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二氢杨梅素的分离及药理作用严赞开1朱慧玲2胡春菊3黄先菊2(1. 韩山师范学院化学系, 广东潮州 521041; 2. 长江大学医学院, 湖北荆州434000;3. 韩山师范学院医务所, 广东潮州 521041)摘要探讨了二氢杨梅素的最佳提取、分离工艺及药理作用。
(1) 最佳提取工艺为: 以50 %乙醇为提取剂, 按45倍蛇葡萄干叶的量加入50 %乙醇, 保温回流2 h, 提取效率为17.8 %。
(2) 最佳分离工艺为: 采用二氯甲烷除色素, 乙醇-水重结晶, 并以硅胶G为固定相, 乙酸乙酯: 石油醚=2: 1（v/v）为流动相, 分离得到白色针状晶体(Rf=0.33), 经UV、IR及Rf证实为二氢杨梅素。
(3) 研究了二氢杨梅素对多种物质诱导的子宫平滑肌收缩的抑制作用, 结果表明其对家兔离体子宫平滑肌有较好的松弛作用。
关键词二氢杨梅素, 分离, 药理试验藤茶, 又名甜茶藤，系葡萄科蛇葡萄属植物显齿蛇葡萄的嫩茎叶, 主要分布于广东、广西、云南、贵州、湖南、湖北、江西、福建等省区[1]。
我国广西、湖南等省区壮族和瑶族人民常用其茎叶作饮料[2]。
现代药理研究表明, 蛇葡萄该属植物具有明显降脂、降胆固醇、保肝利胆、抗癌、抗炎等作用[3]。
近年来，国内许多学者对蛇葡萄进行了化学研究，探明其主要活性成分为二氢杨梅素[4~7], 并对二氢杨梅素的提取方法进行了深入研究[8~12]。
本文在前人研究的基础上，系统地探讨了以湖北省恩施地区生产的藤茶为原料，从中提取、精制和分离二氢杨梅素的工艺流程；并讨论了二氢杨梅素对多种物质诱导的子宫平滑肌收缩的抑制作用，为生产和应用二氢杨梅素提供科学依据。
1实验部分1.1仪器和材料TU-1900型双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；WQF-510型FTIR 傅立叶变换红外光谱仪，北京瑞科仪器分析公司；501系列超级恒温槽，上海恒平科学仪器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式多用真空泵，河南省巩义市英峪予华仪器厂；LMS-2B型二道生理记录仪，成都仪器厂; 肌张力换能器，贝科测控设备有限公司。
试验研究清洗世界Cleaning World第36卷第1期2020年1月0 引言二氢杨梅素（DMY ）是一种多酚羟基双氢黄酮醇，又称蛇葡萄素、双氢杨梅素等，属黄酮类化合物。
二氢杨梅素的药理实验表明，二氢杨梅素对大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌等均有抑菌作用。
同时细菌耐药性在日益增加，使抗生素效率大大降低，在应用西药抗菌治疗时遇到极大困难，而中药抗菌不良反应相对较轻，不易产生耐药性，且纯天然，低副作用，在畜牧业有很大的应用，能够代替抗生素和激素类药物作为一种新型的绿色添加剂使用。
二氢杨梅素又大量存在于葡萄科蛇葡萄属植物中，其中藤茶含量高达29%。
藤茶味甘、淡，性凉，具有多种生物活性：清热解毒、祛风湿、降脂降压、抗菌消炎、止咳、消炎、镇痛等。
经化学成分分析，发现藤茶的有效成分是黄酮类物质，如二氢杨梅素、龙涎香醇、杨梅黄素、杨梅戒等。
藤茶广泛分布于我国的广西、云南、湖南、江西、贵州等省区，尤其适应山间阴湿的环境中生长。
根据民间长期饮用实践和现代科学研究证实，野藤茶对因烟酒过度、油腻过多、肝火过旺引导起的身体不适、消化功能障碍等症，具有独特而灵妙的保健功效。
二氢杨梅素具有资源丰富、来源广，纯天然、安全、低副作用及提取工艺成熟等优点，极具开发利用价值，可在食品、医药、农畜等领域发挥有效的作用。
藤茶在我国广泛分布，且二氢杨梅素含量相对较高。
但目前对藤茶的开发利用较少，主要是加工成传统的茶叶产品利用，尚处于开发利用初级阶段。
因此，藤茶中二氢杨梅素的提取和利用一直是研究热点，可以发挥二氢杨梅素的优势，也能为藤茶的生产利用提供指导意义。
1 研究内容课题在水溶性重结晶法的基础之上加入微波辅助萃取，从藤茶中提取出二氢杨梅素，在以不同浓度的二氢杨梅素对普通面包作用，探究其抑菌作用。
1.1 实验材料藤茶、二氢杨梅素、无水乙醇、面包。
1.2 实验仪器数显恒温水浴锅、实验用微波、压力锅、电子天平、布氏漏斗。
1.3 实验方法（1） 样品预处理。
二氢杨梅素合成路线
二氢杨梅素的合成路线主要包括以下步骤：
1.提取：从藤茶中提取二氢杨梅素。
具体方法包括有机溶剂提取法、碱提取法、酶提取法及超临界流体萃取等。
2.纯化：通过真空浓缩、活性炭脱色、重结晶等步骤去除杂质，得到的终产品二氢杨梅素纯度达到98％以上，总得率达到75％以上。
3.合成：二氢杨梅素的合成方法有多种，包括在强碱条件下开环生成查尔酮，查尔酮经AFO反应生成杨梅素；加热条件下，在吡啶溶液中二氢杨梅素2、3位脱氢氧化可生成杨梅素；将二氢杨梅素与醇类混合，加入次氯酸钠和催化剂，待反应完全后继续加入次氯酸钠溶液，分离纯化可得杨梅素。
酶解法提取藤茶中二氢杨梅素的工艺优化摘要:本文通过酶解法来提取藤茶中的二氢杨梅素，并通过紫外-可见分光光度法测其含量。
对酶解法的各影响因素进行单因素试验，并通过正交试验对提取工艺进行了优化。
结果表明酶解法提取的最佳工艺条件为：酶解温度为50℃，酶解时间为3个小时，酶用量为6mg，pH为4.5。
此条件下二氢杨梅素的提取率为33.37%。
该工艺稳定可行，为藤茶中二氢杨梅素的提取开辟了新途径。
关键词：藤茶;二氢杨梅素;提取工艺;正交试验Abstract: Dihydromyricetin was extracted from ampelopsis by enzymatic hydrolysis extraction method and determined by ultraviolet spectrophotometric method. The influence factors of enzymatic hydrolysis single factor experiment was carried out and the extraction process was optimized by orthogonal test .The best extraction temperature,extraction time,enzyme dosage and pH value were 50℃，3h，6mg and 4.5，respectively.Under this condition,the extraction yield of dihydromyricetin was 33.37%.This method，which is stable and feasible, have open a new avenues of research for the extract of dihydromyricetin from ampelopsis grossedentata. Keywords: Ampelopsis grossedentata; Dihydromyricetin; Extraction process; Orthogonal test藤茶, 植物学名显齿蛇葡萄野生藤本植物[Ampelopsis grossedentata ( Hand - Mazz) W. T. Wang] , 主要分布于我国湖南、湖北、云南、贵州、广东、广西、福建等地,在湖南、湖北等省已有一定规模的人工栽培[ 1,2] 。
藤茶为药食两用植物, 最初作为一剂草药应用于民间[ 3] 。
因其外观和冲饮的口感特征, 而有“白猴”、“ 甘露茶”、“茅岩霉茶”、“野藤茶”、“龙须茶”等俗称[ 4, 5] 。
全株药用, 味甘、淡、性凉, 具有清热解毒、祛风湿、强筋骨等功效。
目前已对藤茶的化学成分进行了比较系统的研究，为藤茶的开发利用提供了理论基础。
到目前为止已经分离出数十种化合物。
目前对藤茶的化学成分研究主要集中在黄酮类化合物，黄酮类化合物为藤茶的主要成分，也是藤茶的主要活性成分，主要包括二氢杨梅素（dihydromyricetin）和杨梅素。
二氢杨梅素的结构式如下图所示：植物黄酮类化合物的提取, 以溶剂浸提法为主[ 13 ] 。
在溶剂浸提的基础上, 辅以超声波、微波手段, 以强化提取效果。
藤茶中的两种主要黄酮成分均属多羟基黄酮醇类化合物, 具极性,易溶于热水、乙醇等, 迄今为止, 对藤茶黄酮, 尤其是二氢杨梅素的提取, 以热水提取、乙醇回流提取为主, 以超声波或微波加以辅助。
传统的提取分离法存在着有效成分提取率低、杂质清除率低，能耗高、生产周期长等缺点，使天然药物提取工艺的发展受到制约。
随着工业工程技术的迅猛发展，一些现代高新技术不断被应用到天然药物生产中，尤其是酶技术不断在天然药物行业得到应用，酶解技术在天然药物提取中能显著提高目标成分的浸出率，比传统提取方法具有明显的优势。
本文以纤维素酶酶解藤茶叶细胞壁，采用热水浸提法提取藤茶中总黄酮物质。
藤茶中总黄酮以二氢杨梅素得率为指标单因素实验条件，并进一步研究了酶量、温度、时间、PH等因素四因素三水平正交实验，对提取工艺条件进行了优化，得出一条最佳的提取工艺。
1 实验部分1.1 实验材料1.1.1 实验仪器DJ_200A型电子天平（亚太电子天平厂）；电子万用电炉（北京中兴伟业仪器有限公司）；SHZ-D(iii)型循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂)；电热恒温鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；超声清洗机（宁波市海曙达胜超声波仪器厂）；玻璃砂芯过滤过滤装置（上海新亚净化器件厂）；SPD-20A-230V型高效液相色谱仪（岛津制造所）。
1.1.2 实验原料与试剂藤茶叶（贵阳省农科院提供）；二氢杨梅素标准品（纯度>98%）(上海佳和生物科技有限公司)。
无水乙醇（AR，重庆川江化学试剂厂）；丙酮（AR重庆川江化学试剂厂）；甲醇（DK，重庆川江化学试剂厂）；磷酸（AR，天津市登科化学试剂有限公司）；Alcl3 （AR 成都市科龙化工试剂厂）；冰醋酸（AR，天津恒兴化学试剂制造有限公司）；无水乙酸钠（AR，天津恒兴化学试剂制造有限公司）；纤维素酶(北京东华强盛生物科技有限公司)；水为蒸馏水。
2 实验方法2.1 二氢杨梅素含量的测定2.1.1 二氢杨梅素样品液制备称取藤茶5g,加入一定量的纤维素酶在一定温度，一定PH浸泡一定时间，然后再沸水中热提取，趁热用100目的双层滤布过滤，收集滤液，95%乙醇100ml定容备用。
2.1.2 对照品的制备精密称取二氢杨梅素标准品4.169mg,于100ml容量瓶中加95%乙醇充分震荡溶解得得41.69μg/ml二氢杨梅素标准液备用。
2.1.3测定波长的选择精确量取0.3ml二氢杨梅素标准液加入10ml的容量瓶中，准确加入3mL 5%ALCL3，用95%乙醇定容至刻度，混合摇匀，室温放置40min，空白组以3mL5%ALCL3，用95%乙醇定容至刻度。
在200—400nm范围内扫描,所得结果见图1。
2.1.4 标准曲线的制备取洁净的10mL容量瓶，用移液枪准确量取按2.2.2制备的二氢杨梅素标准品对照液1mL,1.5mL,2 mL，2.5mL,3mL,准确量取3mL 5%ALCL3加入容量瓶，用95%乙醇定容至刻度，混合摇匀，室温下放置40分钟，按2.2.3测定的最大吸收波长，测吸光度，以二氢杨梅素对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，所得结果见图2。
2.1.5 重复性试验按绘制标准曲线的测量方法，分别准确量取待测样品液4份，测定标准液的吸光度。
所得结果见表1。
2.1.6 稳定性试验准确量取待测样品液，按绘制标准曲线的测量方法，每隔半小时测定其吸光度，共测四次。
所得结果见表2。
2.1.7样品中二氢杨梅素含量测定准确量取1mL上述样品液注入100mL容量瓶中95%乙醇至刻度，然后从中量取1mL注入100mL容量瓶中95%乙醇至刻度，再从中量取0.4mL注入10mL容量瓶中，按上述测定吸光度方法在最大吸光度处测定其吸光度。
2酶解法提取二氢杨梅素正交实验运用L9（34）正交表，进行酶解温度，时间，PH值，酶用量四个因素三个水平的正交实验，确定酶解法提取二氢杨梅素的最佳提取工艺。
所得结果见表3、表4。
3 结果讨论3.1 波长选择最大吸收波长的选择由图可知样品和对照品的吸收图谱一致，都在311nm处有最大吸收，因此选择检测波长为311nm.3.2标准曲线的绘制经测得二氢杨梅素标品吸光度如图表2所示，以吸光度纵坐标Y,标品浓度为横坐标X进行作图，得回归方程 Y=0.0608X+0.0039,R2=0.9990,标准曲线见图2。
结果表明二氢杨梅素在4.169-12.507μg/ml范围内与吸光度呈良好线性关系。
3.3二氢杨梅素重复性实验从表中我们可以看到根据正交结果所确定的最佳提取工艺相对稳定，以最佳提取工艺提取得的藤茶中二氢杨梅素的平均得率为33.37%。
因此确定二氢杨梅素的最佳提取工艺是：准确称取藤茶5g于烧杯中，加入纤维素酶6mg，调节pH为4.5，放入温度恒定为50℃的水浴锅中反应3个小时。
用100目的双层虑布过滤，收集滤液，结晶、重结晶得到固体。
4 结论本文用纤维素酶分解藤茶叶细胞壁，使藤茶叶中的二氢杨梅素溶解出来。
通过对酶解温度，酶解时间，酶用量和pH几个因素进行了单因素试验和正交试验来探寻最佳工艺条件，得出的最佳参数为：酶解温度为50℃，酶解时间为3h，酶用量为6mg，pH为4.5。
相比于之前研究的热水提取法而言，该方法高效且更加节约能源，藤茶中的二氢杨梅素提取率为33.37%，高于热水浸提法，该方法为藤茶中二氢杨梅素的提取提供了一条新思路。
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