮食为原料，经啤酒酵母，葡萄酒酵母或产沅假丝酵母发酵，未经提取其他成分，
无发酵力的干燥菌体产品。
药用酵母一般作为饮食不合理引起的各种消化不良疾病的辅助治疗药剂，或者作为培养基使用，这主要是因其维生素及氨基酸含量丰富，有一定的营养和治疗作用。
（四）营养酵母类
营养酵母只要指高核酸酵母，高铁酵母，含硒酵母和含锌酵母等微量酵母。脱核算酵母菌体蛋白质含量在50%以上，是良好的蛋白质饲料添加剂。已经工业化的微量酵母有含铁酵母，含硒酵母和含锌酵母等酵母菌的生理功能，可作为功能性发酵制品，应用于特定人群的需要，用以补充人体需要的有机铁，硒和锌等微量元素。
（五）饲料酵母类
饲料酵母指利用农林废料及工业下脚料作原料，采用工业发酵方法而制的的酵母，主要用于饲养牧畜和家禽，这是开发的蛋白饲料资源的发展方向，可为饲料工业提供更多的蛋白饲料[6]。2选育技术
从上世纪中叶开始，随着科技的进步，一些选育方法也应运而生并且逐步得到发展和应用，除了传统的自然分离选育以外，杂交育种、原生质体育种、诱变育种、生物分子学育种、基因工程育种都是当前最普遍的育种手段。
2.1自然选育
即不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程。自然突变被认为是由多因素低剂量的诱变效应引起的，主要是自然环境中存在着低剂量的宇宙射线、各种短波辐射、低剂量的诱变物质和微生物自身代谢产生的诱变物质等的作用引起的突变。这样的突变使得野生的酵母菌天然具有某种较突出的特性(例如耐酒精、降酸等)。通过富集培养以及驯化之后，在一定程度上可以达到纯化菌种，防止菌种退化，稳定生产，提高产量的目的。
尽管如此，但由于自发突变几率很低，只靠从群体中筛选出个别有价值的优良突变体的机会很少，因此从自然界直接筛选的野生酵母，很难具有所要求的复杂的理想特性，需要进一步的人工干预，才能达到目的。
2.2杂交育种
杂交育种是指不同种群、不同基因型的个体间进行杂交，并在其杂种后代中通过选择而育成纯合品种的方法。酵母菌的杂交主要通过有性杂交，利用两种不同结合型的单倍体菌株或子囊孢子进行。有的酵母如假丝酵母等不能进行有性繁殖，即不产生子囊孢子，它们的杂交与霉菌一样，是通过准性生殖进行的。
CORTE-REAL M等以能够将L-苹果酸作为唯一碳源和能源的异常毕赤酵母（Pichia anomala）为出发菌株，将抗葡萄糖阻碍的单倍体与相反结合型的单倍体杂交，获得了能够在酒精发酵进行同时降解苹果酸的双倍体酵母[7]。
杂交育种是选用已知性状的供体和受体菌种作为亲本，消除了菌株在经历长期诱变后所出现的产量性状难以继续提高的障碍。因此不论在方向性还是自觉性方面，都比诱变育种前进了一大步。但由于杂交育种的方法复杂，工作进度慢，因此还很难像诱变育种那样得到普遍的推广和应用。
2.3原生质体育种
原生质体育种又称为细胞融合技术，是指两种不同的菌株经酶法去壁后，得到的原生质体(球)，置于高渗溶液中，在一定融合剂的促融作用下使两者相互凝集并发生细胞之间的融合，进而导致基因重组，获得融合了亲本优良胜能的新菌株的育种方法。这种技术既可以在属内进行也可以在属间进行。Gonzalez等人曾报道过一些重要的工业用酿酒酵母菌就是自然界中属间杂交的结果[8]。
此技术具有杂交频率较高、受接合型限制较小、遗传物质完整等优点，但是，由于所获得的融合子其遗传稳定性较差，通常理想特点的表达是偶然的。
2.4诱变育种
诱变育种采用，如亚硝基胍、甲基磺酸乙酯、紫外线、γ射线[9]、重离子辐射[10]等理化因素对酵母菌株进行处理，然后从中筛出正突变的菌株。因诱变具有随机性，而筛选则是定向的，因此筛选工作显的尤为重要，一个高效的筛选方法使育种的成功率和效率都大大提高了，否则如大海捞针，事倍功半。从方法上讲，它具有简便易行、条件和设备要求较低等优点，故至今仍有较广泛的应用[11]。
2.5基因工程育种
基因工程育种是把某一生物体的遗传物质片段克隆或插入到酵母菌基因的特定位置中，实现DNA重组，使理想的外源DNA片段在受体细胞内得到表达，并稳定遗传而不改变受体原有特性的一种技术。
自上世纪90年代以后，已有多种有效的质粒载体和基因转移方法,选择性标记、用于外源基因在酵母体内表达和产物分泌的表达和分泌盒研制成功，例如Thai等人通过DNA微矩阵分析发现某些与核糖体蛋白相关的基因在酒精适应菌中明显增加了，而在线粒体中与ATP合成相关的基因在酒精胁迫环境下对酵母菌的生长有重要影响，这些分析有助于我们理解酵母菌的酒精耐受性[12]。因此这些工具的发展也为基因工程菌的构建做好了铺垫。
在研究中发现，当一个或者几个已知基因编码优良特征时，基因工程菌的构建是容易且可行的。例如有人构建了具有果胶降解、葡聚糖降解和木聚糖降解能力的酿酒酵母,使葡萄酒澄清变得容易且不必再使用昂贵的酶[13]。构建能够充分表达甘油一3一磷酸脱氢酶GPDI基因的高产甘油酵母菌,即可酿造出低醇的兼有圆润酒体香的葡萄酒[14]。
3鉴定及筛选
3.1传统鉴定
传统酵母菌的分类鉴定主要采用形态学、生理学及生物化学特征进行鉴定工作。一般要经过形态观察，生理生化试验，再查索引表来确定所测菌株的种属。需进行大量重复性试验，而且试验条件稍有所变化就会影响试验的重现性，使结果难以确定。加之大部分菌株的种类多、分类广、形态特征简单，一些形态特征和生理生化指标甚至还会随环境变化而不稳定，所以难以准确判断，常发生意见分歧，引起分类系统的不稳定[15]。随着生物技术的飞速发展，传统的微生物鉴定方法常常难以鉴定众多的生长习性复杂的微生物，因而基于基因组序列的分子鉴定受到广泛关注。
3.2现代分子鉴定
分子分类学方法主要以核酸作为研究对象，研究的是基因型，而不是表现型，因而能反映其遗传本质。分子分类方法稳定性好，易确定同源关系，便于计算机分析，因而提高了鉴定准确度，加快了鉴定速度。近年来，随着分子生物学的发展而产生了很多鉴定酵母菌的新方法[16]：（l）等位酶分析；（2）DNAG+C摩尔百分含量分析；（3）DNA-DNA杂交；（4）染色体核型分析；（5）DNA微卫星分析；（6）巢式PCR（polymerase Chain Reaction）扩增；（7）DNA的RAPD （Random Amplified Polymorphic DNA）分析；（8）染色体DNA的RFLP（RestrictionFragment Length Polymorphism）分析；（9）线粒体DNA的RFLP；（10）rRNA基因5.8S-ITS区域的PCR-RFLP；（l1）rDNA序列分析；（12）显微傅里叶变换红外光谱分析；（13）T-RFLP(Terminal-Restriction fragment Length Polymorphism)；（14）酵母菌胞壁甘露聚糖核磁共振氢谱；（15）可溶性蛋白质凝胶电泳；（16）脉冲电泳核型分析。
白逢彦等[17]利用脉冲电泳核型分析对酿酒酵母进行分类。研究表明，反映染色体条数和每条染色体DNA分子大小的脉冲电泳核型分析技术，可作为酿酒酵母及相关菌种分类的辅助手段。染色体组成多态性的存在虽然使脉冲电泳核型分析在种内菌株间遗传差异的显示上具有一定的价值，但却影响了其作为中间鉴别特征的直观性。因此，该技术在分类学研究中的应用，应以形态、生理生化特性等形状为基础。李明霞等运用核磁共振氢谱（PMR谱）对各类酵母的胞壁甘露聚糖进行比较研究，证明酵母胞壁多塘PMR谱型相似程度的比较是分类上较有意义的性状，有助于探讨亲缘关系，核实完全型与不完全型也有助于对疑难菌株的分析。
4酵母的应用
由于酵母菌个体大，蛋白质含量高易分离，杂食性强易培养，代谢产物多，综合利用广等特
点，在现代工业中如食品、医疗保健、饲料、酿酒等行业中都有广泛的用途。
4.1食品工业上的应用
4.1.1传统食品
酵母在发酵时利用原料中的葡萄糖、果糖、麦芽糖等糖类及a-淀粉酶对面粉中淀粉进行转化后的糖类进行发酵作用，产生CO2，使面团体积膨大，结构疏松，呈海绵状结构；改善面包的风味。发酵后的面包与其他各类主食品相比，其风味自有特异之处。在面团制作过程中，酵母中的各种酶对面团中的各种有机物发生的生化反应，将高分子的结构复杂的物质变成结构简单的、相对分子质量较低能为人体直接吸收的中间生成物和单分子有机物，如淀粉中的一部分变成麦芽糖和葡萄糖，蛋白质水解成胨、肽和氨基酸等生成物。这对人体消化吸收非常有利，提高了谷物的生理价值。酵母本身蛋白质含量甚高，且含有多种维生素，使面包的营养价值增高[18]。
4.1.2调味剂
由于酵母可以生产富含十多种氨基酸、肤、呈味核昔酸、维生素多种微量元素的天然调味品, 产品不仅滋味鲜美，而且营养丰富，是集调味、营养两大功能于一体的天然食品。将酵母的自溶物，即由酵母菌细胞内的酶降解酵母菌中的大量大分子，如蛋白质和核昔酸等，用于生产增味剂，如谷氨酸和肤类等。酵母工作者采用酵母菌自溶法制成了一系列酵母提取物和美味调味品、即酵母精[19]。酵母精具有强烈的呈味性能，是理想的风味增强剂，能赋予食品浓厚的滋味，与其他天然调味料配合效果尤佳。酵母菌还有缓和酸味、去除苦味、屏蔽咸味及异臭的效果[20]。
4.2医疗保健行业上的应用
4.2.1保健品和营养品
酵母是一种很好的保健品。可用于治疗消化不良和B族维生素缺乏症。在人体衰弱时，能提高肌肉紧张力及调整被破坏的新陈代谢方面都有特殊的效果。在保健功能上，可以健脑、健胃、美容、解酒、预防肝坏疽，改善肝胀功能和延缓衰老等。研究表明，SOD广泛分布于动植物及微生物细胞内，是超氧阴离子自由基的清除剂作为药用酶它能防治氧自由基伤害导致的某些疾病，其抗辐射，抗肿瘤、抗疾病及抗衰老作用已引起国内外学者的高度重视。并且干酵母在医药上又称“食母生片”，主要健胃及消化的药物。酵母片能促进食物在胃肠道的消化和吸收。临床上多用于肝脏疾病。此外常用于胃炎、消化不良及各种胃肠功能不好的患者,以健胃、健脾和助消化。
酵母菌也广泛用于营养品。酵母菌中含有丰富的蛋白质、矿物质、B族维生素和少量甘油三脂等，从营养观点看,它是很有发展前途的。世界上一些国家以及我国在60年代困难时期，曾利用碳氢化合物培养酵母制造人造肉，但在经济上并不合算,多数已停产。然而，酵母仍然是一种很好的食物添加剂，可以补充平时膳食营养中的不平衡。用干酵母制剂补充B族维生素营养,也是常用的膳食补充物。此外，在微生物培养中，酵母菌提取物是广泛使用的营养来源之一。
4.2.2制药
我国医学早在几百年前就用酵母来治疗疾病，中医药名为神曲，它是面粉、熬皮加药物经过酵母菌混合酵制而成。它是一种酶类消化药，主治消食、化积、健脾、行气、上泻、解表等。那么，由于酵母本身所具有的特点，如啤酒酵母具有生长繁殖，新陈代谢完整的生命功能且它的细胞内除了含有多种生物活性物质外,还含有许多完整的酶系,所以酵母是提取多种生化药物的宝贵资源。能够提取凝血质、麦街醇和卵磷脂；制取核酸、核昔酸、核昔类药物；制取谷胱苷肽。
此外，由于酵母中含有2%的B族维生素，所以还可以用酵母细胞提取维生素C、细胞色素、辅酶A、酵母多糖和核糖核酸等多种产品。
4.3饲料工业上的应用
4.3.1酵母培养物
酵母培养物（YC），其应用源于20世纪20年代中期，是一种含有酵母菌赖以生长的培养基经酵母培养生物转化的产品。它营养丰富,含有维生素、矿物质、消化酶、促生长因子和较齐全的氨基酸，适口性好，是集营养、保健为一体的生物活性添加剂。
大量的研究表明，酵母细胞可以提高反当动物对饲料干物质，纤维素、半纤维素、蛋白质等有机物和磷酸的消化率，改善粗饲料的适口性,预防和治疗腹胀，腹泻等消化不良，促进病胃肠发育和功能的恢复提高，进而增强机体的免疫力。其作用的实质是酵母菌的作用，家畜酵母的摄人量增加及其在胃肠道上的大量繁殖，有效地改善了胃肠环境和菌群结构。从而促进有益菌群的有效浓度，增进整个胃肠道对饲料养分的分解、吸收和利用。同时，有效抑制病源微生物的繁
殖，增强机体免疫力和抗病力。
4.3.2单细胞蛋白
单细胞蛋白（SCP）是从含蛋白质的微生物中获取的蛋白质。蛋白质含量高达85%，在畜牧业一直作为单细胞蛋白而被广泛使用。马现永等研究表明，酵母氨基酸的含量也较高，将中国饲料数据库中标准的“啤酒酵母”与“国产鱼粉”蛋白质、氨基酸相比较。“啤酒酵母”的粗蛋白、限制性氨基酸与“国产鱼粉”相近，因此酵母可作优质蛋白源可部分或全部代饲料中的鱼粉。
由于酵母菌本身的特点，含有丰富的生理活性物质及分泌多种酶，如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶等，因而酵母可加强对营养物质的消化利用，促进生长，增加食欲，从而增强抵抗各种疾病的能力，且提高产蛋率和繁殖性能。生产单细胞蛋白应选生长速度快、产量高、遗传性状稳定、营养要求简单、细胞本身蛋白质含量高的酵母。
4.3.3生产食用色素
酵母产生的食用色素中最多的是类胡萝卜素，类胡萝卜素在动物和人体中有重要的代谢功能。由于动物本身不能合成，这种色素必须从食物中摄取。常见的产色酵母菲氏酵母、红酵母、隐球酵母和掷胞酵母等。
4.4酿造工业上的应用
4.4.1酿酒
（1）啤酒酿造
啤酒酿造是以大麦、水为主要原料，以大米或其它未发芽的谷物、酒花为辅助原料；大麦经过发芽产生多种水解酶类制成麦芽；借助麦芽本身多种水解酶类将淀粉和蛋白质等大分子物质分解为可溶性糖类、糊精以及氨基酸、肽、胨等低分子物质制成麦芽汁；麦芽汁通过酵母菌的发酵作用生成酒精和CO2以及多种营养和风味物质；最后经过过滤、包装、杀菌等工艺制成CO2含量丰富、酒精含量仅3%～4%、富含多种营养成份、酒花芳香、苦味爽口的饮料酒即成品啤酒[21]。（2）果酒酿造
果酒酿造是以多种水果如葡萄、苹果、梨、桔子、山楂、杨梅、猕猴桃等为原料，经过破碎、压榨，制取果汁；果汁通过酵母菌的发酵作用形成原酒；原酒再经陈酿、过滤、调配、包装等工艺制成酒精含量8.5%以上、含多种营养成分的饮料酒称为果酒。在各种果酒中葡萄酒是主要品种，其产量居世界第二位饮料酒种[22]。
4.4.2制酱油、醋
为使酱油成品形成良好的风味，发酵过程中添加鲁氏酵母、拟球酵母。在酱醒特殊的环境中繁殖和发挥作用的酱油酵母的耐盐性、抗渗透性很强，鲁氏酵母除生成乙醇外，还在高盐状态使糖类生成多元醇,即丙三醇、阿拉伯糖醇、赤鲜糖醇等醇。这些物质对酱油香味的形成起到重要的作用，且具有浓郁的酒香气。由此可见，酵母在酱油加工过程中起不可代替的作用。
5展望
酵母的选育是科学性、实践性很强的工作，是一项复杂的系统工程。目前国内虽然有不少科研人员对各地酵母进行研究，但其研究主要集中在对酵母的分类鉴定及酿造性能的测试阶段，对酵母的研究还不够系统、深入，很少有正式投入生产使用的，整体水平较国际先进水平存在较大差距。对我国不同酵母菌的选育与发酵动力方面的研究，是我国酵母产业自主创新的重要方向。
当今世界食品发展的潮流是保健食品，即不仅具有食品色香味，而且还具有调节人体生理功能的作用。从酵母菌发酵食品特点来看，酵母菌发酵食品属于保健食品，符合时代要求。因此，有强大的生命力和广阔的前景。应最大程度利用酵母菌发展产品的优势，研究开发更多的新型品种，使之投放市场。利用酵母菌开发更多的有利于人体健康的食品，应用高新技术开发酵母菌在食品上得使用。这对于突出酵母产品风格特点、增强产品市场竞争力具有关键作用，是我国酵母产业发展的客观要求，对提高我国酵母产业综合竞争力具有重大意义。
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毕赤酵母表达系统研究进展 作者：齐连权， 陈薇， 来大志， 于长明， 王海涛 作者单位：军事医学科学院微生物学流行病学研究所,北京,100071 刊名： 中国生物工程杂志 英文刊名：JOURNAL OF CHINESE BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2002,22(6) 被引用次数：11次 参考文献(21条) 1.Trinh L;Noronha S B;Fannon M Recovery of mouse endostatin producedby Pichia pastoris using expanded bed adsorption[外文期刊] 2000(04) 2.查看详情 3.Barr KA;Hopkins S A;Sreekrishna K Protocol for efficient secretion of HSA developed from Pichia pastoris 1992 4.Cereghino J L;Cregg J M Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[外文期刊] 2000(1) 5.Kjeldsen T;Pettersson A F;Hach M Secretory expression and characterization of insulin in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(29) 6.Bewley M C;Tam B M;Grewal J X ray crystallography and massspectroscopy reveal that the N lobe of human transferrin expressed in Pichia pastorisis folded correctly but is glycosylated on serine 32 [外文期刊] 1999(08) 7.Kalidas C;Joshi L;Batt C Characterization of glycosylated variantsof beta lactoglobulin expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(03) 8.Briand L;Perez V;Huet J C Optimization of the production ofa honeybee odorant binding protein by Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03) 9.Rydberg E H;Sidhu G;Vo H C Cloning mutagenesis and structural analysis of human pancreatic alpha amylase expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03) 10.Guo R T;Chou L J;Chen Y C Expression in Pichia pastoris andcharacterization by circular dichroism and NMR of rhodostomin[外文期刊] 2001(04) 11.Zani M;Brillard Bourdet M;Lazure C Purification and characterization of active recombinant rat kallikrein rK9[外文期刊] 2001(02) 12.ChirulovaV;Cregg J M;Meagher M M Recombinant protein production in an alcohol oxidase defective strain of Pichia pastoris in fed batch fermentations[外文期刊] 1997 13.Hasslacher M;Schall M;Hayn M High level intracellular expression of hydroxynitrile lyase from the tropical rubber tree Hevea brasiliensis in microbial hosts[外文期刊] 1997(1) 14.Takahashi K;Takai T;Yasuhara T Effects of site directed mutagenesis in the cysteine residues and the N glycosylation motif in recombinant Der f 1on secretion and protease activity[外文期刊] 2001(04) 15.Boado R J;Ji A;Pardridge W M Cloning and expression in Pichia pastoris of a genetically engineered single chain antibody against the rat transferrin receptor[外文期刊] 2000(06)
毕赤酵母表达实验手册 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。 与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制
西安交通大学科技成果——富硒酵母及其富硒食品饮料 项目简介 硒是维持人和动物生命话动和正常生理功能所必需的微量元素之一，具有抗癌，保护心肌等复杂的生理功能。缺硒时，机体免疫功能降低，易发生各种缺硒疾病。已知有40余种疾病与缺硒有关，常见的如克山病、大骨节病、高血压、缺血性心脏病、肝硬化、胰腺炎、纤维瘤、癌症、肌瘤、糖尿病、白内障等。由于抗肿瘤效果显著，被誉为“抗癌之王”。 我国72%面积是缺硒地区，人体普遍缺硒。目前医疗用的硒补充剂是亚硒酸盐，但亚硒酸盐不能通过饮食补硒，过量摄入会中毒。硒在人体和酵母细胞内的存在方式是有机硒，不会导致中毒。 本项目提供硒酵母的生产和相关硒酵母食品的制造技术。富硒酵母是有机硒最好的补充剂之一，可以直接作为保健品，也可以作为饲料或食品添加剂。由于自然界生物富硒能力有限，现有富硒酵母生产成本较高。本技术筛选到一株高耐硒酵母，同时构建了一株人工酵母，均具有更高更强的有机硒转化能力，酵母总硒含量均优于国标。 产品性能优势 1、天然酵母富硒量：700μg/g 2、人工酵母富硒量：1000-1200μg/g 市场前景及应用 国家食品安全检测新标准（2013年6月1日实施）中，将原来作为重金属控制的硒元素检测取消了，专家解读此举是因为我国大部
分地区是缺硒地区或者低硒地区，人们身体内是缺硒的。因此安全富硒食品的大面积上市只是时间问题。随着人们保健意识的加强，富硒食品将会成为家喻户晓的新概念。目前尚未见有类似产品上市。 创新点 （1）将无机硒元素通过我们的专利酵母转化为对人体安全的有机硒形式，可以实现安全的食品补硒。 （2）通过特殊的培养方法，大大提高了酵母细胞内的有机硒含量。 （3）可以添加于固体食品和饮料，开发大量富硒产品。 技术成熟度中试 目前酵母粉制作已达到工艺阶段，饮料添加实验正在小试。 合作方式技术转让 合作条件：企业必须具有或自行建设发酵厂房。
Pichia酵母表达系统使用心得 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 甲醇酵母部分优点： 1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达； 2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，表达产物可以达到每升数克的水平； 3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系 统简单，非常适合大规模工业化生产； 4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化； 5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以用工业甲醇替代葡萄糖作为碳源，生产成本低。 产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以分泌表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。 第一步——构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的
黄芩苷的提取 黄芩苷（Baicalin）是从黄芩根中提取分离出来的一种黄酮类化合物,具有显著的生物活性，具有抑菌、利尿、抗炎、抗变态及解痉作用，并且具有较强的抗癌反应等生理效能。在临床医学已占有重要地位。黄芩苷还能吸收紫外线，清除氧自由基，又能抑制黑色素的生成，因此既可用于医药，也可用于化妆品，是一种很好的功能性美容化妆品原料。 1 仪器与试剂 1.1 仪器 1000烧杯1 250ml烧杯2 铝锅1 50ml容量瓶5 漏斗1 紫外分光计1 纱布1 1.2 试剂 黄芩饮片乙醇盐酸 2 黄芩苷含量测定的方法 2．1标准曲线的绘制精确称取黄芩苷标准品50mg，用50%乙醇溶解并定容于100ml容量瓶，配制0。5mg/ml黄芩苷标液，分别吸取标液0。5，1。0，1。5，2。0，2。5，3。0，3。5，4。0ml于100ml容量瓶中，用50%乙醇定容，紫外可见分光光度计278nm处测吸光值，得到吸光度－浓度回归曲线为y＝0。064x－0。0102，r2＝0。9982。 2．2样品含量的测定精确称取实验所得黄芩苷粗品50mg用50%乙醇溶解定容于100ml容量瓶。用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，吸取续滤液2。5ml于100ml容量瓶中，用50%乙醇定容。另取50%乙醇作空白，于278nm波优点测吸光度，由回归方程式计算出对应浓度，按下式计算黄芩苷含量。 黄芩苷含量（%）＝［对应浓度（μg/ml）×100×40］/样品重（mg） 3.实验步骤 黄芩苷的提取方法参考胡应权的方法，黄芩→粉碎→称取黄芩粗粉20g→加水煎煮→趁热分离出滤液→40℃下加盐酸调pH1～2→80℃下保温→静置→分离出沉淀→洗涤干燥→黄芩苷粗品，其含量用紫外分光光度法测定。按下式计算黄芩苷收率：黄芩苷收率（%）＝M/M0×100%式中：M－所得黄芩苷粗品重量M0－提取时用黄芩的重量 不同溶媒不同溶媒剂量不同提取时间和次数都对黄芩苷提取有影响。 3.1 不同溶媒对黄芩苷含量的影响：将提取次数固定为1 次，溶媒倍量固定为10倍（重量比），提取时间固定为1h，分别以7006、950,6的乙醇及水为溶媒进行提取，考察不同溶媒对黄芩苷含量的影响，结果详见表1。 表1 不同溶媒对黄芩苷含量的影响 —————————————————————————— 溶媒种类黄岑苷含量(mg/ml) —————————————————————————— 水提取 70%乙醇 9596乙醇 —————————————————————————— 3.2 不同溶媒倍量对黄芩苷含量的影响：将提取次数固定为1次，提取时间固定为1h，分别以8、10、12、14、16倍于黄岑粉的水进行提取，考察不同溶媒倍量对黄芩苷含量的影响，结果详见表2。
我国富硒产品硒含量国家标准和行业标准 来源：日期：2018-05-11 【字号：大中小】 食品中硒限量卫生标准(GB 13105—1991) 1992年3月1日实施的中华人民共和国GB 13105—1991《食品中硒限量卫生标准》中,规定了食品中硒的最大允许限量标准,此标准适用于粮食、豆类及制品、蔬菜、水果、肉类、肾、鱼类、蛋类、乳类等食品,但是该标准被2005年颁布的GB 2762—2005《食品中污染物限量标准》所代替并废止,而硒的限量规定则于GB 2762—2012《食品中污染物限量标准》中被取消。 富硒茶(NY/T 600—2002) 中华人民共和国发布的农业行业标准富硒茶(NY/T 600—2002)规定在富硒区土壤上生长的茶树新梢的芽、叶、嫩茎,经过加工制成的,可供直接饮用的,含硒量符合本标准规定范围内的茶叶。标准规定富硒茶硒含量范围为0.25~4.00 mg/k g,含硒量的测定按GB/T 12399的规定执行。同时该标准对质量要求、检验规则、标志、包装、运输和贮存等要求作了规定。 富硒稻谷(GB/T 22499—2008) 富硒稻谷国家标准(DB/T 22499—2008)规定,样品加工成GB 1354规定的三级大米,按GB/T 5009.93执行。富硒稻谷加工的大米检验结果硒含量在0.04~0.3
0 mg/kg之间的,判定为富硒稻谷;检验结果硒含量小于0.04mg/kg 的,判定为非富硒稻谷;检验结果硒含量大于0.3 mg/kg的,判定为含硒量超标稻谷,不应食用。 饮用天然矿泉水标准(GB 8537—2008) 中华人民共和国饮用天然矿泉水标准(GB 8537—2008)规定饮用天然矿泉水为从地下深处自然涌出的或经钻井采集的,含有一定量的矿物质、微量元素或其他成分的水。水源地要求按GB/T 13727执行,硒的含量范围应在0.01~0.05 mg/ kg。 预包装食品营养标签通则(GB 28050—2011) 预包装食品营养标签通则(GB 28050—2011)只对预包装食品的营养标签标示有效,使用预包装标示的富硒食品,在营养成分表中除了应标示强制要求标示的营养成分外,还应标示硒营养的含量值及其占营养素参考值(NRV)的百分比。预包装食品中能量和营养成分的含量应以每100 g和(或)每100 mL和(或)每份食品可食部分的具体数值来标示。硒的营养参考值(NRV)为50 μg,要在预包装食品营养标签中标示高或富含硒元素应达到如下要求:固体食品满足每100 g 中硒含量≥30%NRV(即硒含量≥150 μg/kg),液态食品满足每100 mL中硒含量≥15% NRV (即硒含量≥75 μg/L)。 食品营养强化剂使用标准(GB 14880—2012)
黄芩苷和黄芩素的最新提取方法与应用研究 摘要黄芩苷和黄芩素是中药黄芩的重要单体,具有多种功效，在抗菌、抗病毒、保肝、利胆、抗癌、抑制炎症反应等方面具有较高的应用价值。本文就两者的新提取工艺和新的应用进行概述,为黄芩的进一步开发和应用提供参考。 关键词黄芩苷黄芩素提取方法药理作用 Recent review in extraction techniques and pharmacological study of Baicalin and Baicalein Li Xue , Guo Yan-xia，Ren Hui-xia (Department of Pharmacy，Shandong University. Ji Nan，Shandong，China) ABSTRACT Baicalin and Baicalein are important components of traditional Chinese herb ,Scutellariae Radix ( HuangQin) , and have various efficacies , including antibacterial , antivirus , antiinflammation , protecting the liver function , antitumor , and show good values in clinical application. This article reviews latest developments in their extraction techniques and pharmacological action and provides theoretical evidences for exploiting of Scutellaria . KEYWORDS Baicalin ;baicalein ; extraction techniques ;pharmacological study 黄芩为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根，具清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎之功效。现代药学研究证明，黄芩含有多种黄酮类化合物，其中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素是主要有效成分[1]，其黄芩苷和汉黄芩苷的苷键被水解厚,即产生葡萄糖醛酸和苷元（黄芩素和汉黄芩素），传统上通常以黄芩苷作为中药黄芩的标志性检测物和主要研究对象，但近年来研究发现黄芩素（黄芩苷元）在临床上有更好的药理活性，如抗菌、抗病毒、保肝、利胆、抗癌、抑制炎症反应等，因此本文将两者最新的提取方法与药效分别汇总，为工业生产与临床用药提供参考。 1.黄芩苷提取新方法 黄芩苷的提取工艺很多，过去主要有浸渍法、渗滤法、煎煮法、回流提取法和加碱温浸法等。但都存在提取时间长、效率不高、溶剂消耗量大、操作烦琐、过滤困难等缺点。随着提取和分离技术的不断提高，黄芩苷的提取方法也发生很大的变化，主要概括如下： 1.1 超声提取 超声能产生空化效应,具有粉碎、搅拌等特殊作用,使黄芩植物组织在溶剂中瞬时产生的空化泡的崩溃,而使组织中的细胞破裂,以利于溶剂渗透到植物细胞内部,使细胞中的黄芩苷成分进入水溶剂之中,加速相互渗透、溶解,以增加黄芩中的主要成分黄芩苷在水中的溶解度。郭孝武等[2]研究了不同频率超声对提取黄芩苷成分的影响,比较在同一提取时间, 频率分别为20, 800, 1100 KHz 时从中药黄芩中提取黄芩苷成分的得率, 以20 KHz 下得率最高, 认为原因是该频率下超声空化效应强, 加之粉碎化学效应, 有利于有效成分转移和黄芩苷与水的混合。但超声波法对设备的要求较高,实现工业化生产,成本较高。
毕赤酵母表达实验手册 作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［1］。 同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。 甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主
摘要 硒元素在机体功能方面具有极其重要的地位，富硒酵母是目前比较理想的有机硒来源，随着人类对富硒酵母的研究越来越深入，富硒酵母已被广泛地应用到人类日常食品、预防和治疗疾病以及动物养殖业等领域。本文中对富硒酵母做一简单介绍。 关键词:富硒酵母；食品；用途 1 硒的生理功能 硒是人体红细胞谷胱甘肽过氧化物酶的重要组成成分，其主要作用是参与酶的合成，保护细胞膜的结构与功能免遭过度氧化与干扰，具有许多重要的生理功能。硒的生物学功能是多方面的，主要通过硒酶和硒蛋白再发挥作用，抗氧化性是硒的最重要的生物学功能之一。 （1）抗氧化作用。硒是谷胱甘肽过氧化物酶的重要组成成分，在体内特异地催化还原谷胱甘肽与过氧化物的氧化还原反应，如过氧化氢、超氧阴离子、羟游离基、脂酰游离基，从而保护生物膜免受损害，维持细胞的正常功能。硒的抗氧化作用主要通过GSH-Pxl酶促反应清除脂质过氧化物。硒在人体生长繁殖功能上与维生素E的作用相类似，对维护组织弹性，延缓不饱和脂肪酸的氧化，防止早期衰老均有积极作用。硒对过氧化物酶的抗氧化能力要比维生素E高出500倍。硒与维生素E构成了动物机体抗氧化的两条防御途径，两者共同发挥作用，硒可与维生素E抗氧化作用相互补充。维生素E控制着磷脂上不饱和脂肪酸不被氧化，成为抗氧的第一道防线。硒以GSH-Px的形式催化脂质过氧化物的还原，在整个细胞中将过氧化物迅速分解成醇和水，使细胞中的膜结构免受过氧化物的损害，起第二道防线的作用。 （2）抗衰老作用。硒作为必需微量元素，一方面作为体内有害自由基的清除剂，并防止体内氧化损伤；另一方面，在一定条件下，硒的化合物由可作为产生活性氧自由基的催化剂。在不同的条件下，硒化合物既能清除自由基，又能产生自由基，视其在研究体系或体内的浓度而定：在较低的浓度下，硒主要表现出对活性氧自由基的清除作用；而在较高浓度下，硒主要表现出活性氧自由基的催化作用。衰老是机体组织中持续进行的自由基反应而引起的有害物质积累的结
酵母硒和蛋氨酸硒的特点与优 劣比较
酵母硒和蛋氨酸硒的特点与优劣比较
酵母硒和蛋氨酸硒的特点与优劣比较
万建美（四川农业大学动物营养研究所）
1
不同硒源吸收方式与效率
多种形式的硒在小肠中均能被高效地吸收，吸收率高达 98%，如硒酸盐。硒代半
胱氨酸和硒代蛋氨酸通过氨基酸主动转运载体机制被吸收。亚硒酸盐则通过简单扩
散作用吸收，而硒酸盐则与硫酸盐共同使用钠离子介导的转运载体被吸收。
有机硒（氨基酸螯合硒、硒代蛋氨酸、以及小麦和酵母中的有机硒）均有较高的吸
收效率。硒酸盐的吸收效率比亚硒酸盐高，但是硒酸盐和亚硒酸盐中的硒的吸收效
率均高于单质硒。
由于瘤胃中微生物的作用，亚硒酸盐和硒酸盐形式的无机硒容易被还原为不溶于水
的单质硒颗粒，因此反刍动物（牛和羊）对无机硒的利用率较低。当饲粮中硫、铅、
苜蓿及生氰糖苷含量很高，同量饲粮中钙水平过高或过低时，反刍动物对硒的吸收
率降低。
2
硒吸收后的转运
硒被肠道吸收后，血浆中约 65%以上的硒是以硒蛋白 P 的形式存在，并被转运到
其它组织。
但是有机硒与无机硒在转运过程中存在差异。无机硒更多地与谷胱甘肽过氧化物酶
的形式存在，而有机硒则主要沉积到组织蛋白中。
3
蛋氨酸硒（硒代蛋氨酸）
由于化学合成反应的工艺条件复杂，设备规模大、管理难，环保要求严，且生产成
本高，因此国内外都没有达到中试实验生产规模，目前硒代蛋氨酸国内外尚无专业
的硒代蛋氨酸生产厂家，尚未工业化生产。 3.1 硒代蛋氨酸的分子结构式
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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。 表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。 蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分 制作者：陈苗商汉桥
毕业论文开题报告 生物工程 富硒酵母的驯化研究 一、选题的背景、意义 硒是人体所必需的微量元素,具有重要的生理功能,它能够预防和抑制肿瘤、抗衰老、维持心血管系统正常的结构与功能,预防动脉硬化和冠心病的出现。[1]在我国有近3/4 的地区缺硒，生物体内的硒都来源于蔬菜、水果等，但这些天然食物中硒含量普遍较低，一般不足0.01μg/g，很难满足中国营养学会1988 年推荐的成人硒日摄入量50μg。[2]因此在食品中添加硒很有意义，也非常有必要。 研究表明,有机硒在生物体内停留时间较长,在人体硒营养状况良好的情况下,有机硒可贮存起来,当人体硒营养摄入不足时,贮存的有机硒能够补充到生理代谢中,从而满足硒的需求。无机硒(如亚硒酸盐和硒酸盐),进入人体后很快通过排泄途径排出体外,在体内停留时间较短,因此其毒性大于有机硒,而活性又低于有机硒,通常不适合于直接添加到食品中。[3]因此通过生物富硒将无机硒转化为有机硒,是生产富硒食品及添加剂的一种安全有效的方法。而黄酒作为最佳的调味料酒已是人所共知，成为了餐馆、酒楼、家庭必不可少的调味品，是一个理想载体。 二、相关研究的最新成果及动态 目前，用于补充硒源的物质主要分为2大类：无机硒（以亚硒酸钠为主）和有机硒（如富硒酵母、蛋氨酸硒）。研究表明，有机硒较无机硒毒性小，机体吸收率高。[4]其中有机硒的获得主要有：微生物转化法、植物天然种子发芽转化法、动物转化法等。其中微生物转化法较多的是培养富硒酵母，所用的菌种多为啤酒酵母有机硒可克服无机硒的过氧化作用，其生物活性较高，能够有效地在机体内同化，有利于在动物体内吸收利用。[5]人们获得有机硒的主要途径是生物转化。由于微生物具有生长迅速、繁殖快、代谢能力强、适应性强等特点，因此利用微生物进行硒的生物转化不受季节和气候的影响，且生产周期短，容易诱变。酵母菌具有高度的富集硒能力和将无机硒转化为有机硒的能力，单细胞的酵母菌容易诱变，比植物品种容易改良，可采用物理和化学方法诱变育种，从而获得优质的富硒生产菌株。[6]因此
CHO细胞表达系统与酵母细胞表达系统比较 CHO细胞表达系统与毕赤酵母表达系统是当前发展前景看好的两个表达系统，为了能够更加直观地对两个表达系统有一定的认识，特意在此篇中对两个表达系统作一定的比较，从而能够更进一步的对两个表达系统有更深的了解 1．CHO细胞表达系统 （1）优点 CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在SFM 中生长良好。与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点： (1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子； (2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力； (3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定； (4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化； (5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。 （2）存在的问题 在过去的几十年里，人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大进展，但是利用CHO细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和生产的要求，目前上游工作中主要存在以下问题： ①构建的重组CHO细胞生产效率低，产物浓度亦低； ②某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化； ③重组CHO细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现在上游构建时着重考虑它的高效表达，而对高教表达的产物是否能有效地提取出来，即分离纯化过程考虑较少； ④重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。 2．毕赤酵母细胞表达系统 （1）特点 自1987年Gregg等首次在毕赤酵母中表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)到1995年，已有四十多种外源蛋白在毕赤酵母宿主菌中获得表达。而最近几年每年报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几十种，且一年比一年多，与其它表达系统相比，毕赤酵母表达系统具有以下优势： 1）含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达； 2）表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。毕赤酵母中，报道的最高表达量为破伤风毒素C为12g/l，一般大于1g/l。绝大多数外源基因比在细菌、酿酒酵母、动物细胞中表达水平高。一般毕赤酵母中外源基因都带有指导分泌的信号肽序列，使表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，有利于分离纯化； 3）发酵工艺成熟，易放大。已经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达100g/l 以上，表达重组蛋白时，已成功放大到10000升； 4）培养成本低，产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲
综述 黄芩中黄芩苷的研究概况 一前言 黄芩苷(baicalin)是由唇形科植物黄芩Scutellariabaicalensis Georgi 的干燥根中提取的一种黄酮类化合物。其原植物主要产于东北、河北、山西、河南、陕西、内蒙古等地,以山西产量最大,河北承德产的质量最好。黄芩味苦,性寒。归肺、肝、胆、大肠、小肠经。功能清热燥湿,泻火解毒,止血,安胎[1]。黄芩苷是黄芩的主要有效成分之一,是黄芩及其制剂的主要质量控制指标成分,据药理学研究报道,黄芩苷具有抗微生物、抗变态反应、降压和镇静、利胆、保肝和解痉等作用[2]。本文对黄芩苷的最新研究现状作一综述。 二药理作用研究概况 黄芩苷(baicalin)是唇形科植物黄芩(scutellaria baicalensisgeorgi)的有效成分之一,属葡萄糖醛酸苷类,水解后产生黄芩素和葡萄糖醛酸,具有清热解毒、抗炎、利胆、降压、利尿、螯合金属离子、抗变态反应等多方面的作用[3]。近年来随着国际上对黄芩苷研究的持续升温以及认识的逐步深入,认为黄芩苷在清除氧自由基、减轻组织的缺血再灌注损伤、调节免疫、促进细胞凋亡以及抗肿瘤和HIV等多方面均有作用。 1 解热作用 发热是一个多环节多因素参与的复杂过程，若其中某些因素、环节被抑制或阻断，则可防止体温升高，从而产生解热效应。目前。对
于黄芩苷解热机制方面的研究报道甚少。综合近几年研究发现，黄芩总提物及单一活性成分(黄芩苷野黄芩苷)在整体动物实验、方面表现出显著的解热作用，且在一定剂量下其作用强度可高于以临床剂量折算的阿司匹林[4]。 2 抗炎作用 张罗修等[5]报道了黄芩苷对刺激剂Ca2+载体A23187诱导大鼠腹腔巨噬细胞PGE2的合成有抑制作用，这可能提示了黄芩苷抗炎作用的部分机理。陈先福等[6]应用兔感染性脑水肿模型，测定了黄芩苷、川芎嗪、甘露醇对血清和脑脊液(CSF)中磷脂酶A2 活性的抑制作用及改善脑水肿关系，结果显示黄芩苷与川芎嗪均可抑制磷脂酶A2 活性和脂质过氧化，从而减轻脑水肿、降低颅内压。 3对肝损伤的保护作用 采用D-氨基半乳糖及D-氨基半乳糖与内毒素合用建立的小鼠急性肝损伤模型,测定小鼠血清中谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)的含量。结果，腹腔注射200mg?kg-1或500mg?kg-1黄芩苷可以明显降低因D-氨基半乳糖及D-氨基半乳糖与内毒素合用所致肝损伤小鼠血清中已升高的GOT及GPT含量。提示黄芩苷对于受损的小鼠肝脏有一定的保护作用[7]。静脉注射黄芩苷(90、10mg?kg-1)能显著增加肝组织、血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性及谷胱苷肽(GSH)水平,进一步提高组织的抗氧化能力,通过抑制自由基的产生,降低四氯化碳(CCL)、D-氨基半乳糖对小鼠肝组织的损伤作用,降低生物膜脂质过氧化的产生,增强生物膜的稳定性,从而降低小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、
毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码 的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带 的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。 蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分