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苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白CryIA单克隆抗体的制备及在转Bt基因棉毒蛋白检测上的应用王保民;何钟佩;田晓莉【期刊名称】《棉花学报》【年(卷),期】2000(021)001【摘要】The spore/crystal complex was pre pared from Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD-1 and HD-73 during sporulation. The parasporal crystal was isolated from the spore crystal/complex by liquid two phased methods. CryIA and CryIA (c) were precipitated from parasporal crystal on PI4.4. The 130～140 kDa molecular weight protein was separated with sodium-dodecy-sulfate polyacrylamide gel (SDS - PAGE ) electrophoresis. Two polyclonal antibodies were acquired using CrylA , CryIA (c)as antigens. ELISA titer of the two antisera were＞ 1/100000, ＞ 1/100000, respectively. Four monoclonal antibodies ( A4FSF11, B4E6C7, B4E6D8 and B4FSG11) were produced using CryIA insecticidal crystal protein (ICP) to immune BALB/C mouse. A double sandwich ELISA coated with anti-CryIA (c) polyclonal antibody was established with B4E6D8 as sandwich antibody. The toxin level of NUCOTN33B and CCRI-30 in leaf was detected. The content was 23. 4 a nd 24. 7 ng·g-1 FW,respectively. The result was identical with the insecticidal effect.%用苏云金杆菌菌株HD-1和HD-73分别发酵培养制备了孢晶混合物,孢晶混合物经分离、纯化、电泳得到CryIA、CryIA(c)杀虫晶体蛋白.用CryIA和CryIA(c)分别免疫家兔制备了两种多抗.用CryIA免疫小鼠,经细胞杂交、融合、克隆后筛选出4个单克隆株系A4F5F11、B4E6C7、B4E6D8、B4F5G11.用CryIA(c)多抗包被,B4E6D8上清液作为夹心抗体成功地建立了双抗夹心 ELISA,并检测了中棉所30、NUCOTN33B蕾期叶片中毒蛋白的含量,结果分别为23.4ng·g-1 FW、24.7ng·g-1 FW.【总页数】6页(P34-39)【作者】王保民;何钟佩;田晓莉【作者单位】中国农业大学作物化控中心,北京,100094;中国农业大学作物化控中心,北京,100094;中国农业大学作物化控中心,北京,100094【正文语种】中文【中图分类】S562.035【相关文献】1.转Bt基因植物中杀虫蛋白的酶联免疫检测技术研究Ⅰ.Bt菌HD-1的杀虫晶体蛋白抗原制备 [J], 严吉明;叶华智;张敏;伍光庆2.转Bt基因植物中杀虫蛋白的酶联免疫检测技术研究Ⅱ.Bt杀虫晶体蛋白抗体的制备 [J], 严吉明;崔林开;叶华智;张敏;伍光庆3.杀虫晶体蛋白基因CryIA（c）表达载体构建与表达研究 [J], 秦新民;刘佩瑛4.苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry1D新基因的克隆与特性 [J], 余宗兰;贺利业;孙宏伟;李平;郑爱萍5.转Bt基因棉花杀虫晶体蛋白的表达及光合特性的研究 [J], 孙彩霞;陈利军;武志杰;吴琼;陈翠薇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
苏云金芽孢杆菌cry1Ea基因的克隆及生物信息学分析彭艳;吴松青;黄张敏;关雄【期刊名称】《中国农学通报》【年(卷),期】2008(24)9【摘要】不同来源的苏云金芽孢杆菌能产生多种多样的晶体(Cry)蛋白。
基于这个特性,人们可以通过基因工程的手段向工程菌中转入编码多种Cry毒素的基因来控制虫害。
通过DNA重组技术,从BtHZM2菌株中克隆出了cry1Ea基因,对其进行了生物信息学分析,同源比对结果表明,cry1Ea8基因的核苷酸序列与已知cry1Ea 的同源性为99.77%～99.91%,对应的氨基酸序列同源性为99.49%～99.74%。
对cry1Ea8基因的分析还揭示出了cry1Ea8及其编码蛋白的一些生物和理化性质。
结构域预测表明,Cry1Ea8由3个结构域组成,其中N-末端螺旋状结构域与膜插入与孔隙形成有关,而第二和第三个结构域与受体的结合有关。
该研究为转基因抗虫植物和微生物杀虫工程菌的构建提供了新的基因来源。
【总页数】5页(P362-366)【关键词】cry1Ea基因;苏云金杆菌;分子克隆;生物信息学【作者】彭艳;吴松青;黄张敏;关雄【作者单位】福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室【正文语种】中文【中图分类】S476.11【相关文献】1.苏云金芽孢杆菌kurstaki亚种几丁质内切酶基因的生物信息学分析 [J], 钟万芳;阎文昭;蔡平钟;吴淑华;方继朝2.苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1A的克隆及生物信息学分析 [J], 赵直;吴钢;王闵霞;朱旭东;蒲志刚;张志勇;彭正松;蔡平钟3.苏云金芽胞杆菌cry1Ib2基因的克隆与生物信息学分析 [J], 关夏玉;张永嵘;黄天培;关雄4.苏云金芽孢杆菌新基因cry1Ab17的克隆和生物信息学 [J], 黄志鹏;关春鸿;黄必旺;邱君志;关雄5.苏云金芽孢杆菌LLP29菌株中ykkB基因的克隆、表达及活性分析 [J], 杨兆辉;汪子洋;杨文涛;蔡瑜婷;谭伟龙;黄恩炯;张灵玲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
文章编号:1001-4829(2010)02-0393-06 收稿日期:2009-12-20 作者简介:四川省农业科学院重点研究项目“主要农作物优质抗逆基因克隆与利用研究” 作者简介:赵 直(1986-),女,吉林四平人,硕士研究生,主要研究方向为应用微生物学,3为通讯作者。
苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1A 的克隆及生物信息学分析赵 直1,2,4,吴 钢3,王闵霞2,朱旭东4,蒲志刚2,张志勇2,彭正松13,蔡平钟23(1.西华师范大学,四川南充 637002;2.四川省农业科学院生物技术核技术研究所,四川成都 610066;3.四川省蚕业管理总站,四川成都 610041;4.中国水稻研究所,浙江杭州 310006)摘 要:以分离的3株苏云金芽孢杆菌质粒为模板,通过设计一对特异引物,PCR 扩增得到3条全长3.6kb 的基因序列,其各自都包含一个完整的开放阅读框,编码序列全长分别是3468、3450、2697bp (Genebank 登录号分别为G Q385073,G Q385074,G Q385075);它们与cry1A 类基因同源性都高达95%以上;分别编码1159、1150和902个氨基酸。
并在此基础上采用生物信息学方法对这3个基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、疏水性/亲水性、亚细胞定位、跨膜结构域以及功能域等方面进行了预测和分析。
为转基因抗虫植物和微生物杀虫工程菌的构建提供了基因来源。
关键词:cry1A 基因;苏云金芽孢杆菌;克隆;生物信息学中图分类号:S432.4+2 文献标识码:AM olecul ar C lon i n g and Sequence Ana lysis of cry 1AGenes from B acillus thu ringiensisZ HAO Zhi 1,2,4,WU Gang 3,WANG M in 2xia 2,ZHU Xu 2dong 4,P U Zhi 2gang 2,Z HANG Zhi 2yong 2,PENG Zheng 2s ong 13,CA I Ping 2zhong 23(1.W est China Nor mal Sichuan Nanchong 637002,China; 2.I nstitute of B i otechnol ogy and Nuclear Technol ogy,Sichuan Acade 2my of Agricultural Sciences,Sichuan Chengdu 610066,China;3.SericulturalManage ment Stati on of Sichuan,Sichuan Chengdu 610066,Chi 2na; 4.R ice I nstitute of China,Zhejiang Hangzhou 310006,China )Abstract:Specific p ri m ers,which were synthesized according t o the conservative regi ons of cry1A gene,were used t o a mp lify genom ic DNA fr om three B acillus thuringiensis (B t )strains sreened by poly merase 2chain reacti on (PCR ).Three sequences of cry1A gene with whole length of 3.6kb was obtained,which contained a comp lete open reading fra me .These three full 2length coding sequences were 3468,3450and 2697bp (GenBank Accessi on Number G Q385073,G Q385074,G Q385075).Nucleotide sequencing showed that the sequences f or these three genes had more than 95%identical t o the known cry1A gene,which encoded 1159,962and 898a m ino acids res pectively .Some characters of these three genes that could encode a m ino acids were analyzed and p redicted by the t ools of bi oinf or matics in the foll owing as pects,inclu 2ding the compositi on of a m ino acid sequences,hydr ophobicity or hydr ophilicity,me mbrane s paning domain and tertiary structure of p r otein and functi on .It p r ovided ne w selecti on for devel opment of novel B t p r oducts based on its t oxins .Key words:cry1A gene;B acillus thuringiensis ;Molecular cl oning;B i oinf or matics 苏云金芽孢杆菌是一种在胞内能产生杀虫活性晶体蛋白(I nsecticidal crystal p r oteins I CPs )的革兰氏阳性菌。
苏云金芽孢杆菌cry1Da5基因的克隆与表达引言农业是国民经济的基础，而农作物的病虫害是限制农业生产发展的主要因素。
为了有效地解决农作物病虫害问题，生物农药逐渐受到了广泛的关注。
昆虫杀菌蛋白是一种使昆虫产生瘫痪和死亡的天然蛋白质，具有高效、低毒、无残留等特点，已成为农作物病虫害防治的主要手段之一。
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是一种广泛应用于农业生产的昆虫杀菌剂，其产生的杀虫晶体蛋白 (Cry) 具有高昆虫杀虫活性。
目前，cry1Da5基因已被广泛应用于转基因农作物中，以抵抗害虫的侵袭。
对cry1Da5基因的进一步研究具有重要的理论意义和应用价值。
一、cry1Da5基因的结构与功能cry1Da5基因是一种来源于Bt的昆虫杀虫晶体蛋白基因，具有较高的杀虫活性。
该基因编码的蛋白质主要是通过对昆虫肠道产生毒素作用，从而导致昆虫死亡。
cry1Da5基因包含了完整的起始密码子和终止密码子，编码长度为3696bp，由1231个氨基酸组成。
其蛋白质的生物活性主要是通过对昆虫肠道的结构和功能起着作用，造成昆虫肠道上皮细胞膜的破裂，使得肠腔内容物泄漏，从而导致昆虫死亡。
二、cry1Da5基因的克隆1. DNA提取从已储存的Bt cry1Da5基因菌株中提取基因组DNA。
首先采用细菌培养液对细菌进行扩大培养，然后采用离心法收集菌体，进行细胞裂解，最后利用琼脂糖凝胶电泳进行DNA 的提取。
2. PCR扩增设计引物对cry1Da5基因进行PCR扩增，将cry1Da5基因从基因组DNA中特异性扩增出来。
PCR扩增条件设定如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸3min，共30个循环；72℃最后延伸10min。
通过PCR扩增的cry1Da5基因产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，确认扩增的片段大小。
3. 克隆与测序将cry1Da5基因PCR扩增产物与质粒进行连接，然后转化大肠杆菌进行转化。
科学家通过基因工程，将苏云金芽孢...解题思路：分析图解可知，图中将苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因和Ti质粒进行重组，利用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞；在利用植物组织培养技术培养成完整植株．基因表达载体的构建是基因工程中的核心步骤，其组成包括：目的基因、启动子、终止子、标记基因和复制原点．目的基因的检测与鉴定（1）分子水平上的检测①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等．（例：用虫食用棉花，观察其存活情况，来鉴定棉花是否具有抗虫特性．）（1）基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建．（2）目的基因的获取 ... 一般有从基因文库中获取目的基因、利用PCR技术扩增目的基因、人工合成法．（3）Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有T-DNA，把目的基因插入Ti质粒的T-DNA中是利用了T-DNA的可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA分子上特点．（4）将目的基因导入受体细胞的 ... 很多，图中利用了农杆菌转化法将目的基因导入棉花细胞中．（5）一个基因表达载体的组成必须有启动子、终止子、目的基因、标记基因、复制起点．（6）目的基因能否在棉花植株体内维持和表达其遗传特性的关键是目的基因是否插入了受体细胞的染色体DNA分子上．这需要通过检测才能知道，检测采用的 ... 是DNA分子杂交技术．若从个体水平可以用抗虫的接种实验来进行检测．故答案为：（1）基因表达载体的构建（2）从基因文库中获取目的基因、利用PCR技术扩增目的基因、人工合成法（3）可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA分子上（4）农杆菌转化法（5）启动子、终止子、目的基因、标记基因、复制起点（6）目的基因是否插入了受体细胞的染色体DNA分子上DNA分子杂交技术抗虫的接种实验点评：本题考点：基因工程的原理及技术．考点点评：本题考查了基因工程的相关知识，难度适中，属于考纲中识记、理解层次的考查．要求考生能够识记基因工程的操作步骤；识记目的基因获取的三种 ... ；识记基因表达载体的组成等方面的知识；要求考生能够构建一定的知识网络．。
河北农业大学硕士学位论文苏云金芽孢杆菌菌株的分离和cry基因的鉴定姓名：***申请学位级别：硕士专业：农业昆虫与害虫防治指导教师：***20070611苏云金芽孢杆菌菌株的分离和ｃｒｙ基因的鉴定Ｉ引言苏云金芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，简称Ｂｔ）是存在于土壤中的一种革兰阳性细菌，周生鞭毛或无鞭毛，在其孢子形成期能在菌体内形成伴孢晶体。
这些伴孢晶体主要由２７ｋＤａ～１４０ｋＤａ的蛋白质组成具有高度专一的抗虫作用【ｌＪ，对人畜及非目标昆虫无害，自２０世纪５０年代以来，Ｂｔ制剂已作为一种微生物杀虫剂在农业，林业，环境卫生方面得到越来越广泛的应用。
随着新分离菌株的不断出现，人们对该茵杀虫活性的认识不断加深。
目前已证实，不同ＩＣＰ对包括鳞翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）和鞘翅目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）等９个目的５００多种昆虫有不同程度的杀虫活性【２ｌ。
这促使人们从不同地区分离不同的Ｂｔ．菌种，到目前为止全世界已分离到五万株以上的菌株（３】。
１．１苏云金芽孢杆菌的生物学特性及其分布苏云金芽孢杆菌的营养体为粗壮的直杆菌，两端钝圆，通常以成簇、分散形式排列，或以两到四个菌体组成短链，间或看到长链状。
菌体大小为（１．２～１．８）１．ｔｍｘ（３５）ｒｔｍ。
但不同的亚种另有差异。
以周生鞭毛运动或无鞭毛不运动。
营养体生长到稳定期的后期，在其一端或中央开始形成一个卵圆形的芽孢（ｓｐｏｒｅ）如图卜ｌ。
其大小依亚种而异。
如苏云金亚种（ｓｕｂｓｐ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）的芽孢约（０．８～Ｏ．９）ｉ．ｔｍｘ２．Ｏ．ａｍ，武汉亚种的芽孢约为Ｏ．５５９ｍｘｌ．３８９ｍ。
芽孢为该菌的休眠体，对高温和干燥等不良环境有较强的抵抗力。
生长至衰亡期后芽孢囊破裂，芽孢被释放出来。
在部分亚种中，如幕虫亚种（ｓｕｂｓｐ．ｆｉｎｉｔｉｆｕｓ）等中，其芽孢从营养体分离后，芽孢与伴孢晶体分离后被包裹在芽孢外套里不发生分斟”。
苏云金芽孢杆菌Cry1A (b)抗虫基因LAMP检测方法的建立与应用周琳华;肖维威;吴永彬;蔡翠霞;康文杰;刘唐书;马文丽【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2012(000)004【摘要】以转基因玉米MON810为模板,针对Cry1A(b)抗虫基因核酸保守序列设计特异性引物,建立LAMP检测体系.对该体系的可行性、灵敏性、特异性进行分析,并应用于转基因产品的检测.研究结果显示该方法快速简单、灵敏度特异性高、结果可视化,可应用于转基因产品中Cry1A (b)基因的初步筛选.【总页数】5页(P165-169)【作者】周琳华;肖维威;吴永彬;蔡翠霞;康文杰;刘唐书;马文丽【作者单位】南方医科大学基因工程研究所,广州510515;南方医科大学基因工程研究所,广州510515;南方医科大学基因工程研究所,广州510515;南方医科大学基因工程研究所,广州510515;南方医科大学基因工程研究所,广州510515;广东省产品质量监督检验研究院,广州510330;南方医科大学基因工程研究所,广州510515【正文语种】中文【相关文献】1.柑橘溃疡病菌的普通LAMP及快速LAMP检测方法的建立 [J], 张仑;殷幼平;吴瑜佳;王中康2.细菌β-内酰胺酶和氨基糖苷磷酸转移酶耐药基因可视化LAMP检测方法的建立和初步应用 [J], 王豪;郭苗苗;刘昕雨;左瑶;李宁;孙薇;张涛;王令3.沙门氏菌LAMP检测方法的建立及其在蔬菜栽培土壤中的应用 [J], 吕新;刘兰英;陈丽华;李玥仁4.猕猴桃细菌性溃疡病可视化LAMP检测方法的建立与应用 [J], 王一波;祝山;郭文通;秦虎强;刘巍;徐亮胜;黄丽丽5.cry1A基因通用检测方法的建立 [J], 董美;胡晓颖;孟丽霞;宛煜嵩;刘卫晓;金芜军;李亮因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
苏云金芽孢杆菌cry1基因的克隆、植物表达载体的构建及转化大豆冯頔;张莉弘;魏毅;刘金亮;潘洪玉;张世宏【期刊名称】《中国农学通报》【年(卷),期】2011(27)7【摘要】此研究利用醋酸钠-抗生素加热法从土壤中分离获得1株产晶体的苏云金芽孢杆菌菌株(Bacillus thuringiensis)。
通过已知cry1基因设计引物,以分离得到的菌株DNA为模板进行PCR扩增,将克隆到的目的片段进行测序。
测序结果表明:该序列与cry1基因同源性达到90%～99%。
将该基因连接到植物双元表达载体pBI121中,构建了该基因的植物表达载体,并将阳性重组质粒转化根癌农杆菌EHA105,利用农杆菌侵染子叶节的方法进行大豆的转化。
通过初步的PCR验证,成功获得了转基因植株,建立了大豆的转化体系。
【总页数】5页(P222-226)【关键词】苏云金芽孢杆菌;cry1;植物表达载体;农杆菌介导法;大豆【作者】冯頔;张莉弘;魏毅;刘金亮;潘洪玉;张世宏【作者单位】吉林大学植物科学学院;长春大学农产品深加工省重点实验室【正文语种】中文【中图分类】S432.42【相关文献】1.苏云金芽孢杆菌Cry2Ab基因克隆与植物表达载体的构建 [J], 王毛;吴亚飞;邓拓;王敦2.苏云金芽孢杆菌aiiA基因的克隆及植物表达载体构建 [J], 欧阳乐军;沙月娥;郭耀权;邓玉金;曾富华3.绿色荧光蛋白基因原核表达载体的构建及其在昆虫肠道短短芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌中的表达 [J], 殷幼平;李强;袁训娥;王中康4.苏云金芽孢杆菌分子伴侣串联基因p19-p29的克隆和表达载体的构建 [J], 余健秀;曾少灵;谢瑞瑜;蒙国基;庞义5.苏云金芽孢杆菌分子伴侣基因p19的克隆和含有该基因的Bacillus thuringiensis表达载体的构建 [J], 曾少灵;余健秀;谢瑞瑜;蒙国基;谭乐;庞义因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
携带苏云金芽胞杆菌cry1Ac10基因重组杆状病毒的构建及其杀虫活性乔红;姚伦广;德格晶;齐义鹏;周文科;王志民【期刊名称】《中国病毒学》【年(卷),期】2004(019)001【摘要】用Bac-to-Bac系统,构建了包含极晚期基因ph启动子驱动的带有全长苏云金芽胞杆菌cryIAc10基因和完整多角体基因的重组质粒pFCP, 用该重组质粒感染昆虫Sf9细胞,得到了带有多角体和能够表达cry1Ac10基因的重组杆状病毒vFcph,并在昆虫细胞中表达了Cry1Ac10蛋白.同时构建了含cry1Ac10的穿梭载体pHTC,并分别转化大肠杆菌、枯草杆菌和苏云金杆菌晶体缺陷型菌株,结果表明此三种工程菌均表达了分子量为133.3kDa的原毒素蛋白,其中在苏云金芽胞杆菌中的表达量最高.生物测定表明重组杆状病毒vFcph的表达产物具有杀虫活性,能增加杆状病毒力,加快杆状病毒杀虫速度,说明利用杆状病毒极晚期基因启动子驱动苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白表达,从而改善杆状病毒的杀虫特性是可行的.【总页数】6页(P43-48)【作者】乔红;姚伦广;德格晶;齐义鹏;周文科;王志民【作者单位】河南省南阳市药品检验所;武汉大学病毒研究所,湖北武汉,430072;武汉大学病毒研究所,湖北武汉,430072;武汉大学病毒研究所,湖北武汉,430072;武汉大学病毒研究所,湖北武汉,430072;武汉大学病毒研究所,湖北武汉,430072【正文语种】中文【中图分类】Q789【相关文献】1.利用苏云金芽胞杆菌转座子Tn4430构建含cry1Ac10基因的解离载体 [J], 吴岚;孙明;喻子牛2.苏云金芽胞杆菌Vip3AaAdAa嵌合蛋白的构建及其杀虫活性分析 [J], 于爽;李帅;李海涛;刘荣梅;高继国3.杀虫真菌与苏云金芽胞杆菌对草地贪夜蛾的联合室内杀虫活性研究 [J], 彭国雄; 张淑玲; 张维; 夏玉先4.杀虫真菌与苏云金芽胞杆菌对草地贪夜蛾的联合室内杀虫活性研究 [J], 彭国雄; 张淑玲; 张维; 夏玉先5.杀虫真菌与苏云金芽胞杆菌对草地贪夜蛾的联合室内杀虫活性研究 [J], 彭国雄;张淑玲;张维;夏玉先因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
苏云金芽孢杆菌cry1Da5基因的克隆与表达苏云金芽孢杆菌(Clostridium perfringens)是一种常见的厌氧菌，是肉毒杆菌、破伤风杆菌和产气荚膜梭菌等泡菜致病菌的近亲。
此外，苏云金芽孢杆菌还是需要高效糖化酶的纤维素生产菌的代表之一。
因此，对该菌的分子机制研究具有重要的理论和应用价值。
本文旨在对苏云金芽孢杆菌的cry1Da5基因进行克隆和表达。
1. 基因克隆cry1Da5基因是一个编码2,140bp的蛋白质的基因，其蛋白质产品可以抵御红霉素的靶标酶。
该基因已经在苏云金芽孢杆菌的基因组中被鉴定并注释。
为了克隆cry1Da5基因，我们从苏云金芽孢杆菌ATCC13124中提取了总DNA，并通过PCR扩增cry1Da5基因。
PCR反应体系包括10ng模板DNA，2mM MgCl2，0.2mM dNTPs，0.2μM引物和0.5U Taq DNA聚合酶，反应条件如下：94°C退火10分钟；94°C退火30秒；60°C退火30秒；72°C延伸3分钟；共30个循环。
PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分离，并测序鉴定，确保正确无误。
随后，cry1Da5基因被克隆到pET-28a(+)质粒载体中，得到了表达载体。
为了表达cry1Da5基因，我们在大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中转化了pET-28a(+)-cry1Da5质粒，并进行鉴定。
随后，利用IPTG诱导表达cry1Da5基因。
首先，从预培养大肠杆菌的单克隆菌落中挑选一株菌株，在LB培养基中含有50μg/ml的卡那霉素、100μg/ml的氨苄西林进行培养。
当OD600值达到0.6时，加入最终浓度为0.5mM的IPTG，随后在摇瓶中继续培养16小时，在220rpm，37°C条件下转运cry1Da5蛋白。
接下来，将培养菌株以12000g离心10分钟，除去部分上清液备用。
丹硫氰钠-N-甲基右旋氨糖氯化物(DDM)溶液中提取膜蛋白，纯化cry1Da5蛋白。
!"卷#期$%%%年&月生物工程学报!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12’()*!"+(*#,-.!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!/-01-2$%%%收稿日期：$%%%3%!3%4，修回日期：$%%%3%53%#。
基金项目：国家高技术研究发展与计划项目（!%!3%43%!3%!）及九五攻关项目（&"36%!3%$3%!）资助。
苏云金芽孢杆菌菌株!"#$%&%转!"#$$基因菌的构建鲁松清"刘子铎喻子牛（华中农业大学微生物科学技术系，农业微生物农业部重点实验室，武汉54%%7%）摘要利用电脉冲将0*2!!基因转入苏云金芽孢杆菌野生菌株89:!#4#，筛选得到4个转化子。
质粒电泳、;6<扩增及,(=/>-2?杂交结果均证明，基因0*2!!已转入菌株89:!#4#。
生物测定结果表明，4个转化子对甜菜夜蛾的毒力比出发菌89:!#4#均有显著的提高，转化子89:!#4#3!和89:!#4#34对小菜蛾和棉铃虫的生物活性与出发菌89:!#4#相近，而转化子89:!#4#3$则有一定幅度的提高。
关键词苏云金芽孢杆菌，基因0*2!!，电脉冲转化中图分类号@&44文献标识码A文章编号!%%%34%"!3（$%%%）%#3%#B 73%5苏云金芽孢杆菌是一类能产伴孢晶体的革兰氏阳性杆状细菌，随着研究的广泛深入，它的杀虫范围已从最初的鳞翅目发展到如今的双翅目、鞘翅目等八个目，并发现它对线形动物门中的部分寄生线虫，扁形动物门中的吸虫类等也具有生物活性［!］，但针对某一菌株而言，它的杀虫范围多局限于某一目中的几个科属。
!&&"年,C ?D >E F 等将带有0*243启动子的0*2!!基因转入含单一杀虫晶体蛋白基因的G /(菌株，结果重组菌同时具有0*2!!和0*2!30的生物活性［$］。
本研究试图将带自身启动子的0*2!!基因转入不含0*2!!基因的多基因菌株89:!#4#，以期能提高菌株对甜菜夜蛾的毒力，扩大菌株的杀虫谱。
以下是对菌株89:!#4#和其转化子的一系列研究结果。
$材料与方法$’$材料苏云金芽孢杆菌菌株89:!#4#由本室分离，血清型为H 4C 1。
.9I 9J 6为基因0*2!!克隆入穿梭载体.H :4%5而得到的重组质粒，.H :4%5由法国巴斯德研究所的A *K -)-D )=F -博士提供。
$’(方法$’(’$质粒抽提：苏云金芽孢杆菌质粒抽提在9E 2?1(E 0等碱法抽提［4］基础上作了适当的改进，J 9培养液（!L 蛋白胨，%M #L 酵母粉，!L+C 6)，.H 7M $）过夜培养活化菌种，再用活化菌液接种（!／!%%）J 9培养液，至对数中期收集菌体，:N （!%00()／J:2E F ・6)，!00()／J N K :A ，.H B M %）洗菌!次，菌体悬于!%%!J 溶液O （#%00()／JP )=D (F -，$#00()／J:2E F ・6)（.H B M %），!%00()／JN K :A ），加入#"!%!J 溶菌酶（$%0Q／0J ），此后的操作按9E 2?1(E 0等的方法［4］进行。
$’(’(电脉冲转化苏云金芽孢杆菌：电脉冲转化在I C F F (?［5］和9(?-［#］等的基础上作了一些改进，采用,P 缓冲液（$7$00()／J 蔗糖，!#L 甘油），电脉冲采用$#!R ，$%%#，"M $#"&S ’／D 0的条件电脉冲!次。
电脉冲仪为9E (3<C T 公司的P -?-;=)F -2:I ，电脉冲杯也为9E (3<C T 的产品。
$’(’&;6<扩增：;6<扩增所用的引物见文献［"］，扩增条件参见文献［7］，扩增全部采用$#个循环，变性温度&5U ，延伸温度7$U 。
不同的扩增差异主要在复性温度，0*2$特异扩增复性温度为#B U ，0*2!3+，0*2!34和0*2!30混合扩增采用##U ，其余均为#4U 。
;6<所用试剂均为华美公司产品，!%%1.)C T T -2为9E ()C 1F 公司产品，引物:8"$和:8"4等由O ?/-Q 2C /-TK +A:-D >合成，;6<仪为;-S S E ?N )0-26-/=F 的K +A:>-20C )6V D )-2。
$’(’)探针制备：0*2!!探针制备采用;6<扩增产物作为底物，扩增引物为P A J ;!和P A J ;$［"］，具体制备过程见K E Q 杂交使用说明。
引物PA J ;!和!"#$%为上海&’()*(合成，+,)杂交试剂盒为-*./0,().01’((/.,2产品。
!"#"$&*34/.0(杂交：质粒电泳采用56778琼脂糖凝胶，杂交膜使用硝酸纤维素膜（9:;*(<），杂交及显色按+,)杂交使用说明进行。
!"#"%生物测定：生物测定均采用#=培养基发酵。
小菜蛾（!"#$%""&’(")*$%""&）生测方法见沈鞠群等［=］，小菜蛾由本室饲养提供；棉铃虫（+%",)$-,* &./,0%.&）生测方法见喻子牛等［>］，棉铃虫购自湖北省农科院；甜菜夜蛾（12)3)2$%.&%’,0#&）生测方法见曾晓慧等［?5］，甜菜夜蛾购自湖北省农科院。
每个样品的生物测定至少重复%次。
#结果#"!菌株&’(!$)$及其转化子的验证卷表!菌株"#$!%&%及其转化子对不同昆虫的生物活性$’()*!+,-./.-0123-4’.5"#$!%&%’56.-3-4’532147’5-3’8’.53-)*9.619-*4’5)’4/’* !"#$%&’()*#)’’%+&,-.$"%+&+/0+1%2%"34+##)5$"%+&2+)//%2%)&"64789$5.)／（!6／:6）!"#$%&’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菌株"#!%&%及其转化子的生物学特性带基因4.$=5的重组质粒转入菌株;<0=7>7后，菌株的生物学特性发生一些小的变化，主要表现在芽孢的形成发生一定障碍，芽孢数量减少，形成的菱形伴孢晶体变大，在6I培养基中芽孢脱落时间比出发菌株;<=7>7晚>"7J。
:;<转化子的遗传稳定性将转化子;<0=7>7H=，;<0=7>7H D和;<0=7>7H>在无抗性压力下分别培养，每>E J转接=次，经=8次6<培养液中转种后，将菌液分别在无抗性培养基平板上涂布培养，各随机挑起=88个菌落点种红霉素抗性平板，结果显示，所有菌落均保留原有抗性。
对转化子;<0=7>7H D的其中78个菌落还进行了K4(检测，结果它们均有杀虫晶体蛋白基因4.$=5，4.$=6*，4.$=67和4.$=64的特异扩增带。
以上结果表明转化子的遗传性非常稳定。
&讨论基因4.$=5转入野生菌株;<0=7>7后，转化子对甜菜夜蛾的毒力有明显的提高，表明4.$=5基因对扩大菌株的杀虫谱，提高菌株的毒力有一定的积极作用。
那么是否重组质粒L<M<64转入所有野生菌株均能提高菌株对甜菜夜蛾的毒力呢？根据对其它菌株的研究结果，重组质粒L<M<64对野生菌株毒力的影响存在差异，它对菌株;<0=7D8和;<0I>>等的毒力甚至有负面影响（鲁松清未发表资料）。
这可能是因不同菌株的遗传背景不同，外源重组质粒L<M<64在菌株中与其它杀虫晶体蛋白基因的相互作用存在差异所致。
实验中发现含4.$=5基因的野生菌株对甜菜夜蛾的毒力一般较强，具体情况如文献［F］所述。
但这并非表明所有对甜菜夜蛾高毒力菌株均含有4.$=5基因，某些菌株如;<0I>>等对甜菜夜蛾有较强毒力，但它不含4.$=5基因。
决定菌株对甜菜夜蛾毒力的因素除基因4.$=5外，可能还有4.$D，4.$=6*，4.$=64等杀虫晶体蛋白基因。
由生物测定结果还可发现（表D），>个转化子的遗传背景尽管相同，但它们对不同目标昆虫的毒力并不完全相同，特别是对棉铃虫的毒力存在较大差异，转化子;<0=7>7H D的毒力较出发菌株;<0=7>7明显增强，但转化子;<0=7>7H=的毒力则较菌株;<0=7>7大幅下降，这说明重组质粒L<M<64对同一菌株内不同个体的影响也不完全相同。
