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地衣芽孢杆菌β—甘露聚糖酶发酵液的絮凝试验
张彩;杨文博
【期刊名称】《食品科学》
【年(卷),期】1996(017)012
【摘要】采用正交试验研究了种种聚丙烯酰胺对β－甘露聚糖酶发酵液的絮凝作用比较了不同助凝剂对聚丙烯酰胺絮凝的协同作用了各种絮凝剂对β－甘露聚糖酶活力的影响，初步认为：以聚合铝为助凝剂，阴离子型聚丙烯酰胺为絮凝剂。
【总页数】6页(P32-37)
【作者】张彩;杨文博
【作者单位】天津商学院食品工程系;南开大学生命科学院微生物学系
【正文语种】中文
【中图分类】TQ925
【相关文献】
1.地衣芽孢杆菌HDYM-04产β-甘露聚糖酶补料分批发酵条件优化 [J], 解鑫;平文祥;葛菁萍
2.地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶发酵液生化预处理的研究 [J], 陆得潭;刘冰
3.地衣芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶分批发酵动力学模型的建立 [J], 田雪;解鑫;周晓杭;葛菁萍;凌宏志;宋刚;平文祥
4.控制pH值和溶解氧对地衣芽孢杆菌HDYM-04分批发酵产β-甘露聚糖酶的影响 [J], 刘绍波;解鑫;平文祥;葛菁萍
5.地衣芽孢杆菌发酵生产β-甘露聚糖酶的代谢通量分析 [J], 刘朝辉;齐崴;何志敏
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酶制剂项目名称：利用玉米种子生物反应器生产高活性植酸酶项目简介：目前饲料中使用的植酸酶是通过微生物发酵方式生产的第一代产品。
该生产方式能源消耗通常是生产成本的20%左右。
探索低成本、节能降耗方式生产植酸酶在我国有重要的意义。
考虑到玉米是重要的也是最佳的饲料加工原料，我国玉米总需求量的近80%用于饲料加工，在家禽和家畜饲料中的用量都在50%以上。
从我国国情和可持续性发展角度出发，通过长达7年的攻关，本技术开发了一项节能、环保、低成本生产植酸酶的高新技术：利用玉米种子生物反应器生产的第二代植酸酶产品。
中国饲料工业标准要求：1公斤饲料中含0.5公斤玉米种子, 添加500单位植酸酶添加剂。
也就是说，要求1公斤的玉米种子中含1000单位的植酸酶。
该项目的转基因玉米经过六代选育，得到了27个表达植酸酶并稳定遗传的转基因玉米纯合系，植酸酶活性均在1,000 单位/公斤以上，最高的达到120,000 单位/公斤。
动物饲喂实验结果表明，以玉米为载体生产的植酸酶与发酵生产的植酸酶功能相当，可以显著提高动物的生产性能，显著降低动物排泄物中磷的含量。
完全可以替代微生物发酵生产的植酸酶满足饲料工业标准要求。
专利名称：一种甘露聚糖酶及其编码基因与应用申请(专利)号：CN200510103125.8专利简介：本发明的甘露聚糖酶活性高，巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris) MAN22CGMCC No.1389中甘露聚糖酶的表达量可达200000IU／mL发酵液，比现有甘露聚糖酶的产量高，生产成本低。
本发明的甘露聚糖酶可以用于制备甘露寡糖。
该甘露聚糖酶，是一种蛋白质，它具有下述氨基酸残基序列之一：1)序列表中的SEQ ID №：2；2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加成为具有甘露聚糖酶活性的蛋白质。
专利名称：表达β-1，3-1，4-葡聚糖酶的基因工程酵母菌株申请(专利)号：CN03153635.2专利简介：本专利利用基因工程手段，通过毕赤酵母生产葡聚糖酶。
产β—甘露聚糖酶菌株育种及培养基优化摘要：利用实验室筛选保藏最高酶活为10.7 U/mL的白腐真菌作为出发菌株，进行紫外诱变育种及培养基优化，以期提高菌株产β-甘露聚糖酶能力。
结果表明，紫外诱变条件为孢子悬液浓度106～107个/mL，诱变时间10 min，此条件下的孢子致死率达78%，获得了13株正向突变株，经6代遗传稳定性试验证明UV-2突变株酶活最高，遗传稳定性最强，比出发菌株酶活提高了2.075倍。
通过单因素试验确定了该突变株的最佳碳源、氮源分别为魔芋粉和硝酸铵，对酶活影响较大的无机盐为磷酸二氢钾。
通过正交试验，确定了最佳产酶培养基为魔芋粉4.0 g/L、NH4NO3 5.0 g/L、KH2PO4 5.0 g/L、NaCl 1.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L，在此条件下测得甘露聚糖酶最大酶活为46.17 U/mL，比优化前提高了40.3%。
关键词：β-甘露聚糖酶；白腐真菌；诱变；正交试验；培养基优化在世界能源日益短缺的形势下，植物纤维作为可再生有机资源越来越受到重视，其主要成分为纤维素、木质素和半纤维素。
半纤维素约占植物干重的35%，含量是仅次于纤维素的杂聚物生物资源，其中最具代表性的两种半纤维素是木聚糖和甘露聚糖[1]。
β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）可降解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖的β-1，4-D-吡喃甘露糖主链[2]。
微生物来源的β-甘露聚糖酶具有活力高、成本低、来源稳定、提取方便等明显优点[3]，近年来随着人们对自然界中半纤维素资源的开发和对甘露低聚糖保健价值的发现，微生物甘露聚糖酶再次成为研究热点[4-6]。
不同来源的β-甘露聚糖酶对不同底物的作用程度及其水解产物是不相同的[7-9]。
甘露聚糖酶具有广泛的工业应用价值，可用于饲料、食品、轻工和石油行业等[4，6-9]。
试验利用江苏省生物质转化与过程集成工程实验室保藏的白腐真菌，采用紫外诱变的方法使出发菌株酶活提高，并采用正交试验进行培养基的优化以进一步提高酶活，以期为甘露聚糖酶的进一步研究打下基础。
解淀粉芽孢杆菌的培养工艺及应用研究进展罗佳捷;肖淑华;张彬;王洁【摘要】解淀粉芽孢杆菌是一种分布广泛的益生菌,能够产生许多抑制真菌和细菌活性的物质.文章对解淀粉芽孢杆菌的理化性质、所含活性物质、培养工艺的优化、抗菌、抗氧化功能及其应用情况进行了综述.【期刊名称】《饲料博览》【年(卷),期】2014(000)005【总页数】3页(P40-42)【关键词】解淀粉芽孢杆菌;培养工艺;抗菌;抗氧化【作者】罗佳捷;肖淑华;张彬;王洁【作者单位】湖南九鼎科技有限公司技术中心,长沙 410003;湖南九鼎科技有限公司技术中心,长沙 410003;湖南农业大学经济动物研究所,长沙 410128;长沙市动物防疫监督站,长沙 410013【正文语种】中文【中图分类】S816.8;S852.6解淀粉芽孢杆菌为芽孢杆菌属，是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，其在生长过程中可以产生一系列能够抑制真菌和细菌活性的代谢物。
该菌在自然界分布广泛，易分离培养，对人畜无毒无害，不污染环境；其代谢产物较为丰富，具有广谱抗菌活性和较强的抗逆能力，生长快，稳定性较好[1-2]。
解淀粉芽孢杆菌可产生多种α-淀粉酶及蛋白酶，与枯草芽孢杆菌在形态、培养特征及生理生化特性方面非常相似。
解淀粉芽孢杆菌属兼性厌氧菌，菌落在LB培养基上和牛肉膏蛋白胨培养基上呈淡黄色不透明菌落，表面粗糙，有隆起，边缘不规则，在多种培养基上均不产色素，液体培养静止时有菌膜形成。
革兰氏染色呈阳性，杆状，可形成内生芽孢，呈椭圆形，两端钝圆，芽泡囊不膨大，中生到次端生，有运动性。
可水解淀粉和明胶，乙酞甲基甲醇试验阴性，硝酸盐还原试验阴性，苯丙氨酸脱氨酶试验、吲哚试验、甲基红试验、硫化氢试验均为阴性[3-5]。
解淀粉芽孢杆菌通过产生低相对分子质量抗生素及抗菌蛋白质多肽等活性物质抑制病原菌及线虫，其大多代谢产物的活性物质具有热稳定性、对紫外照射和蛋白酶处理不敏感、耐酸耐碱等特性。
提高酶活的方法
一、酶的结构优化
1.酶的改造：通过遗传工程手段对酶的基因进行改造，引入突变体或
构建新的酶，以增加酶的催化活性和稳定性。
2.酶的化学改性：通过化学方法引入化学修饰剂，如PEG、获得修饰
基团、金属离子等，改变酶的空间构型，提高酶的催化效率和稳定性。
3.酶的固定化：将酶固定在固相载体上，形成固定化酶，可以提高酶
的稳定性和重复使用性。
二、酶的参数优化
1.温度优化：通过优化反应温度，找到适合酶活性的最佳工作温度，
提高酶的活性。
2.pH值优化：通过控制反应体系的pH值，找到适合酶催化的最佳pH 值，提高酶的活性。
3.底物浓度优化：通过调整底物浓度，使酶催化反应在酶的饱和浓度
下进行，提高酶的活性。
4.酶的浓度优化：通过调整酶的浓度，使酶与底物的摩尔比达到最佳
比例，提高酶的活性。
三、酶的环境优化
1.协同作用：将多个酶的作用进行协同，使其在反应体系中相互促进，提高整体的反应效率。
2.辅酶或辅因子添加：给予酶所需的辅酶或辅因子，如辅酶NADH、
辅因子腺苷酸二磷酸（ATP）等，增加酶的催化活性。
3.培养条件优化：通过优化微生物培养条件，如培养基成分、培养温度、培养时间等，提高酶产量和活性。
4.抑制剂或激活剂的添加：通过给予酶所需的抑制剂或激活剂，调节
酶的活性，增加催化活性。
总的来说，提高酶活的方法包括酶的结构优化、酶的参数优化和酶的
环境优化。
通过改造酶的结构、优化酶的参数和环境，可以提高酶的活性、稳定性和催化效率，从而促进酶的应用和产业发展。
第38卷第6期 注 為 科 修Vol. 38 No. 62020 年 12 月JIANGXI SCIENCED" 2020doi ：10.13990/j. ()1001 -3679.2020.06.016枯草芽抱杆菌表达系统研究进展马平英，罗雯3,詹怡昕，吴楚楚，熊雨顺，许小群，陈梅4南昌师范学院生物系,330032，南昌)摘要:枯草芽抱杆菌是一种土壤来源的、低G + C 、内生抱子革兰氏阳性细菌。
其所属芽抱杆菌属是微生物发酵中的主要细菌，该细菌被认为是理想的模式生物。
枯草芽抱杆菌应用广泛，且因其具有非致病性、抗药性有限、为益生菌菌株等优点，可以直接用于人体和动物。
综述枯草芽抱杆菌的优点、表达系统的发展及其在各个领域的应用进展，从而在理论和实践两方面为枯草芽抱杆菌的表达系统研究提供可以借鉴的依据和思路。
关键词：枯草芽抱杆菌；遗传转化;表达;应用；进展中图分类号:Q939. 9文献标识码:A 文章编号:1001 -3679(2020)06 -867 -05Research Progress of Bacillus subtilis Expression SystemMA Pingying, LUO Wen ** , ZHAN Yixin, WU Chuchu , XIONG Yushun, XU Xiaoqun, CHEN Mei 收稿日期:2020 - 10 - 24；修订日期:2020-11 -10作者简介:马平英(1999—),女，本科，研究方向:生物科学。
基金项目：国家级大学生创新创业训练计划项目(201614437004)；南昌师范学院学生科研项目(19XSKY51 )o*通信作者:罗 雯(1974—),女，博士，教授，研究方向为应用微生物学。
E-mail ： ***************。
(Department of Biology, Nanchang Normal University , 330032, Nanchang , PRC)Abstra^: BadUus subtilis is a kind of soil - derived gram 一 positive bacterium with low G + C andendospore. Badllus is the main bacmia in microbial feanentation , which is sonsidered th be an iVe- al model oreanism. BadUus subtilis is wiVely used and it ccn be directly used in human body andanimals beccuse of its non - pathoocnic , limited resistance and being probiotic strains. The purpose of this paper was ta eeview the adventages of Badllus subtilis , the development of the expression sys tem and i I s application in veaoueields, ss as th previde referencc basis and ides for the study of the exprssion system of Bacillus subtilis in theory and practica.Key %ords ：Bad,llus subtilis p genetic transformation ； expression ； application ； prooress0引言枯草芽抱杆菌(Badllus subtilis)是一种理想 型的模式生物，其应用价值很高,培养简单快速, 具有非致病性及良好的发酵基础和生产技术等优势，是目前生产各种工业用酶的理想表达宿主。
目录摘要 0ABSTRACT (1)第一章绪论 (2)1.1β-甘露聚糖酶的研究现状 (2)1.1.1β-甘露聚糖酶的来源 (2)1.1.2β-甘露聚糖酶的性质 (3)1.1.3β-甘露聚糖酶的诱导 (3)1.2β-甘露聚糖酶的纯化 (4)1.2.1 纯化的意义 (4)1.2.2 分离纯化工艺 (5)1.3β-甘露聚糖酶的稳定性及稳定化 (6)1.4β-甘露聚糖酶的应用 (7)1.4.1石油钻采 (7)1.4.2饲料添加剂 (7)1.4.3食品保健 (7)1.4.4造纸工业 (8)1.4.5纺织工业 (8)1.4.6工具酶 (8)1.5研究目的和研究内容 (8)1.5.1研究目的 (8)1.5.2研究内容 (9)第二章枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的产生及性质 (9)2.1实验仪器与材料 (9)2.1.1实验仪器与设备 (9)2.1.2试剂 (10)2.1.3菌种 (10)2.1.4培养基 (11)2.2实验方法 (11)2.2.1粗酶液的制备 (11)2.2.2酶活的测定 (11)2.2.3温度对β-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响 (13)2.2.4不同浓缩倍数对β-甘露聚糖酶酶活稳定性影响 (13)2.2.5反复冻融对β-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响 (13)2.2.6激活剂对β-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响 (14)2.2.7防腐剂对β-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响 (14)2.2.8金属离子螯合剂对β-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响 (14)2.3实验结果与分析 (14)2.3.1温度对β-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响 (14)2.3.2不同浓缩倍数对β-甘露聚糖酶酶活稳定性影响 (15)2.3.3反复冻融对β-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响 (16)2.3 反复冻融情况下酶的稳定性 (16)2.3.4保护剂对β-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响 (16)2.3.5防腐剂对β-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响 (17)2.3.6金属离子螯合剂对β-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响 (17)结论 (18)展望 (18)参考文献 (19)致谢 (21)摘要β一甘露聚糖酶是一种重要的半纤维素酶，应用广泛，多采用微生物发酵制备。
本文首先利用芽孢杆菌对发酵培养基进行培养，并通过分离纯化制得高纯酶进行运用。
对酶的稳定性进行研究，通过添加稳定化试剂，储存于不同的温度，将酶浓缩成不同的倍数，以及反复冻融来研究酶的稳定性。
主要工作如下: 对芽孢杆菌发酵产生的酶液进行稳定性检测试验，确定了芽孢杆菌产甘露聚糖酶的在各种不同的条件下酶活的稳定性情况;优化了酶液在储存过程中的可能遇到的各种情况，大大降低了运输和储存成本，有利于产品的后续精制以及使用。
β一甘露聚糖酶粗酶液经盐析、超滤、离子交换层析、凝胶层析及超速离心即可制得纯酶液。
利用酶活随温度和反复冻融、不同浓缩倍数以及各种添加剂的变化而变化的规律，初步探讨了各种外界因素对酶活力的影响。
考察了七种添加剂(葡萄糖、海藻酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠、明胶、EDTA、乙醇)在不同浓度下对制备的β一甘露聚糖酶稳定性的影响，结果表明:添加葡萄糖可大幅提高酶的热稳定性，4℃时甘露聚糖酶的稳定性较高。
确定了浓缩酶的稳定性，以及反复冻融对芽孢杆菌产甘露聚糖酶的稳定性的影响。
关键词：芽孢杆菌甘露聚糖酶浓缩温度反复冻融添加剂稳定性ABSTRACTβ-mannanase is an important hemicellulase, widely used, the use of microbial fermentation preparation. The first use of Bacillus culture fermentation medium, and separation and purification system, high purity enzyme use.To study the stability of the enzyme by adding stable reagent, stored at different temperatures, the enzyme is concentrated into a different multiples, as well as repeated freezing and thawing to study the stability of the enzyme. The main work is as follows:Enzyme produced by Bacillus stability testing to determine the stability of the situation Bacillus mannanase activity in a variety of conditions; to optimize the enzyme during storage may encountervarious situations, which greatly reduces the cost of transportation and storage, follow-up of refined products and the use of.β-mannanase crude enzyme solution by salting out, ultrafiltration, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography and ultracentrifugation can be obtained pure enzyme solution.Activity varies with the temperature and repeated freezing and thawing, different concentration factor, and a variety of additives changes the law, and discussed a variety of external factors on the enzyme activity.The seven additives (glucose, sodium alginate, potassium sorbate, sodium benzoate, gelatin, EDTA, ethanol) at different concentrations on the preparation of β-mannanase stability, results show that: the addition of glucose significantlyimprove the thermal stability of the enzyme, man nanase stability at 4 ° C higher.Determine the stability of the enzyme concentrate, and the repeated freezing and thawing of Bacillus mannanase stability.Key words：Bacillus; mannanase; enrichment; temperature; freezing and thawing ; additive; stability第一章绪论1.1β-甘露聚糖酶的研究现状1.1.1β-甘露聚糖酶的来源β-甘露聚糖酶在自然界中来源广泛，其中包括动物、植物、和微生物。
在如翡翠贻贝(Perm viridis )[1]及亮大蜗牛[2](Helix lucorum)甲壳纲动物圆口螺和爬行动物蛇等的低等软体动物的肠道分泌液中，在植物如芝麻、葛芭的种子、豆类植物(长角豆、瓜尔豆等)发芽的种子及天南星科植物魔芋萌发的球茎中，以及多数微生物中都能提取到β-甘露聚糖酶。
其中，微生物是β-甘露聚糖酶的最重要来源，已报道的如细菌中的芽抱杆菌、假单胞菌和弧菌，真菌中的曲霉、青霉、核盘菌及多孔菌等都是产β-甘露聚糖酶的常见类群。
甘露聚糖是广泛存在于植物多糖中的一种半纤维素，很多微生物包括细菌、真菌和放线菌等都能分泌β-甘露聚糖酶进行分解甘露聚糖作为自己的碳源或能源物质。
如细菌中的芽袍杆菌[3](Bacillus sp.)假单胞菌(Pseudomonas sp.) 、弧菌(Tlibrio sp.)单胞菌(Aeromonas sp.)等;放线菌中的链霉菌treptomyces sp.);酵母(Yeast);以及真菌中的曲霉(Aspergillus sp. )根霉(Rhizopus sp. )木霉(Trichoderma sp.)等均可分泌β-甘露聚糖。
值得一提的是，一些极端环境下的微生物，如嗜碱芽袍杆菌[4](Calkalophilic Bacillus sp.) 嗜热菌(Rhodothermus marinus),那不勒斯栖热胞菌[5](Thermotoga neapolitana )及嗜热真菌[6](Thermomyces lanuginosus)等也可产生β-甘露聚糖酶，并且以其特有的酶学性质(如耐热性)拓宽了β-甘露聚糖酶的应用领域。
真菌来源的β-甘露聚糖酶的作用范围偏酸，一般pH值在4.0～5.5之间，最适反应温度一般在55℃～75℃。
如1990年Johnson KG[7]研究的里氏木霉，最适pH为5.5，最适反应温度为65℃;李江华等研究的黑曲霉，最适pH为5.5,最适反应温度为35℃。
细菌和放线菌来源的最适pH却常为中性或者偏碱性，最适反应温度为45℃～70℃。
细菌中，研究最多的是芽袍杆菌，除1991年马延和和田新玉报道了嗜碱芽袍杆菌产碱性β-甘露聚糖酶外，最适反应pH值多为5.5～7.0。
马建华等研究的枯草芽袍杆菌最佳反应pH值为6.4，最适反应温度为50℃。
1995年，南开大学杨文博[8]等人从土样中分离筛选出一株产中性β-甘露聚糖酶的地衣芽袍杆菌，经紫外线诱变处理后，获得一株酶活高产菌株(NK-27），并考察了不同碳源及培养条件对摇瓶发酵产酶的影响，得出地衣芽袍杆菌(NK-27)的β-甘露聚糖酶为诱导酶，葡萄糖、半乳糖不利于产酶，魔芋粉、角豆胶为最佳碳源，有机氮源豆饼粉优于其它氮源，酵母膏对产酶有促进作用，通气量大对产酶有利等结论。
微生物来源的β-甘露聚糖酶具有活力高、成本低、来源稳定、提取方便等明显优点，己在实际生产和基础研究中得到广泛应用。
