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实验一人类体细胞染色体标本制备与核型分析Metaphase Chromosome Preparation and Analysis of Karyotype【实验目的】1．熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法及染色体标本的制备方法。
2．熟悉人类染色体G显带标本制备与分析。
【实验原理】染色体是在显微镜下可见细胞有丝分裂过程中出现的结构。
因此，必须获得染色体标本才能进行检查分析，通常情况下，都是利用外周血淋巴细胞进行核型分析。
正常情况下，人体外周血淋巴细胞不再分裂，但植物血凝素（PHA）可刺激血中的淋巴细胞转化成淋巴母细胞，使其恢复增殖能力。
因此，可采取少量外周静脉血，做短期培养，培养至72小时细胞进入增殖旺盛期，此时加入秋水仙素抑制细胞分裂，使细胞分裂停止在中期以获得足够量的分裂期细胞，经低渗、固定、制片、染色后镜下观察进行核型分析。
上述制备的染色体标本经胰蛋白酶消化、Giemsa染色后，可在染色体纵轴上显示出着色深、浅相间的横纹——带，表明每条染色体的特征。
【实验用品】1．采血器材、酒精灯、培养瓶、超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、离心机、刻度离心管、乳头吸管、试管架、量筒、试剂瓶、载玻片、吹风机、托盘天平、显微镜、镜油、二甲苯、擦镜纸、镊子、烧杯、记号笔、玻片架、火柴、10ml注射器。
2．RPMI 1640液体培养基、小牛血清、肝素（500 U/ml）、植物血凝素（PHA）、秋水仙素（10mg/ml）、KCl低渗液（0.075mol/L）、甲醇、冰乙酸、Giemsa 原液、磷酸缓冲液（PH6.8）。
3．2.5％胰酶溶液（Hanks液配制）、0.4％酚红、Giemsa染色液、1N盐酸、1N氢氧化钠。
【实验步骤】1一．外周血淋巴细胞染色体标本制备与分析1. 采血及接种培养1.1 在酒精灯火焰上，用灭菌注射器（一次性注射器）抽取肝素0.2ml，使肝素湿润至管壁。
1.2 常规消毒后，采集外周静脉血5ml，转动注射器使血液与肝素混匀。
人类染色体标本制备及核型分析引言：一、人类染色体标本制备步骤：1.收集样本：收集需要研究的人类标本，可以是血液、组织、胎儿细胞等。
2.细胞培养：将收集的样本进行细胞培养，通常采用体外培养的方式，如使用无菌培养皿和细胞培养基。
3.处理样本：细胞培养达到一定数量后，可以使用震荡器等设备将细胞从培养皿上剥离下来，制备成单细胞悬液。
4.固定细胞：将细胞悬液进行固定处理，一般使用醋酸乙酯等有机溶剂将细胞固定在载玻片上。
5.染色：染色是核型分析的关键步骤，可以使用吉姆萨染色法、G显带染色法等多种染色方法，使染色体可见并呈现出特定的形态和颜色。
6.干燥和贴片：将染色的载玻片进行干燥处理，然后使用透明胶带将玻片贴到载玻片上。
二、核型分析方法：1.显微镜观察法：使用光学显微镜对染色体进行观察和分析，直接通过目视的方式判断染色体的形态和数量。
2.数字图像分析法：使用计算机图像分析系统对染色体图像进行数字化处理，通过计算机算法分析染色体的长度、形态、染色体异常等指标。
3.荧光原位杂交法（FISH）：利用标记有特定荧光标记物的探针与染色体特定区域发生互补结合，从而通过荧光显微镜观察染色体的特定区域。
4.光学显微镜配合显影法：使用特定的显影剂，使染色的染色体呈现出明亮的色带，详细观察和分析色带的大小、位置及形态等。
三、核型分析的意义：1.遗传病诊断：染色体核型异常与一些遗传疾病有关，通过核型分析可以确定染色体异常和遗传病的关联。
2.胎儿异常筛查：通过对孕妇的羊水或绒毛进行染色体核型分析，可以早期发现胎儿的染色体异常，如唐氏综合征等。
3.种群遗传学研究：核型分析可以用于研究人类群体的遗传多样性和进化关系，了解不同人群间的遗传差异。
4.基因定位：核型分析可以帮助确定染色体上的基因位置，进而研究与之相关的遗传疾病或性状。
结论：人类染色体标本制备及核型分析是一项重要的遗传学研究手段，通过制备标本和观察分析染色体，可以了解人类的遗传信息和与染色体异常相关的疾病。
实验五人类染色体标本制备【目的要求】1 •熟悉人外周血淋巴细胞培养的原理。
2.初步掌握人类外周血淋巴细胞染色体标本的制备方法。
3•了解正常人非显带染色体核型特征及核型分析方法。
【实验原理】人类间期细胞核中的遗传物质染色质，在细胞进入分裂期时，经逐级螺旋形成染色体。
在分裂期的中期，染色体达到最大程度的凝集，表现为短而粗的典型结构。
人外周血的有形成分中，只有白细胞有核，而白细胞中只有淋巴细胞（主要是小淋巴细胞）具有潜在的细胞分裂能力。
培养液中加入有丝分裂刺激剂植物血凝素（PHA）可使处于G期、具有潜在分裂能力的淋巴细胞转化为具有分裂能力的淋巴母细胞，并进入旺盛的有丝分裂周期；加入纺锤体抑制剂秋水仙素可使处于分裂过程的淋巴细胞停滞在分裂中期，在收获细胞时，用低渗剂0.075mol/L KCI对细胞进行低渗处理，可使胞膜胀破，染色体均匀分散；经离心、固定、制片等过程，最终可获得便于观察分析的染色体标本。
制备的染色体标本片，不经特殊处理，直接染色，在显微镜下观察识别，并进行核型分析的过程称为染色体非显带核型分析。
【实验用品】（一）材料：人外周静脉血。
（二）器材：吸管、刻度离心管、量筒、5ml注射器、6号针头、台式离心机、试管架、冷藏载玻片（一端磨砂）、铅笔、酒精灯、超净工作台、恒温水浴箱、载玻片、止血带、酒精棉球、显微镜、废液缸。
（三）试剂1. RPMI1640 培养液（1） RPMI1640 : RPMI1640固体培养基10.4 g,溶于1000 ml双蒸水中，抽滤除菌。
（2） RPMI1640培养液：每100 ml RPMI1640培养液中含RPMI 1640 80 ml、灭活的小牛血清20 ml、PHA 50 mg 青霉素（终浓度100 U/ml）、链霉素10000卩g （终浓度100卩g /ml）, 15磅、20min高压灭菌的NaHCO调pH至7.2〜7.4，分装20小瓶，每瓶5 ml。
（3）配制方法配制过程所需的玻璃器具先用浅水洗刷干净，烘干，放入清洁液中浸泡2d，取出后用自来水冲洗15次，蒸馏水冲洗3次，双蒸水冲洗1次，烤干后包装，15磅20 min高压灭菌。
