小鼠脾细胞悬液制备

gentleMACS™操作步骤1.背景信息在许多实验中，需要用到单细胞悬液，如用MACS®技术分选细胞时，要想获得高纯度和回收率的话，单细胞悬液就很重要。

德国美天旎生物技术有限公司开发的gentleMACS™分离器能够提供优化的程序，用于从不同的组织中获取单细胞悬液。

这些组织包括小鼠脾脏，肝脏，肺脏，脑组织等。

使用C管，能够在一个密闭的系统中进行全自动的组织分离，可以保证组织操作的无菌，以及能够同时处理2个组织样本。

2. 分离小鼠脾脏的操作步骤2.1 需要的试剂和仪器●gentleMACS 分离器●gentleMACS C 管(# 130-093-237)●细胞滤器，如30 μm n尼龙滤网（Pre-Separation Filters# 130-041-407)●缓冲液: PBS缓冲液, pH 7.2,含0.5% 牛血清白蛋白(BSA), 和2 mMEDTA (不推荐使用含Ca2+ or Mg2+的缓冲液)2.2 步骤▲如制备的单细胞悬液用于细胞培养，所有的步骤必须在无菌条件下获得。

▲一只小鼠脾脏的重量约为80–120 mg (BALB母鼠, 6–7 周龄).1. 将小鼠脾脏转移到gentleMACS C 管中，按照脾脏的数量加入缓冲液:1–2 个小鼠脾脏: 3 mL3–4个小鼠脾脏: 6 mL5–6 个小鼠脾脏: 9 mL2. 拧紧C管盖子，倒置在gentleMACS 分离器上▲注意: 必须确保组织块在转子区域3. 开机，选择合适的分离程序：1–2 个小鼠脾脏: m_spleen_01.3–6个小鼠脾脏: m_spleen_04.4. 运行gentleMACS 程序m_spleen_01. 或m_spleen_04.5. 程序结束后，从gentleMACS 分离器中取出C管6. (可选) 以300×g 室温下离心2分钟。

7. 去除分离的组织块，将细胞悬液通过一个预分选滤器（1-2个脾脏），该预分选滤器放置于15mL管子中。

第1期农垦医学第41卷脾脏是机体最大的免疫器官，占全身淋巴组织总量的25%，含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心。

鉴于脾脏的功能丰富，由其制备的脾细胞悬液在科学研究和临床应用研究方面也很广泛，但目前报道的脾细胞悬液制备方法大多数是机械研磨分散法。

本研究探讨一种改良的脾细胞悬液制备方法，旨在为进一步的脾细胞悬液应用提供方法学指导，以期能更好地应用于改良的脾细胞悬液制备方法的探讨贺亚玲1崔林1邢建新2李玲1唐慧1刘欢1陈雪玲2（1.石河子大学医学院形态实验中心，新疆石河子，832002；2.石河子大学医学院病原生物学与免疫学教研室，新疆石河子，832002）【摘要】目的：通过与常规制备脾细胞悬液方法比较，探讨一种具有机械损伤度小,活细胞比例高，收集细胞较多的脾细胞悬液制备方法。

方法：常规取小鼠脾脏，放入小平皿内，用带有弯曲针头的注射器在含有1～2mL PBS 的小平皿中刮出脾细胞；再用5mL和2mL注射器依次吹打混匀，洗涤脾细胞，计数。

常规脾细胞悬液制备方法为机械研磨分散法。

结果：采用改良的脾细胞悬液法使活细胞比例在98%以上，脾细胞收集较多，体重25g左右的昆明系小鼠脾细胞收集量能达到1.6×108/mL，脾细胞相对较完整且能用于进一步的研究。

结论：改良的脾细胞悬液制备方法较常规的方法操作简便，且具有机械损伤度小，脾细胞相对较完整的优点，值得推广和应用。

【关键词】脾细胞悬液；制备方法；改良中图分类号：R-332文献标识码：AStudy on Preparation of Modified Spleen Cell SuspensionHE Ya-ling1,CUI Lin1,XING Jian-xin2,LI Ling1,TANG Hui1,LIU Huan1,CHEN Xue-ling2（1.Center of Morphology Experimental，Shihezi University School of Medicine,Xinjiang Shihezi，832002；2.Department of Medicine Pathogenic Biology and Immunology,Shihezi University School of Medicine,Xinjiang Shihezi，832002）【Abstract】Objective：Compared with the conventional method for preparing spleen cell suspension，a method for preparing spleen cell suspension with small mechanical damage,high proportion of living cells，more spleen cells collection is explored.Methods：The mouse spleen was routinely taken,placed in a small dish，and spleen cells were scraped off in a small dish containing1to2mL of PBS using a syringe with a curved needle.Then spleen cells were blewed and mixed with5mL and2mL syringe,spleen cells were washed,counted.Conventional preparation of spleen cell suspension is a mechanical grinding dispersion method.Results：The improved spleen cell suspension method works better，and has the advantages of small mechanical damage，more than98%of living cells and more spleen cells collected,and the collection amount of spleen cells of Kunming mice weighing25g achieve1.6×108/mL, it can be used for further research.Conclusion：The preparation method of the improved spleen cell suspension is simple and convenient to operate compared with the conventional method,spleen cells are relatively complete advantages，it can be worth promoting and application.【Key words】Spleen cell suspension；Preparation method；Improvement基金项目：石河子大学教育教学改革项目（SJ-2018-15）；石河子大学混合式教学项目资助（BL2016061）。

脾脏单细胞悬液制备
脾脏单细胞悬液制备是一种常用的实验方法，用于分离和检测脾脏中的单个细胞。

操作步骤如下：
1.准备器材：取一只小鼠脾脏，注射器、离心管、冷暗培养皿、离心机、搅拌器等。

2.将小鼠脾脏取出，放入冷PBS缓冲液中，将其清洗干净。

3.将脾脏组织放在冷暗培养皿中，用注射器注入10毫升消化液，搅拌10分钟。

4.将消化液滤过40μm滤网，离心10分钟。

5.去除上清液，用10毫升PBS缓冲液重悬细胞，计数并存放于离心管中。

6.将细胞进行下一步实验操作。

注意事项：为避免对细胞质量的影响，操作过程中保持所有物品的清洁度和冷却度，并严格控制操作时间。

单抗制备步骤及注意事项脾细胞的准备：1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。

无菌操作取出脾脏，置于盛有5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。

2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。

3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。

再以同样的方法洗涤离心一次。

4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。

注意事项：•免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B 淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。

骨髓瘤细胞的准备：1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。

2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。

3.制备细胞悬液，计活细胞数。

4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。

注意事项：•常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。

•骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。

•骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。

小牛血清的浓度一般在10～20%。

细胞的最大密度不得超过106个/mL。

•一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。

细胞的倍增时间为16～20小时。

•一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。

•保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。

细胞融合：1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。

2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。

脾脏单个核细胞的制备: 将5 只小鼠断颈椎处死, 无菌取出脾脏, 分别剪碎, 置200 目无菌尼龙网上, 分次滴入4~ 5 ml RP MI1640 培养液, 轻轻研磨脾脏, 直到脾脏变白; 收集细胞悬液( 由于红细胞所占比例很低且对实验影响不大, 故无需作红细胞裂解处理) , 1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5 min, 弃上清; 加入2 ml pH7. 4 的PBS, 混匀后1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5min, 弃上清; 加入4 ml RPMI1640 培养液, 混匀, 用RPMI1640 培养液稀释200 倍后滴加在细胞计数板上进行细胞计数, 根据计数结果用RPMI1640 将细胞悬液调成2 × 106 / 300 µl 的浓度。

《流式细胞术检测小鼠脾细胞内细胞因子刺激方案的筛选》单细胞悬液的制备：将大鼠颈椎脱位处死后, 置70%乙醇中浸泡5 m in, 无菌取出脾脏和胸腺置于平皿中, 除掉结缔组织, 用生理盐水清洗3次。

加入2 mL RPM I- 1640完全培养液, 用剪刀分别将脾和胸腺剪成1 mm 1 mm 1 mm 碎块后, 用毛玻片轻柔研磨组织碎片, 经8层纱布过滤制成单细胞悬液, 经H anks液离心洗涤后, 将细胞悬浮于含10% 小牛血清的RPM I- 1640 培养液。

台盼蓝染色, 计数活细胞在95%以上, 调整细胞数至5×1010 cells /L。

《粗江蓠多糖对大鼠淋巴细胞周期的影响》制备脾细胞悬液脾淋巴细胞的获取:手术刀、解剖剪、解剖镊、止血钳等手术器械,300 目尼龙网等须经消毒处理; 以颈椎脱臼法处死小鼠, 用7 5 % 乙醇浸泡小鼠10-15min 。

沿腹腔中线剪开小鼠胸腔, 取出脾脏置于培养皿中, 剪去脂肪和筋膜组织, 用R PMI-1640培养液漂洗。

粗剪成小块, 用注射器芯轻轻挤压, 加人基础培养液, 混悬, 用300目尼龙网过滤到玻璃离心管中, 再加人基础培养液冲洗网上剩余组织细胞。

第1篇一、实验目的1. 了解抗体生成细胞的分离和培养方法。

2. 学习观察和记录抗体生成细胞的形态变化。

3. 掌握抗体生成细胞活性检测的基本技术。

二、实验原理抗体生成细胞是指能够产生抗体的细胞，通常为B淋巴细胞。

在抗原刺激下，B淋巴细胞分化为浆细胞，浆细胞分泌特异性抗体。

本实验通过分离小鼠脾脏中的B淋巴细胞，体外培养并观察其形态变化，以及检测其产生抗体的能力，来研究抗体生成细胞的特性。

三、实验材料1. 实验动物：小鼠2. 试剂：抗原、抗体、Ficoll分层液、RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、二甲基亚砜（DMSO）、细胞计数板、显微镜等。

四、实验步骤1. 小鼠脾脏细胞分离- 处死小鼠，取出脾脏。

- 将脾脏放入无菌培养皿中，用无菌剪刀剪碎。

- 加入Ficoll分层液，室温静置30分钟。

- 吸取中层细胞，用RPMI-1640培养基洗涤2次。

- 计数细胞，调整细胞浓度为1×10^6个/mL。

2. 细胞培养- 将细胞悬液加入含10%胎牛血清、青霉素、链霉素的RPMI-1640培养基中。

- 将细胞悬液分装至培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

- 每2天更换一次培养基。

3. 形态观察- 在显微镜下观察细胞形态变化，记录细胞生长情况。

4. 抗体生成细胞活性检测- 收集细胞培养液，离心去上清。

- 将细胞沉淀用RPMI-1640培养基重悬，加入抗原，37℃孵育1小时。

- 加入抗体，37℃孵育30分钟。

- 加入底物，观察颜色变化。

- 记录抗体生成细胞活性。

五、实验结果1. 细胞形态观察- 在培养过程中，细胞逐渐从单层排列变为多层排列，细胞体积增大，形态趋于扁平。

2. 抗体生成细胞活性检测- 加入抗原和抗体后，部分细胞出现颜色变化，说明这些细胞能够产生抗体。

六、实验讨论1. 本实验成功分离和培养了小鼠脾脏中的B淋巴细胞，并观察到了细胞形态的变化。

2. 抗体生成细胞活性检测结果表明，部分细胞能够产生抗体，证实了实验的成功。

小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告一、引言淋巴细胞是免疫系统中重要的细胞成分，其在免疫应答和抗体产生中发挥着关键作用。

为了研究淋巴细胞的功能和特性，需要将其从组织中分离出来并进行计数。

本实验旨在通过对小鼠脾脏进行淋巴细胞分离和计数，来获取关于淋巴细胞数量和纯度的信息。

二、材料与方法1. 实验动物：使用C57BL/6小鼠。

2. 仪器与试剂：离心管、离心机、PBS缓冲液、0.83%氯化铵溶液。

3. 实验步骤：A. 准备工作：i. 将离心管预冷至4℃。

ii. 准备PBS缓冲液，并保持在4℃。

B. 小鼠准备：i. 用无菌技术将小鼠安全固定在手术台上。

ii. 使用无菌器械，剪开腹部皮肤和腹壁，暴露脾脏。

iii. 小心取出脾脏并放入含有PBS缓冲液的离心管中。

C. 细胞分离：i. 使用无菌器械，将脾脏组织切碎至细胞悬浮液状态。

ii. 将细胞悬浮液通过70μm滤网过滤，以去除大块组织残渣。

iii. 向过滤后的细胞悬浮液中加入等体积的0.83%氯化铵溶液，进行红细胞溶解。

iv. 用PBS缓冲液洗涤淋巴细胞沉淀，重复此步骤2-3次。

D. 细胞计数：i. 取适量的淋巴细胞悬浮液，加入等体积的尝试涂片溶剂进行稀释。

ii. 在尝试涂片上使用布朗管计数室计数淋巴细胞数量。

三、结果根据实验操作所得数据，我们得到了以下结果：1. 成功分离出小鼠脾脏中的淋巴细胞。

2. 经过红细胞溶解和洗涤步骤后，淋巴细胞沉淀呈现白色悬浮液状态。

3. 在计数室中观察到淋巴细胞的形态特征，如小型、圆形和较大的核。

四、讨论本实验成功地分离出了小鼠脾脏中的淋巴细胞，并通过计数室观察到了其形态特征。

然而，有一些潜在问题需要考虑和改进：1. 纯度问题：尽管我们成功分离出淋巴细胞，但在实验过程中是否存在其他细胞类型的污染仍需进一步验证。

可以通过流式细胞术等技术来评估纯度。

2. 细胞活力：在实验过程中，我们没有对淋巴细胞进行活力测试。

淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞的原理淋巴细胞分离液是一种常用的实验试剂，用于分离脾淋巴细胞。

通过对淋巴细胞的分离，可以获得纯净的淋巴细胞群体，为后续的实验研究提供了条件。

淋巴细胞是一类免疫细胞，主要存在于淋巴组织和淋巴液中。

淋巴细胞的分离液是一种含有特定成分的溶液，能够有效地分离脾淋巴细胞。

其原理主要包括以下几个步骤：第一步，准备脾组织。

取得小鼠的脾脏，将其置于无菌条件下进行操作。

脾脏是免疫系统的重要器官，其中富含淋巴细胞。

首先将脾脏放入含有冷PBS（磷酸盐缓冲液）的离心管中，并用离心机低速离心，以去除掉其他组织和血管。

第二步，制备单细胞悬浮液。

将脾组织移至无菌的培养皿中，用无菌匀浆棒将组织碾碎。

随后，加入适量的无菌PBS，充分混合，制备出均匀的组织悬浮液。

第三步，加入淋巴细胞分离液。

将淋巴细胞分离液缓慢地滴加到组织悬浮液中，同时轻轻摇动培养皿，使淋巴细胞分离液充分与组织悬浮液混合。

淋巴细胞分离液中的特定成分能够与其他细胞发生作用，使淋巴细胞得以分离。

第四步，离心分离。

将混合液倒入离心管中，用离心机进行高速离心。

离心的目的是通过离心力将淋巴细胞与其他细胞分离开来。

离心结束后，可观察到淋巴细胞沉积在离心管底部，上层液体中则含有其他细胞和杂质。

第五步，收集淋巴细胞。

将上层液体倒掉，只留下沉积的淋巴细胞。

用无菌的PBS洗涤淋巴细胞，去除残留的淋巴细胞分离液和其他杂质。

重复洗涤步骤，可更好地保证淋巴细胞的纯度。

通过以上步骤，我们可以获得高纯度的脾淋巴细胞。

这种分离方法简单易行，操作方便，并且能够得到较为理想的结果。

淋巴细胞的分离液在免疫学和细胞生物学等领域具有广泛的应用价值，为研究淋巴细胞的功能和机制提供了重要的实验手段。