产淀粉酶细菌菌株分离

产淀粉酶菌株的分离纯化一、实验目的1. 掌握产淀粉酶菌种的分离纯化的原理和方法技术；2. 巩固十倍稀释法。

二、实验原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找有重要应用潜力的微生物主要的菌源。

因此本实验选择从土壤中分离出产淀粉酶菌种，再进行纯培养。

主要运用富集培养技术，稀释涂布平板法和平板划线分离法及无菌操作技术获得我们所需要的产淀粉酶菌种。

淀粉酶作用于淀粉时，打开了淀粉分子的糖苷键，从而使淀粉失去粘性，同时使其失去了与碘的显色反应能力，不再与碘结合，从而形成透明圈。

产淀粉酶菌株在选择培养基上培养后，会水解淀粉形成水解圈，加碘液染色后，水解圈尤为明显。

三、实验材料1. 菌种：从自然界筛选获得的淀粉酶产生菌种2. 土壤样品：从栽种土豆的菜园中采集土壤样品3. 培养基：淀粉液体培养基（50mL）：蛋白胨0.5g，NaCl 0.25g，牛肉膏0.25g，可溶性淀粉0.1g，蒸溜水50mL。

淀粉琼脂培养基(200mL)：蛋白胨2g，NaCl 1g，牛肉膏1g，可溶性淀粉0.4g，蒸溜水200mL，琼脂3-4g。

牛肉膏蛋白胨培养基(200mL)：蛋白胨2g，牛肉膏0.6g，NaCl 1g，琼脂3-4g，蒸馏水200mL，pH7.0-7.2。

4.其他用品：酒精灯、移液枪（20-200uL）、接种环、试管架、三角涂布棒（各一个），电子天平、三角烧瓶（5个）、试管（10支）、培养皿（15个）、1mL移液管（10支）、10mL移液管(1支)、无菌水（200mL）、微波炉、卢戈氏碘液。

四、试验方法1．样品采集用无菌报纸，在栽有土豆的菜园里，从不同的采样点采取土样约15g。

（注意应采取距地表2-3cm以下的土样）2．富集培养取土样10g，放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振动20min，使土样与水充分混合，使微生物分散开。

用一支1mL的移液管移取1mL土样液，加入到盛有50mL淀粉液体培养基的三角瓶中进行富集培养，摇床110r/min，37℃，培养24h。

产淀粉酶菌株的分离与提纯摘要：淀粉酶是一种广泛应用于食品、饲料和生物能源领域的酶类。

本研究旨在从土壤样品中分离出产淀粉酶的菌株，并通过营养物质筛选和鉴定，最终获得高活性的产淀粉酶菌株。

分离出的菌株经过形态学、生化和分子生物学鉴定，最终确定为放线菌属。

通过筛选和优化培养基组成、培养条件、发酵时间等参数，获得了产淀粉酶的高产菌株，其中最高淀粉酶活性达到406.2 U/mL。

随后通过离子交换层析、凝胶过滤层析和手性分离层析等技术，对产淀粉酶菌株进行了纯化，纯化后的淀粉酶总回收率为78.5%。

本研究拓展了淀粉酶菌株的来源渠道，并提供了一种有效的产淀粉酶筛选和提纯技术。

关键词：淀粉酶；菌株分离；筛选；纯化Introduction淀粉酶是一种用来加快淀粉转化为葡萄糖片段的酶类，广泛应用于食品、饲料、纺织、造纸、医药、生物能源等领域。

因此，发现新的产淀粉酶的菌株和提高淀粉酶的产量和纯化度具有很大的应用前景和经济价值。

本研究旨在从土壤样品中分离出产淀粉酶的菌株，并通过筛选和鉴定，最终获得高活性的产淀粉酶菌株。

随后，通过离子交换层析、凝胶过滤层析和手性分离层析等技术，对产淀粉酶菌株进行了纯化。

Materials and methods样品采集从不同区域的土壤样品中采集10 g土样，放入消毒的密闭容器中，避免阳光直射和高温。

待采集完毕后立即运回实验室处理。

淀粉酶活性测定淀粉酶活性采用Miller方法测定，在37℃下反应15 min后，以0.01mol/L NaOH终止反应，读取吸收度A450。

反应体系为：淀粉溶液 1 mL、哌嗪酸盐缓冲液1 mL、酶液1 mL。

菌株分离取0.1 g土样加入0.9mL 生理盐水中，混合搅拌均匀后，依次向1.5%的琼脂糖和分别选用Luria-Bertani、Potato Dextrose Agar和Starch Agar培养基进行分离，待培养基表面形成菌落后进行传代培养。

通过形态学、生化和分子生物学鉴定，确定产淀粉酶菌株。

实验六十淀粉酶产生菌株的筛选实验项目性质：设计性涉及的知识点：无菌技术、浓缩培养、纯种子分离、淀粉酶特性和酶活性测定。

计划学时：8学时一、实验目的1.掌握从环境中采集样本并从中分离纯化某些微生物的完整操作步骤。

2.巩固之前所学的微生物学实验技术。

3.掌握产酶微生物的筛选方法。

二、实验原理α-淀粉酶是一种液化淀粉酶。

其产生菌芽孢杆菌广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉的土壤样品中。

从自然界筛选菌株的具体方法大致可分为以下四个步骤：取样、增殖培养、纯种子分离和性能测定。

1、采样：即采集含菌的样品在收集含有细菌的样本之前，你应该调查和研究你打算筛选的微生物分布在哪里，然后你可以开始做各种具体的工作。

几乎所有种类的微生物都可以在土壤中找到，因此土壤可以说是微生物的基础。

在土壤中，细菌数量最多，其次是放线菌、第三种霉菌和酵母。

除土壤外，各种物体上都有相应的优势微生物。

例如，枯枝、腐叶、腐土和腐木中的纤维素分解细菌较多，厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中的淀粉分解细菌较多，水果和蜜饯表面的酵母较多；植物奶中含有较多的乳酸菌，油田和炼油厂附近的土壤中含有较多的石油分解菌。

2、增殖培养（又称丰富培养）增殖培养是在采集的土壤和其他含有细菌的样本中添加一些物质，并创造一些其他有利于待分离微生物生长的条件，以便能够分解和利用这些物质的微生物能够大量繁殖，以便我们从中分离出这些微生物。

因此，增殖培养实际上是选择性培养基的实际应用。

3、纯种分离在生产实践中，一般都应用纯种微生物进行生产。

通过上述的增殖培养只能说我们要分离的微生物从数量上的劣势转变为优势，从而提高了筛选的效率，但是要得到纯种微生物就必须进行纯种分离。

纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。

4.业绩衡量分离得到纯种这只是选种工作的第一步。

所分得的纯种是否具有生产上所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。

“产淀粉酶菌株的筛选”设计方案产淀粉酶菌株的筛选是一项重要的研究工作，它可以满足很多工业和农业领域的需求。

下面是一个设计方案，包含步骤、实验条件和分析方法。

1.步骤（1）菌株的收集和培养首先，需要收集不同环境中的样品，如土壤、水体、植物表面等。

将样品分离培养在富含淀粉的琼脂培养基中。

培养过程中，需保持适宜的温度（通常在30℃左右）和适宜的pH（通常为6-7）。

（2）淀粉酶活性筛选将分离培养基中的菌株进行淀粉酶活性筛选。

取一小部分菌株涂抹到含有淀粉的琼脂培养基上，培养一段时间后在培养皿上观察是否产生明显的透明圈。

透明圈的出现表示淀粉酶活性较高的菌株。

（3）淀粉酶活性检测和比较从产生透明圈的培养皿中挑取具有高活性的菌落，进行淀粉酶活性检测。

可采用碘液滴加法，在含淀粉的琼脂培养基上，滴上一滴碘液，观察出现的蓝色溶解圈的明暗程度，可以初步评估淀粉酶活性的强弱。

（4）纯化和鉴定筛选出具有较高淀粉酶活性的菌株后，通过纯化和鉴定，进一步确定其产淀粉酶的能力以及体外条件如温度和pH对淀粉酶活性的影响。

可采用离心、柱层析等技术对菌株进行纯化。

通过测量在不同条件下的淀粉酶活性，确定最适宜的条件。

2.实验条件（1）培养条件：温度为30℃，pH为6-7（2）培养基：含淀粉和琼脂的培养基。

（3）检测条件：培养基含有淀粉，通过碘液滴加法观察形成的蓝色溶解圈明暗程度。

3.分析方法（1）测量淀粉酶活性采用I2-KI法测定淀粉酶活性。

将一定量的菌株培养液加入含淀粉的缓冲液中，反应一段时间后，加入碘液和KI溶液，混匀后通过测量吸光度来确定淀粉转化的程度。

（2）蛋白质含量测定通过BCA方法测定菌株培养液中的蛋白质含量。

将菌株培养液样品与BCA试剂混合，在一定温度下测量吸光度来确定蛋白质含量。

（3）酶动力学参数分析采用酶动力学参数分析方法，如麦克斯韦–玛尔特尔方程等，通过测定在不同底物浓度下的淀粉酶活性，来确定酶的最适底物浓度、最适酶浓度以及酶的最大反应速率。

从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案实验方案：从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验目的：分离产淀粉酶的芽孢杆菌，用于后续淀粉酶相关研究。

实验步骤：1.样品采集：选择含有潜在产淀粉酶的土壤样品，如农田土壤或果园土壤。

2.稀释培养：将采集的土壤样品用无菌PBS缓冲溶液稀释，并进行均匀悬浮。

3.接种装置：将土壤悬浮液均匀涂布在含有淀粉的固体培养基上，使用毛细管或平面接种棒操作，确保样品均匀地接种在培养基上。

4.培养条件：将接种好的培养基培养皿在适宜的培养条件下培养。

适宜的培养条件包括温度、湿度和氧气供应等。

一般来说，菌株生长的适宜温度为30-37摄氏度，湿度为60-70%。

5.纯化分离：通过制备出来的细菌菌落将产酶菌株分离出来。

可以使用毛细管、骨牌、环针等工具，分别挑取单个菌落并将其转移到含有淀粉的培养基上。

6.传代培养：将分离出来的产酶菌株进行传代培养，以确保其菌落的特性稳定。

7.筛选鉴定：通过淀粉酶活性分析等方法，对分离出来的菌株进行筛选鉴定。

一般来说，可采用滴定法或I2-KI法测定淀粉酶活性。

根据颜色变化或者酶活性指标的变化，筛选出淀粉酶产量较高的菌株。

8.鉴定菌株：对产淀粉酶的菌株进行鉴定，确定其属于芽孢杆菌的种属。

可以采用传统的形态学和生理生化特性鉴定方法，如菌落形态观察、革兰染色、氧需气性、形状和运动情况等。

9.鉴定纯化：最后，对鉴定出来的菌株进行纯化培养，以获得纯种淀粉酶产生菌。

实验注意事项：1.采集样品时要避免采集过于含油的土壤，以免对实验造成干扰。

2.在操作过程中要做好防护，戴手套，避免污染样品。

3.在培养过程中注意严格无菌操作，以避免外源菌的污染。

4.在菌株的鉴定过程中，要仔细观察菌株的形态特征，并结合多种鉴定方法综合分析。

5.实验过程中要注意做好记录，包括实验步骤、结果、观察和记录等。

总结：通过上述实验方案，我们可以从土壤中分离出产淀粉酶的芽孢杆菌。

这有助于开展后续淀粉酶相关的研究，包括酶的生物化学性质、作用机制等。

自然界中产淀粉酶菌株分离纯化及酶活测定淀粉酶（Amylase ）又称糖化酶，是指能使淀粉和糖原水解成糊精、麦芽糖和葡萄糖的酶的总称。

淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α-1, 4-葡聚糖，水解α-1, 4-糖苷键的酶。

根据作用的方式可分为α-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 1.）与β-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 2. ）。

α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物；β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1, 4-葡聚糖链。

主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。

淀粉酶是一种用途极广的生物催化剂，广泛应用于造纸、食品、医药工业。

如饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、味精、抗生素等行业；用于高质量的丝绸、人造棉、化学纤维退浆；制成不同品种的工业酶、医用酶、诊断酶等；在洗涤剂工业中，作为洗涤剂酶与碱性蛋白酶、脂肪酶一起添加于洗衣粉中制成多酶洗衣粉等具有极广泛的用途。

随着社会需求的增大，工业生产对淀粉酶的需求量越来越大，其在各领域应用广泛，急需寻找更高酶活的产酶菌株满足生产需要。

生淀粉酶是指对不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒能够表现出强水解活性的酶类。

70年代由于两次石油危机，引起各国学者从节能和有效利用天然资源出发，重视对生淀粉酶的研究。

研究大致分两个方面：一是探讨对生淀粉不经蒸煮，直接用于酒精发酵的可能性；另一则是从自然界中分离筛选能产生生淀粉酶的微生物，并进而研究生淀粉酶的酶学特性及其产生菌的徽生物学特性[1, 2]。

除动物自身的消化道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外两大来源是植物和微生物能产生生淀粉酶的微生物较多。

Ueda [3, 4]，Mizokami [5]，Tamiguchi [6]，Kainuma [7]先后报道了Aspergillus awaraori，Rbizopus . sp．，Strepiococcus boris，Bacillus circulans，Chalara paradoxa等菌种均有产淀粉酶能力。

淀粉酶芽抱杆菌的筛1目的了解产淀粉酶细菌的分离和纯化的原理，掌握常用的微生物分离、纯化方法2原理从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。

平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。

其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求, 或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。

因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。

获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。

值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。

土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。

因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。

本实验将采用不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。

3材料Q A严去甘3.1培养基淀粉培养基: 可溶性淀粉1%、蛋白胨1% 、葡萄糖0. 5%、氯化钠0. 5%、牛肉膏0. 5%、琼脂粉0. 8% 。

3.2 溶液或试剂盛9ml 无菌水的试管，盛99ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶, 制霉菌素母液（抑制真菌）。

3.3 样品土样3.4 仪器或其它用具高压蒸汽灭菌锅、旋涡混合器、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种环、接种针、接种钩、滴管、恒温水浴装置等。

4实验流程倒平板f制备梯度稀释液f涂布（或倾注法）f培养f挑单菌落f保存。

5步骤准备工作：摆好实验材料：将培养基、接种工具和其它用品全部在超净工作台上摆好。

进行紫外线灭菌30min,关闭紫外灯，20-30min后打开照明灯，进行操作。

接种前用酒精棉球将双手消毒。

5.1 稀释平板法①倒平板将淀粉培养基加热溶化待冷至55〜60C时，混合均匀后分别倒平板，淀粉培养基倒六皿三皿用于稀释平板；三皿用于划线分离。

产淀粉酶菌株的分离及筛选摘要：【实验目的】1学习从土壤等环境中分离微生物的技术。

2了解产淀粉酶菌株的分离方法。

3观察产淀粉酶菌的形态特点，并分析不同条件下酶的特性。

【实验原理】淀粉酶广泛在于动植物和微生物中，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂.。

【实验目的】1学习从土壤等环境中分离微生物的技术。

2了解产淀粉酶菌株的分离方法。

3观察产淀粉酶菌的形态特点，并分析不同条件下酶的特性。

【实验原理】淀粉酶广泛在于动植物和微生物中，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。

淀粉酶种类繁多，特点各异，可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域。

在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程均有重要价值，如添加高温淀粉酶可提高啤酒质量，中温蒸煮条件下添加适当耐高温a-淀粉酶可提高糖化率及酒精出酒率，降低甲醇含量，提高酒精质量，同时可提高设备利用率等。

淀粉酶在面包焙烤过程中分解淀粉产生的可溶性糖被酵母转化成酒精和CO2气体，不仅能增加面包体积，同时还有改善面包表皮色泽、提高面包软度、延长保质期的作用，对面包冷却和冷冻也有重要作用。

由于微生物数量多，繁殖快，工业生产主要采用向生物发酵法大量生产该制剂。

本实验从土壤中分离的淀粉酶产生菌从温度、pH值两方面探讨其产酶的最适条件。

通过平板培养法，从样品中初步分离出淀粉产生菌株，再通过单菌落培养从而获得比较纯的菌种。

然后对其进行二级扩大培养，最终测定液体培养基菌液中被酶分解得到的葡萄糖含量来讨论菌株的最适条件（温度、pH值等），为工业街道淀粉酶及饲料添加剂提供候选菌株。

【仪器、材料和试剂】（一）仪器1、恒温培养箱2、高压蒸气灭菌锅3、摇床4、恒温水浴锅5、生物显微镜6、电子天平（二）材料样品一：存放过久发霉的麦芽和周围粉尘样品二：米饭生产线附近草坪上的土壤（三）试剂与器材1、锥形瓶（50ml、100ml、500ml等）2、培养皿（25个左右）3、大小试管（30个左右）4、移液枪（1000μl、100μl）及大小枪头若干5、酒精灯、接种针等6、牛肉膏或酵母膏7、蛋白胨8、NaCl9、可溶性淀粉10、琼脂11、卢戈氏碘液11、草酸铵结晶紫12、碘液13、95%酒精14、蕃红染色液15、蒽胴试剂（现配）16、葡萄糖标准液(0.1 g/L)实验环节1 产淀粉酶菌株的初筛【实验步骤】1、称取一个样品5g，倒入盛有45mL无菌水带塞的三角锥形瓶中，摇床振荡30min制成样品悬液记为10-1土壤稀释液；2、用无菌移液管吸取10-1的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中吹吸数次混匀即为10-2稀释液，照此方法分别制成10-2~10-9稀释液；3、分别取10-5、10-6、10-7、10-8、10-9土壤稀释液各0.5mL，涂布于平板培养基表面，一个稀释度涂布接种2块平板，37℃下恒温培养16h ；4、待长出菌落后滴加卢戈氏碘液，挑取有明显淀粉水解圈的单菌落，作为初筛菌株。

产淀粉酶（α-淀粉酶）细菌菌株筛选一、实验目的：1.掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。

2.巩固以前所学的微生物学实验技术。

3.学习淀粉酶活性的测定方法。

二、实验原理:1.α—淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌,广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中.2.从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、富集培养、初步筛选、分离纯化和性能测定。

a)采样:即采集含菌种的样品采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。

在土壤中几乎各种微生物都可以找到,因而土壤可说是微生物的大本营。

例如厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多。

b)富集培养:富集培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质,并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖,从而便于我们从其中分离到这类微生物。

c)初步筛选：i.（选择培养基）初筛使用选择培养基对菌种进行培养，通过培养基的特殊成分,来筛选出目的菌种，从而进行培养.ii.（鉴别培养基）初筛利用鉴别培养基，通过添加一些特殊的试剂或成分来鉴别出目的菌种，从而筛选出来并对其进行培养。

d)分离纯化：通过上述的筛选只能说我们要分离的目的菌种已经存在,但还要把夹杂在其中的杂菌除去，从而得到纯种的菌落。

纯种分离的方法很多，主要有:平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。

e)性能测定：分离纯化得到的菌种之后，所分得的菌种是否具有实验所要求的性能,还必须要进行性能测定后才能决定取舍。

三、实验材料:1.培养基配制：a)培养基按以下比例配制后，加蒸馏水调至100%；b)富集培养基：可溶性淀粉1％、蛋白胨1%、葡萄糖0。

5％、NaCl 0.5％、牛肉膏0.5％、pH7。

0；c)分离培养基：玉米粉2％、黄豆饼粉1。

5％、琼脂粉0.8%、CaCl 0。