产淀粉酶细菌菌株的筛选和选育
邢大鹏
（合肥工业大学生物与食品工程学院2008级食品科学与工程专业08-1班）
摘要：从合肥工业大学校园内的土壤中筛选到一株产淀粉酶的细菌菌株。
形态及生理生化特征测定结果表明，菌株与芽孢杆菌属(Bacillaceae)中的枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisCohn)种的特征基本一致。
然后利用划线分离法和富集培养制备一定量的枯草芽孢杆菌，最后利用DNS法测定其产酶活力。
关键词：淀粉酶，产酶，细菌，枯草芽孢杆菌
Amylase production screening and selection of bacteria strains
Xing Dapeng
Abstract: From the Hefei University of Technology campus in the A strain of soil amylase producing bacteria strains. Morphological, physiological and biochemical characteristics of test showed that, strains and Bacillus (Bacillaceae) in Bacillus subtilis (BacillussubtilisCohn) basically the same kinds of characteristics. Then use the train crossed separation and enrichment of preparation of certain bacillus subtilis, finally, using the DNS method for determining the enzyme production vigor.
Key words: amylase, enzyme production, bacteria,Bacillus,stubtilis.
芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一。
早在1835年，Ehrenberg所描述的“Vibriosubtilis”即是现在大家熟悉的“枯草芽孢杆菌”，它是由Cohn于1872年正式命名的，现作为芽孢杆菌属(Bacillaceae)的模式菌株[1]。
从生物学特性来讲，枯草芽孢杆菌具有典型的芽孢杆菌特征，其细胞呈直杆状，大小(0.8-1.2)μm×(1.5-4.0)μm，单个，革兰氏染色阳性，着色均匀，可产荚膜，运动(周生鞭毛)；芽孢中生或近中生，小于或等于细胞宽，呈椭圆至圆柱状；菌落粗糙，不透明，扩张，污白色或微带黄色；能液化明胶，胨化牛奶，还原硝酸盐，水解淀粉，为典型好氧菌[2]。
1997年，Kunst F.等人首先完成了枯草芽孢杆菌的完整基因组序列测定，并将结果发表在《Nature》杂志上[3]。
工业酶的生产是工业微生物发酵的重要组成部分。
据来自BBC的统计数字，2004年全球酶的交易额达到20.0亿美元(15.3亿欧元)，其中食品酶占29%，饲料酶占15%，
一般的工业酶占56%。
枯草芽孢杆菌是当今工业酶生产应用最广泛的菌种之一，据不完全统计，枯草芽孢杆菌所产的酶占整个酶市场的50%。
由于其产酶量高、种类多、安全性好和环保等优点，在现代工业生产中被广泛用作生产菌种，其发酵生产的酶已在食品、饲料、洗涤、纺织、皮革、造纸和医药等领域均发挥着十分重要的作用。
枯草芽孢杆菌生境多样，可利用的营养物质种类十分丰富，这决定了其自身含有丰富的产酶系统，具备生产多种酶的应用潜力。
研究资料表明，枯草芽孢杆菌能够产生蛋白酶、α2淀粉酶、纤维素酶、β2葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶等十几种酶[4]。
枯草芽孢杆菌生产的蛋白酶、淀粉酶是工业酶中应用最为广泛的酶，仅二者就占到了整个工业酶市场的50%[5]。
其中，淀粉酶的生产和应用处于整个酶制剂的首位，其最早是在20世纪初，由德国的Boiden和Effront先后从枯草芽孢杆菌培养液中分离出的；蛋白酶主要用于制革、丝绸工业及制造加酶洗涤剂等方面。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌种来源：筛选的土壤来自合肥工业大学主教学楼前的绿化带。
1.1.2 培养基：
淀粉培养基: 可溶性淀粉1%、蛋白胨1% 、
葡萄糖0. 5%、NaCl 0. 5%、牛肉膏0. 5%、琼脂粉0. 8% ; 种子培养基: 牛肉膏0. 5%蛋白胨1%、NaCl 0. 5% 、可溶性淀粉0. 5%, pH 值7. 0; 发酵培养基: 玉米粉2%、黄豆饼粉1. 5% 、CaCl2 0. 02%、MgSO4 0. 02%、NaCl 0.
25% 、K2HPO4 0. 2%、柠檬酸钠0. 2%、硫酸氨0. 075% ( 溶解后加) 、
Na2HPO4 0. 2% , pH值7. 0。
1.1.3仪器：分光光度计,购离心机，全温摇床.
1.2 菌种筛选
1.2.1初筛：从主教前的小树林中池塘边采集土样，称取5g土样，无菌水溶解初筛:附近采集土样, 称取5 g土样,放入装有 45mL无菌水的三角瓶中, 放入装有45mL无菌水的三角瓶中, 震荡 20m in后静置 5m in ,然后进行浓度梯度稀释到10-6, 分别在10-4、10-5、10-6浓度下各取1 mL土壤稀释液制成混菌平板, 培养皿放入37 ℃
培养箱中培养 24 h .取出培养好的平皿, 在长出的菌落上滴加碘液,菌落周围如有无色透明圈出现, 说明淀粉被水解,即该菌株能产生淀粉.酶.
1.2.2 划线分离
从初筛所得的菌落中选择菌落周围透明圈和菌落直径之比值较大的菌落，进行划线分离。
将划线分离后的培养皿放入37 ℃培养箱中培养 24 h .
1.2.3 富集培养
从上一步中划线分离所得的培养基中挑选产酶活力较高的单个菌落，在斜面培养基上进行富集培养。
将斜面培养基放入37 ℃培养箱中培养 24 h .
1.2.4 发酵培养
从斜面培养基上挑选生长状况良好的菌株转移到发酵培养基上，在后,无菌操作加入培养基中。
发酵的条件为 37℃， 200 r /m in，24h。
2．结果与分析
2.1.1 筛选结果及分析:
在自然界的土壤中存在能产生淀粉酶的芽孢杆菌，通过土样稀释、加热土样悬液、杀死非芽孢细菌、平板分离可获得疑似芽胞杆菌的单菌落，将单菌落点接含有淀粉的平板，具有产淀粉酶能力的芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围也会出现水解圈，但肉眼不易分辨，用碘液染色法染色后显现出透明圈，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。
由此可将产淀粉酶能力的菌株分离。
透明圈与菌落直径比值的大小在一定程度上反映了
分析：菌株产生淀粉酶的能力：前者与后者的比值越大，表明分泌的淀粉酶越多，水解淀粉的能力也就越强。
数据：H/C 1.20
2.1.2 部分实验结果照片
图1 10-6划线分离所得菌落图2 10-5划线分离所得菌落
图3 10-4划线分离所得菌落
表1 淀粉酶标准曲线的制作 试管号 麦芽糖标准液
（ml ）
麦芽糖 含量（mg ） 蒸馏水（ml ） DNS （ml ） 1
0 0 9 2 2
0.2 0.2 9 2 3
0.4 0.4 9 2 4
0.6 0.6 9 2 5
0.8 0.8 9 2 6
1.0 1.0 9 2
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.20.40.60.81 1.2系列1
3 讨论与体会
讨论：
1.实验开始前寻找方案时，我们的课题是《一般产淀粉酶细菌菌株的筛选和选育》，由于未能明确具体方向，查找资料有些杂乱无章，最后我们准备了几套方案，以待确定。
实验时挑选了其中一套方案，经老师检查和修改后，确定此套方案可行。
2．依照此套实验方案进行试验，实验前期基本顺利。
只是中间我和队友配制的一些溶液等留在下个步骤用的制剂不知原因被人倒掉，台面也被搞乱，于是我们只好重新配制。
3.划线培养筛选时，由于无菌操作过程被染菌，导致部分划线培养基单菌落现象不明显。
体会：由于划线操作不熟练，导致筛选培养基菌落分离不明显，实验操作技能还有待提高。
特别致谢：
指导老师李军红，实验室仪器负责老师杨老师，队友蔡俊清等。
参考文献
[1]刘志恒.现代微生物学[M].北京:科学出版社,2002:92-99.
[2]张丽苹, 徐岩. 酸性淀粉酶生产菌株的选育的初步研究[ J].工业微生物,2002,32( 4): 12- 14.
[3] 张龙翔,张廷芳,李令媛.生化实验方法和技术[M].北京:高等教育出版社,1982.
[4]马明,杜金华.枯草芽孢杆菌酶在工业生产中的应用[J].山东科学,2006(3):35-37.
[5]刘秀花.芽孢杆菌的应用研究及进展[J].商丘师范学院学报,2005 ,21(5):135-137.
{6}卢涛,舒丹,张杰,等.高温淀粉酶产生菌株的选育[ J].四川大学学报:自然科学版, 2002, 39(6):1131-1133.。
