产淀粉酶的芽孢杆菌筛选ppt课件

从土壤中筛选产淀粉酶的菌株(四川化工职业技术学院食品1131)总述：查资料可知在土壤中从在多种可产淀粉酶的菌种，并且芽孢杆菌是不错的菌种，因此，采集土样，对土壤中的芽孢杆菌进行分离纯化，就可得到理想菌株。

在菌株的初选过程中采用涂布平板法，把配好的培养基灭菌后倒成平板，再把稀释好的土样涂布到平板上，置于适宜的条件下进行培养。

24h后对其进行鉴定，鉴定的方法是在培养好的菌株上滴加淀粉溶液，周围出现透明圈的为产淀粉酶的菌株，并且透明圈与菌落直径的比值越大，说明菌种越纯或菌株的生产性能越高。

然后再进行复选，复选时采用平板划线法或斜面划线法，挑取的菌落为透明圈与菌落直径比值较大的，进行多步筛选就可得到较纯的菌株。

实验流程待测数据：透明圈直径菌落直径摘要：查资料可知枯草芽孢杆菌能产生淀粉酶，因此从四川化工职业技术学院的土壤中筛选产淀粉酶的细菌菌株，利用五点取样采集土样，再用涂布平板法对菌株进行初步培养，在培养出的菌落周围滴淀粉溶液，对周围出现透明圈的菌落在进行平板划线培养，在地如淀粉溶液鉴定，对周围出现透明圈的菌落进行斜面划线培养，就可得到较纯的产淀粉酶的菌株。

引言：芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一。

早在1835年，Ehrenberg所描述的“Vibriosubtilis”即是现在大家熟悉的“枯草芽孢杆菌”，它是由Cohn于1872年正式命名的，现作为芽孢杆菌属(Bacillaceae)的模式菌株[1]。

从生物学特性来讲，枯草芽孢杆菌具有典型的芽孢杆菌特征，其细胞呈直杆状，大小(0.8-1.2)μm×(1.5-4.0)μm，单个，革兰氏染色阳性，着色均匀，可产荚膜，运动(周生鞭毛)；芽孢中生或近中生，小于或等于细胞宽，呈椭圆至圆柱状；菌落粗糙，不透明，扩张，污白色或微带黄色；能液化明胶，胨化牛奶，还原硝酸盐，水解淀粉，为典型好氧菌[2]。

1997年，Kunst F.等人首先完成了枯草芽孢杆菌的完整基因组序列测定，并将结果发表在《Nature》杂志上[3]。

微生物综合实验：土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定姓名:李青嵘班级:生工102学号:1014200044同组组员:黄得凤同组组员:张旭霞摘要本实验通过90?水浴20min预处理，杀死无芽孢菌体，再以弱选择性淀粉培养基和稀释涂布平板法对土壤中产淀粉酶芽孢杆菌进行初步筛选，又通过分区划线法对初筛菌株进一步分离纯化，得到两株纯培养的芽孢杆菌。

并通过耐盐试验、明胶试验、糖发酵试验、VP试验、吲哚试验，等多项生理生化实验对筛选出来的菌种进行鉴定，鉴定结果均为蜂房芽孢杆菌。

进一步通过3，5-二硝基水杨酸显色法对菌种的淀粉酶活力进行鉴定，测定结果分别为10.68MMU，12.64MMU。

关键词:淀粉酶，芽孢杆菌，酶活测定1. 前言淀粉酶是催化淀粉水解的一类酶的总称，广泛存在于动物、植物和微生物中。

目前淀粉酶广泛应用多种领域，在发酵工业中淀粉酶可用于淀粉原料的液化及糖化工艺;在食品工业中淀粉酶可用于面包焙烤，使其体积更大，颜色更好，颗粒更柔软;在农业中淀粉酶可作为饲料添加剂，降解饲料中淀粉营养成分以利于动物吸收利用;此外，淀粉酶在医疗卫生、废料处理、纺织印染等领域都有广泛应用。

目前生产应用的淀粉酶主要来源于微生物，并集中在几种细菌和真菌中，尤其以芽孢杆菌所产的淀粉酶较多。

其原因首先芽孢杆菌属(Bacillus)中能产生淀粉酶的菌种较多;其次，芽孢杆菌属产的淀粉酶有较好的应用价值，如凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌产的淀粉酶具有耐热性;再次，芽孢杆菌应用历史悠久，广泛用于饲料添加剂，其安全性有保证。

本文主要从土壤中筛选产淀粉酶的芽孢杆菌，分离纯化，并进行酶活测定，从而获得有经济价值比较高的菌株。

2. 材料与方法2.1. 实验材料2.1.1. 土样的采集从广州大学B-8门前采集土样,g，每天加入2 g淀粉和10 ml水进行培养5天。

土壤中产淀粉酶的芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定13级生技426摘要本实验从土壤中分离出能产淀粉酶的芽孢杆菌并对其进行鉴定、保存，实验中涉及菌株的分离纯化、菌株的形态学鉴定和生理生化鉴定，根据伯杰氏细菌学手册鉴定其种属。

实验中通过80℃水浴20min预处理，杀死无芽孢菌体，筛选出芽孢杆菌；再用稀释涂布平板法对芽孢杆菌进行初步筛选；又通过分区划线法对初筛菌株进一步分离纯化；最后用选择性淀粉培养基进行筛选，得到纯培养的产淀粉的芽孢杆菌。

最后并通过耐盐试验、明胶试验、糖发酵试验、VP试验、吲哚试验等多项生理生化实验对筛选出来的菌种进行鉴定。

关键词：淀粉酶芽孢杆菌生化鉴定一、引言芽孢杆菌属(Bacillus)是一类好氧或兼性厌氧，产生抗逆性内生孢子的杆状细菌。

多为腐生菌，主要分布于土壤、动植物体表及水体中。

由于芽孢杆菌属的细菌可以产生多种有用代谢产物，芽孢又是菌体度过不良环境的休眠体。

因此，在工、农业生产上有较高的应用价值。

菌体杆状，直或接近直，0.3 – 2.2X1.2 – 7.0微米。

多数运动，鞭毛典型侧生，形成抗热内生孢子。

在一个孢子囊细胞中，孢子不多于1个。

暴露与空气中时，不妨碍孢子的形成。

革兰氏反应为阳性，仅在生长早期为阳性、阴性。

有机体化能营养，利用多种底物进行严格呼吸代谢，严格发酵代谢或呼吸和发酵二者兼有的代谢。

在呼吸代谢中，最终的电子受体是分子氧，在一些种中可以用硝酸盐代替氧，大多数种产接触酶，严格好养或兼性厌氧。

淀粉酶是一种用途极为广泛的生物催化剂，可应用于面包制造业淀、粉的糖化和液化、纺织品脱浆、造纸、清洁剂工业、化学、临床医学的分析和制药业等。

淀粉酶家族包括α-淀粉酶，β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。

二、实验目的1．了解微生物分离纯化的原理及微生物分离纯化常用方法和技术；2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理及方法；3．掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理及方法；4．培养学生自行设计实验流程、综合分析解决问题及判断实验结果的能力；5．对所学习过的微生物实验方法进行综合技能训练；6．从不同环境土壤样品中筛选出能产淀粉酶的芽孢杆菌，并分析比较各产淀粉酶菌株的产淀粉酶活力及总结各芽孢杆菌在土壤中的分布情况。

产淀粉酶菌株的分离及筛选摘要：【实验目的】1学习从土壤等环境中分离微生物的技术。

2了解产淀粉酶菌株的分离方法。

3观察产淀粉酶菌的形态特点，并分析不同条件下酶的特性。

【实验原理】淀粉酶广泛在于动植物和微生物中，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂.。

【实验目的】1学习从土壤等环境中分离微生物的技术。

2了解产淀粉酶菌株的分离方法。

3观察产淀粉酶菌的形态特点，并分析不同条件下酶的特性。

【实验原理】淀粉酶广泛在于动植物和微生物中，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。

淀粉酶种类繁多，特点各异，可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域。

在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程均有重要价值，如添加高温淀粉酶可提高啤酒质量，中温蒸煮条件下添加适当耐高温a-淀粉酶可提高糖化率及酒精出酒率，降低甲醇含量，提高酒精质量，同时可提高设备利用率等。

淀粉酶在面包焙烤过程中分解淀粉产生的可溶性糖被酵母转化成酒精和CO2气体，不仅能增加面包体积，同时还有改善面包表皮色泽、提高面包软度、延长保质期的作用，对面包冷却和冷冻也有重要作用。

由于微生物数量多，繁殖快，工业生产主要采用向生物发酵法大量生产该制剂。

本实验从土壤中分离的淀粉酶产生菌从温度、pH值两方面探讨其产酶的最适条件。

通过平板培养法，从样品中初步分离出淀粉产生菌株，再通过单菌落培养从而获得比较纯的菌种。

然后对其进行二级扩大培养，最终测定液体培养基菌液中被酶分解得到的葡萄糖含量来讨论菌株的最适条件（温度、pH值等），为工业街道淀粉酶及饲料添加剂提供候选菌株。

【仪器、材料和试剂】（一）仪器1、恒温培养箱2、高压蒸气灭菌锅3、摇床4、恒温水浴锅5、生物显微镜6、电子天平（二）材料样品一：存放过久发霉的麦芽和周围粉尘样品二：米饭生产线附近草坪上的土壤（三）试剂与器材1、锥形瓶（50ml、100ml、500ml等）2、培养皿（25个左右）3、大小试管（30个左右）4、移液枪（1000μl、100μl）及大小枪头若干5、酒精灯、接种针等6、牛肉膏或酵母膏7、蛋白胨8、NaCl9、可溶性淀粉10、琼脂11、卢戈氏碘液11、草酸铵结晶紫12、碘液13、95%酒精14、蕃红染色液15、蒽胴试剂（现配）16、葡萄糖标准液(0.1 g/L)实验环节1 产淀粉酶菌株的初筛【实验步骤】1、称取一个样品5g，倒入盛有45mL无菌水带塞的三角锥形瓶中，摇床振荡30min制成样品悬液记为10-1土壤稀释液；2、用无菌移液管吸取10-1的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中吹吸数次混匀即为10-2稀释液，照此方法分别制成10-2~10-9稀释液；3、分别取10-5、10-6、10-7、10-8、10-9土壤稀释液各0.5mL，涂布于平板培养基表面，一个稀释度涂布接种2块平板，37℃下恒温培养16h ；4、待长出菌落后滴加卢戈氏碘液，挑取有明显淀粉水解圈的单菌落，作为初筛菌株。

从土壤中分离和筛选产淀粉酶活性的芽孢杆菌及部分鉴定试验一、实验目的1、通过本实验的学习，学习掌握从环境中分离产淀粉酶菌株以及菌株初步鉴定的方法；2、巩固微生物分离纯化、细菌生理生化鉴定,对所学习过的微生物学实验方法进行综合技能训练；3、培养综合利用微生物学、生物化学等相关知识，自行设计、实施并判断实验结果的能力。

4、根据所学知识自主设计实验方案，在实验方案通过审核后组织实施，最终要求获得产淀粉酶的菌株。

二、实验原理1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。

待实验前取样即可。

2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。

在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。

3、芽孢是菌体生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。

它帮助菌体度过不良环境，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。

细菌富集一段时间后，生长环境不利，会产生芽孢，再在80-90℃温度下杀死菌体，可使芽孢得到富集。

4、芽孢杆菌属的共同特征是：革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP试验阳性；不产生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；营养体的最高生长温度大约从25℃到75℃以上；最低生长温度大约5℃到45℃；生长最低pH值，从—8到2左右；耐盐范围从低于2%的NaCl到25%NaCl；营养明胶（22℃）7天内液化1厘米或1厘米以上。

枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可产酸；作为营养生长的最低限培养基是无维生素的，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源。

5、在含有淀粉的鉴别培养基的平板上，具有产淀粉酶能力的芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。

a-淀粉酶高产菌株的分离鉴定及固定化枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌，是a-淀粉酶高产菌株之一，其菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。

需氧菌。

可利用蛋白质、多种糖及淀粉，在遗传学研究中应用广泛。

其芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。

广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。

广泛生长在中性的的含淀粉多的环境中，如富含淀粉的面粉厂、土壤等。

淀粉酶是一种用途极为广泛的生物催化剂，可应用于面包制作业、淀粉的糖化和液化、纺织品脱浆、造纸、清洁剂工业、化学、临床医学的分析和制药业等。

淀粉酶家族包括α- 淀粉酶、β- 淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。

α-淀粉酶为内切酶，以无规则的方式切开淀粉分子内部的α- 1，4 糖苷键，而使淀粉生成糊精和低聚糖，是一种钙离子依赖性酶。

β- 淀粉酶从非还原性末端顺次切下麦芽糖，为外切酶。

葡萄糖淀粉酶是一种作用于α- 1，4 糖苷键的外切酶，从非还原糖末端切下葡萄糖分子。

a-淀粉酶是一种胞外酶，由于酶纯化等操作往往导致酶活性和稳定性都受影响，而利用细胞固定化可以很好的解决这一问题，其中α -淀粉酶的固定化交联法是目前比较理想的方法。

另可尝试探索用一定浓度的凝胶包埋枯草芽孢菌或用吸附法、交联法将枯草芽孢杆菌固定化，使菌体不能流动而酶可以存在反应液里。

凝胶柱底部可选用一定大小的半透膜使酶和淀粉不能流出反应凝胶柱，而产物可以流出。

【实验一】一、a-淀粉酶生产菌种的分离与培养、筛选二、【实验原理】大多数枯草芽孢杆菌好氧，最适生长温度为32℃,PH为7.2，转速为140r/min，接种量为9％，芽孢率生长最适温度36℃，最适PH为7.2，最适转速120r/min。

在以淀粉为碳源的固体培养基上用划线法分离纯化出产a-淀粉酶的菌株，根据是否可产生透明圈来筛选。

透明圈越大，产酶能力越强。

三、【实验仪器和材料】1、试剂：0.1%吕氏(Loeffier)美蓝染液配制方法：A 液：美蓝(methylene blue, 又名甲烯蓝)0.3 g, 95%乙醇30 ml；B 液：0.0l% KOH l00ml。