乳鼠心肌细胞培养详细步骤

小鼠乳鼠心肌细胞培养物品：手术器械（眼科剪2把、眼科镊2把、手术镊1把）、培养皿4个、小烧杯2个、离心管4个、200目筛网、6孔板、垃圾桶、一次性吸管、加液枪（配各型号枪头）、75%酒精试剂：D-Hanks液2瓶（其中一瓶在操作前37℃预热）、2.5％胰酶消化液、加有FBS（浓度为10％）的DMEM培养基、Brdu、1％明胶、0.4％台盼蓝液操作程序：1、将备用物品（手术器械、培养皿、烧杯、离心管、200目筛网）进行高压灭菌2、用酒精擦拭层流台，将高压灭菌后的物品放入层流台，紫外线消毒30分钟3、将1％明胶加入六孔板中（每孔1ml）4、用镊子夹住小鼠颈部将小鼠在酒精中浸泡两次，每次2-3秒5、将消毒后的小鼠放入培养皿中，用剪刀将小鼠头部剪去，并将胸部剪开暴露出心脏，用另一个剪刀将小鼠心脏剪下放入装有预冷的D-Hanks液的培养皿中，将心脏剪开清洗残留的血液。

6、将心肌组织转移至另一个装有预冷的D-Hanks液的培养皿中进一步剪碎心脏后，加入等体积的2.5％胰酶。

7、将心肌组织转移至离心管中，反复吹打10min,静置2min后，弃上清。

8、再次加入D-Hanks液和等体积的2.5％胰酶，常温下反复吹打10min，静置2min后将上层液转移至100ml容器中，加入含10%FBS的M199培养基或DMEM培养基终止消化9、重复上一步骤至组织完全消化，适当控制消化时间10、用200目筛网过滤得到细胞混悬液，转移至10ml离心管。

11、以300g室温离心5min12、弃去上清后加入DMEM+Brdu培养基吹打，转移至50ml培养瓶中后放入37℃ 5% CO2培养箱进行差速贴壁1h13、将六孔板中的明胶吸出14、计数心肌细胞15、按六孔板细胞数（4~5×105个/每孔）加入细胞悬液，并添加M199+Brdu培养基或DMEM+Brdu培养基至3ml16、至置培养箱37℃5% CO2培养箱培养。

17、24h后换液，培养基改用不含5-BdrU的培养基继续观察培养。

下文所述程序改编于Speicher和McCarl（1974）的方法。

实验需要两把弯头的解剖剪，两把5号钳子，一个25-ml的带橡皮塞的锥形瓶，内装一搅拌棒。

所有器械使用前均应消毒灭菌。

为了进一步保证无菌条件，最好用一次性无菌塑料用品。

所有的孵育操作均应在高湿度的5% CO237℃孵箱中。

本实验适合处理20~30只幼鼠，若少于20只鼠则可能会发生组织消化过度的情况，若超过30只，则由于准备工作加长降低了细胞的成活性。

组织消化和分离细胞1）在细胞操作间内，放一个加热搅拌台，上放一个装有100-ml灭菌水的容量600-ml的烧杯，加热至37℃。

2）准备胰酶液。

用水浴或温箱使胰酶液温度保持在37℃。

胰酶（0.1）%，100ml盐水A 90ml1%胰酶1:300（GIBCO/BRL）10ml使用当天配制盐水A137mmol/L NaCl4 mmol/L KCl4.2 mmol/L NaHCO35 mmol/L 葡萄糖溶于无菌蒸馏水中3）做一个冰台：将一只平皿装满冰后倒置即可，70%乙醇擦拭平皿后放进操作台。

取3个60-mm的一次性组织培养用平皿，加入5 ml盐水A，标记上1，2，3，放进操作台的冰台上。

4）取一只干净加盖的烧杯，内放一块Metofane饱和的纱布，把0~1日龄的SD幼鼠放进该烧杯中麻醉。

20只幼鼠大约需要5分钟时间。

用70%乙醇擦净烧杯再放进操作间。

5）一次取出一只幼鼠，一定要再盖好盖子，然后将幼鼠躺着放在一块无菌纱布上。

用乙醇擦洗其胸部及腹部。

把鼠肩胛骨往后夹，使突出胸腔，在肋骨下沿胸骨方向拉一口，摘出心脏放进标记着1的培养皿中。

24-mm规格的弯头解剖刀适合用于切口及摘除心脏。

此时幼鼠心脏仍能跳动，故一般很容易找到并摘除。

可用同一把解剖刀将心脏摘出放进盐水A溶液，若需要也可用灭菌的5号钳子。

6）继续处理余下的幼鼠，一定要保持手套及所用器械洁净。

每次解剖约需1分钟。

7）上述操作完成后，用两把5号钳子剔除心脏上结缔组织和血块再转入标记为2的平皿中。

㈠、概述 整体动物⼼肌细胞的增殖能⼒在出⽣后仅能维持⼀个短时期，⼩⿏在出⽣3周后DNA合成所需的酶的活性及⼼肌细胞的增殖能⼒就明显降低⾄成年⿏⽔平。

⼩⿏⼼肌细胞的原代培养，⼀般选⽤⽣后1-10d的乳⿏⼼脏，尤以出⽣1-4d的较好，此时⼼肌细胞已分化充分，适于作各种研究，⽽出⽣4d以后的乳⿏⼼脏中分离出来的⼼肌细胞较慢发育成为有⾃律性搏动的⼼肌细胞。

㈡、[试剂] 1、培养液：1：1 混合的DMEM / F12 培养液，添加终浓度为10%⼩⽜⾎清（FCS）、100IU/ml 青霉素、100µg/ml 链霉素。

2、消化液：胰酶（效价为1：250） 0.08%、胶原酶II（活⼒为150U/mg） 0.05% ，⽤pH 7.2-7.8 的D-Hanks溶液配制，-20 ℃保存。

3、 D-Hanks溶液（pH 7.2-7.8）：KCl 0.4 g ， KH2PO4 0.06 g ， NaCl 8.00g ， NaHCO3 0.35 g ， Na 2HPO4？7H2O 0.09 g ，酚红 0.01 g 1L ㈢、[实验步骤] 1、取⽣后1-4d的乳⿏，⽤75%⼄醇消毒⽪肤，再⽤⼤头针固定乳⿏的头及四肢，剪开胸部⽪肤，⽤75%⼄醇消毒⽪下组织，更换镊⼦及剪⼑，开胸取出⼼脏，将⼼脏放⼊盛有D-Hanks溶液的平⽫（或青霉素瓶）中，剪去⼼房，剪开⼼室，⽤D-Hanks溶液冲洗三次，去除残留积⾎后，将⼼脏剪成1mm3 ⼤⼩的碎⽚，再将⼼脏碎⽚转移⾄离⼼管中，加5ml左右消化液，37℃消化5 min，⾃然沉淀，弃上清，再加5ml左右消化液，37℃消化20min（每隔2min振摇⼏下），⽤吸管吹打1min 后，将未消化完全的⼼脏碎⽚吸出⾄另⼀离⼼管中，加⼊2ml冷的培养液终⽌消化，1000 rpm 5min ，弃上清，沉淀中加⼊D-Hanks溶液2ml， 1500 rpm 10min ，弃上清，沉淀中加⼊培养液2ml，⽤吸管吹打制成细胞悬液。

乳鼠原代心肌细胞培养方法
实验动物
出生1~3天的健康乳鼠（Wistar），雌雄不分。

药品与试剂
DMEM/F12基础培基，Brdu ，胰蛋白酶（1:250），Ⅱ型胶原酶（sigma)，胎牛血清（hyclone），双抗（青霉素-链霉素）
原代心肌细胞培养
1．出生后1~3天的乳鼠，雌雄不分。

将乳鼠在75%乙醇中浸泡5秒左右，于无菌条件下取出心脏，置于平皿中，用PBS溶液反复洗涤3次，并除去大血管及脂肪组织，眼科剪剪碎至约1mm3。

2．用0.1%的Ⅱ型胶原酶和0.06%的胰蛋白酶在37℃恒温摇床中震荡消化5~7次，每次5min。

收集除第一次之外各次所得的消化液，并及时加入到含10%胎牛血清的DMEM培养液中终止消化。

（第一次的消化液中含较多血细胞，故弃去，也可视清洗的情况而定）
3．终止后的消化液用200目筛过滤去除未消化组织块，1000rpm离心10min 收集细胞。

4．离心后弃上清，用全培基将细胞沉淀充分而轻柔地吹打成单细胞悬液，接种于培养瓶中，CO2培养箱差速贴壁1.5小时。

5．收集未贴壁的细胞悬液，重新接种于培养瓶中，前3天加用0.1 mmol/L Brdu抑制非心肌细胞的生长。

6．培养2~3天，待贴壁心肌细胞连成片状同步搏动后，消化接种于不同的培养板中，供进一步实验用。

将细胞混悬液1 000 r/min离心10 min
去上层，收获细胞
实战程序 第四大步骤：清洗细胞，培养细胞
细胞沉淀用PBS溶液和DMEM清洗3次 弃上清液 加4ml含20%小牛血清的DMEM培养液制 成细胞悬液，置于培养瓶中 培养24 h后即可见细胞贴壁和细胞收缩
【注意事项】
组织块必须漂洗 2~3 次以除去组织的钙离 子、镁离子和血清对胰蛋白酶和 EDTA的抑 制作用。 胰蛋白酶浓度不宜过高，作用时间不能太长， 以避免毒性作用。 消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免 毒性产生，而且动作要轻，以避免蓬松的细 胞随漂洗而失去。
【实验结果与分析】
记录心肌细胞的培养及动态观察。
实验三 动物细胞的原代培养
【实验目的】
掌握实体组织材料的原代细胞培养的 基本思路。 掌握动物组织中细胞的分离和原代培 养的方法。
【实验原理】（参考教材P128）
原代细胞培养是从供体取得组织细胞在体外
进行的首次培养
是一项基本技术
是建立细胞系的第一步
【实验原理】
原代细胞的分离和制作常采用的方法
用镊子小心剥离心包膜
剪去心房（心脏上半部分）及主动脉
PBS溶液清洗心室组织3次（至没有血时）
将心室组织剪成1~3 mm3碎块后，转移至
离心管
用PBS清洗3遍
实战程序 第三大步骤：消化组织，获得细胞
加0.125%胰蛋白酶（2ml）
37℃水浴中旋摇消化10 min 吸上层（细胞在悬液中，未消化好的组织块在底层） 细胞悬液转至小烧杯 加等体积无血清培养基终止反应，反复3-5次
【实验材料与器材】
本实验用品
每组1个：乳鼠、解剖器械、小烧杯、细胞 培养瓶、移液枪（1ml）及枪头 每组2个：离心管、培养皿

原代培养的心肌细胞的准备
将出生1-3天的Wistar乳鼠浸泡75%的酒精中消毒，开胸后取心室肌，用Hank's液清洗2次，剪碎，放入10ml离心管中；离心管中装有5倍体积的0.25%胰酶，37℃消化10分钟后，加等体积的DMEM全培养液终止消化，自然沉淀；取出沉淀物，放入另一盛有胰酶的离心管中，重复上述消化过程4次，每次37℃20分钟；收集除第一次以外的上清液，1500 r/min 离心15分钟，弃上清，用含10％胎牛血清及青霉素和链霉素(终浓度均为100U/ml)的高糖DMEM培养液充分而轻柔地吹打成单细胞悬液，经 200目筛网过滤去除未消化组织块。

然后按差速贴壁分离法37℃、5%CO
孵育 1-1.5小时，去除贴壁的非心肌细胞，纯化心肌细胞。

细胞计
2
条件下培养。

于培养后12h即可见部数，相同密度接种于培养瓶中，37℃，5%CO
2
分细胞收缩,24h后换液,此时心肌细胞约90%以上都在收缩, 速率达70/min～120/min。

细胞培养72h后用于实验。

Neonatal Rat Cardiomyocyte Isolation Protocol作成者：富海英 趙卉日 期：2006/08/11法消毒器具：镊子 大和小 各两把，用纸包好后放入一个玻璃杯中放入搅拌棒的50cc 的烧杯一个次日开始培养的话，提前：17～21時）１）Hanks medium 15ml 加入P10培养皿，共三枚，置于37℃ incubate（其中2枚在取心脏时备用）Hanks medium 是室温保存，没时间的话，不用incubate 37℃也可２）从新生大鼠取心脏（以下以两窝计算）铺上草纸、准备酒精消毒液和尸体袋取出心脏（从剑突左下用尖镊子刺入，分离，心脏将突出体外）用镊子把心脏夹出，放在P10培养皿中将全部大鼠的心脏取出后，把心脏移到新的培养皿中然后拿到无菌操作台（cleanbench ）里面行进一步操作３）将P10 dish 中的心脏的血液挤出洗净后移到另一个干净的p10培养皿，枚目のdish に移将心脏撕裂2-3下，裂而不断的程度即可。

４）将Trypsin/EDTA 放入50cc 三角烧杯中、两窝大鼠心脏约20个需要10ml 。

4℃ 过夜。

Trypsin 不要加温、在取心脏之前从4℃保存的冰箱里取出，将需用部分取出注入带刻度试管中。

Trypsin 不要加热，以免影响效果。

4℃过夜，静置即可。

12-16h后：早上9点开始）试剂：D-MEM (cat No. D5796, containing 10%FCS and 1%PSG)FCS (JRH Bioscience Cat No. 12303-500M)PSG (GIBCO Cat No. 10378-016)GIBCO Hank’s balanced salt solution（Cat. No. 14175-095）（不含Ca,Mg离子）Collagenase Type II （Worthington Bio. Chem. Cat No. CLS2）最终浓度0.5~1.0mg/mlBSA (Sigma)最终浓度5mg/ml0.25%Trypsin-EDTA（GIBCO、cat No. 25200）（4℃直接使用，不加温）５）配制胶原消化液：Collagenase type II(25~50mg)/BSA(250mg)/Hanks medium 50ml６）在过夜的心脏/Tripsin瓶中加D-MEM（10%FCS）10ml，37℃恒温槽5min７）弃上清，加胶原消化液10ml（0.22um filter过滤）（弃上清时注意勿把心脏组织吸走了。

乳鼠心肌细胞的培养
实 验 目 的 意 义 实 验 材 料
实 验 方 法
操作步骤及人员落实 预 期 结 果
目的：掌握原代细胞培养的一般方法和步骤及培 养过程中的无菌操作技术，熟悉原代培养细胞的 观察方法。 意义：原代培养是指直接从机体取出细胞、组织 和器官后立即置于培养基中培养，使细胞得以生 存、生长和繁殖。原代培养细胞离体时间短，细 胞保持体内原有的基本性质，适用于研究。 一般说来，幼稚状态的组织和细胞（如动物的胚 胎、幼仔的脏器）等更容易进行原代培养。
•消 化 组 织
•培 养 细 胞
前 期 准 备
1. 将备用物品（手术 器械、培养皿、烧 杯、离心管等）进 行高压灭菌； 2. 用酒精擦拭层流台， 将高压灭菌后的物 品放入层流台，紫 外线消毒30分钟。
用镊子夹住小鼠尾巴将小 鼠在酒精中浸泡两次，约 2~3秒； 2. 用剪刀将小鼠头部剪去； 3. 将动物固取材器官范围的 被毛，定在解剖板上并将 胸部剪开暴露出心脏，用 另一个剪刀将小鼠心脏剪 下； 4. 放入装有预冷的Hanks液的 培养皿中，将心脏剪开,剪 碎组织至1mm³左右，清洗 残留的血液。
1.
1. 将心肌组织转移至另一个装有预冷的Hanks液的培 养皿中进一步剪碎心脏后，加入等体积的0.125％ 胰酶； 2. 将心肌组织转移至离心管中，用吸管反复吹打（使 消化下来的细胞彻底从组织团快上掉下来）10min, 静置2min后，弃上清； 3. 再次加入Hanks液和等体积的0.125％胰酶，常温下 用吸管反复吹打10min，静置2min后将上层液转移 至100ml容器中，加入含10%小牛血清的1640培养 基终止消化； 4. 重复上一步骤至组织完全消化，适当控制消化时间。

仪器：培养箱（调整至37℃）、培养瓶、

小鼠心肌细胞的原代培养注意事项
一、实验前准备
1.1 材料准备
1.2 设备准备
1.3 环境要求
二、小鼠心肌细胞的原代培养操作步骤
2.1 小鼠心肌细胞的分离和培养基的配制
2.2 小鼠心肌细胞的原代培养
三、培养基的更换和维护
3.1 培养基的更换
3.2 细胞状态观察和维护
四、实验中常见问题及解决方法
4.1 细胞污染问题及解决方法
4.2 细胞生长不良问题及解决方法
4.3 细胞死亡问题及解决方法
五、实验安全注意事项
5.1 实验室安全措施要求
5.2 实验过程中个人防护措施要求
六、实验结果的分析和记录方式
6.1 实验结果的观察和记录方式
6.2 数据处理和结果分析方法
七、实验结束后处理方式
7.1 培养皿、试管等废弃物处理方式要求7.2 试剂废弃物处理方式要求。

乳鼠心肌细胞的培养方法摘要细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出,模拟动物体内的生理条件,在体外进行培养.使其不断地生长、繁殖,人们借以观察细胞的生长、繁殖;细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。

对乳鼠心肌细胞的培养进行理论和实验探讨。

关键词乳鼠心肌细胞;细胞培养;方法1材料所需液体:Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、双抗液、碳酸氢钠液、盐酸液。

试剂:Trypsin,SDS,DMEM均购于SigmaChemicalCo.小牛血清购于杭州四季青生物制品有限公司,其余均为国产分析纯。

取鼠:标准SD大鼠,鼠盆用棉铺好,取鼠。

物品:白大衣、饭盒;小剪子、小镊子(4套)(一套剪皮肤、一套开胸取心,一套剔除心缘纤维组织,一套剪碎心脏);瓶皿(2套);250ml烧杯3个;500ml烧杯1个,用作废液缸;50ml烧杯3个(剪碎心肌组织,最后配液);三角烧杯(50ml)小转子(小转子,酒精擦,双蒸水冲后,再把酒精彻底冲掉后用三角烧杯高压);离心管及帽(12-14个),两个试管;吸管(5-8个)大镊子(两把,持物,例夹棉球等);台面:磁力搅拌器、纱布(事先用于托盘装0.1%新洁尔灭浸泡)、试管架、泡沫塑料板、五个针头(不用消毒)75%酒精棉球及碘酒(消毒棉球,泡酒精、碘酒)大镊子两把(一把夹棉球,一把取鼠)、3个250ml烧瓶(一个装一蒸水,一个装新洁尔灭,另一为空的备用)1个500ml烧瓶(废液缸)、温度计、PH试纸(事先调PH值)、酒精灯、打火机/火柴、载玻片(5-10个)、注射器5ml6个(胰酶、DMEM、小牛血清)1ml2个(双抗液)20ml备用2个、微量加样器1000ml及500ml。

以上物品均用紫外线照30分钟。

另外准备手套、帽子、口罩、24孔培养板、离心机、未冻药品及DMEM、HCL、NaHCO3、小牛血清。

事先把显微镜、离心机、磁力搅拌器电源插好。

检查酒精灯是否有酒精,碘酒和酒精棉球是否够用。

原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法实验准备：昆明乳鼠25~30只；生物安全柜；巴氏吸管2支；培养皿2个；原代器械盒；15ml 离心管；50ml离心管各一支；胰酶；PBS；1%双抗；封口膜；酒精灯；Dhanks；实验主要分为两大步骤进行：第一天晚上1、培养皿内加入预冷的PBS+1%双抗。

2、取乳鼠酒精喷全身取心脏放到提前准备的培养皿中无需剪碎稍抖动清洗。

3、所有心脏取完，用巴氏吸管将培养皿中的心脏吸到15ml离心管中，稍等沉降，吸去液体。

4、加入Dhanks冲洗心脏，吸出弃去，将心脏上沾有的血尽量冲洗干净。

5、加入3mlDhanks和5ml胰酶。

封口膜封好，放到饭盒里，四度摇床8-12小时。

第二天上午1、配置二型胶原酶（16.8mg二型胶原酶+21mL DMEM,配好后放到水浴锅预热，微孔滤膜过滤，现用现配）2、8-12小时后，向装有心脏的15ml离心管中加入5ml DMEM完全培养基中和胰酶。

之后小心吸去液体，加入7ml提前准备好的二型胶原酶。

放到37度摇床摇10min转速160r，摇10min后将上清吸到新的50ml离心管中。

这个过程重复3次，基本上心脏全部溶解，只有少量组织。

（每次可以少加二型胶原酶4-5ml多消化几次）3、将50ml离心管中3次收得的上清滤网过滤，离心1000r5min，弃上清，沉淀加入DMEM完全培养基，逐层吹起，加入到细胞培养瓶中。

5只鼠铺一个培养瓶。

4、1.5-2小时后差速，将培养瓶中的培养液转移到六孔板里。

心肌细胞10只鼠一个6孔板即可。

注：用心肌细胞的取6孔板中细胞培养48小时；用成纤维细胞的将培养瓶中差速的瓶用1000ul的枪冲洗30次得到的成纤维细胞相对较纯。

新生大鼠心肌细胞原代培养实验具体步骤及方法将大鼠的心肌细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。

一、实验材料准备1. 动物出生后1-4 天SD 乳鼠15 只。

2. 试剂低糖DMEM、胰酶(含EDTA)、青链霉素、碳酸氢钠液、新生牛血清、谷氨酰胺、D-Hank's 液。

0.1%新洁尔灭、碘酒、75%酒精，培养液(DMEM，新生牛血清，青链霉素)。

3. 手术器械和仪器铝盒、眼科直剪、眼科弯剪、眼科直镊、眼科弯剪、玻璃培养皿(共2 套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心脏组织)、100 ml 广口瓶两个(分别装碘酒和酒精棉球)、500 ml 烧杯、250 ml 锥形瓶、15 ml和50 ml 的离心管，磁力搅拌器和搅拌子(或者水浴振荡器)、150-200 目尼龙筛网和针式滤器。

二、方法1. 将胰酶用D-Hank's 液配成0.06%的浓度，并放置于37℃水浴中温育好。

2. 解剖取材：将乳鼠放入0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出，用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘。

左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。

这样只要左手稍顶，乳鼠的心脏就直接跳出来。

然后用眼科弯镊从心脏中部直接将心室部分剪下，放入冰浴的D-Hank's 液中。

重复以上过程。

取材完毕后，撤掉取材的手术器械。

注：为了保证心肌细胞的活力，取心的操作过程尽量快，另外，最好把盛的心脏的培养皿放置在冰台上或者预冷的平衡盐液中。

3. 用第二套手术器械进行下列操作。

用眼科直镊和眼科弯剪把培养皿中的心脏周边的血凝块及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好D-Hank's液的培养皿中，把心脏组织再洗一遍后，将心脏组织放在另外一个培养皿中(或者其它合适容器中，视个人习惯)，加少许0.06%胰酶，用眼科弯剪将心脏组织剪成1mm3大小的碎块，将剪碎的心脏和胰酶液转入加了搅拌子的锥形瓶中，另外吸取2-3 ml新鲜的胰酶冲洗平皿和剪刀并转入锥形瓶中，补加胰酶至终体积10 ml，加上塞子，放在37℃水浴中(可以用一个消毒的500 ml烧杯，装好无菌的蒸馏水，加够水量，水位线稍低于250 ml锥形瓶的刻度线即可，过少则温度会不均匀，过高容易污染。

大鼠心肌细胞培养一、乳鼠原代心肌细胞培养（一）、试液配制1．DMEM培养液：配制方法同前。

按每90ml 培养液加入10ml 胎牛血清即为10%DMEM 培养液。

2．0.1%胰酶：移取0.5g 胰酶，加入５00ml 生理盐水，充分溶解后，调pH至７.2~7.4,过滤除菌后，分装冻存于-２０℃。

3．１0mmol/L 5-溴脱氧尿苷：（二）、操作步骤１．取１天龄的新生乳鼠，断头处死，固定于泡沫板上；２．应用碘酊及７０％酒精常规消毒；３．从左侧肋下缘剪开胸腔，用镊子取出心脏，置入含无血清DMEM培养液的平皿中；４．全部心脏取出后，剪去心房及周围血管组织，移入一干平皿中；５．剪碎，用无血清培养液洗１～２遍后，转移入５０ml 离心管中；６．按３０～５０个心脏加１０～1５ml胰酶液，于３２～３５℃，不停搅动１５０～２００rpm,消化１５～２０min;７．让组织块自然沉淀，上清移入另一离心管中，立即加入等量含１０％血清的培养液以终止胰酶的作用。

最初２～３次消化液因含较多的细胞碎片及红细胞，可弃去。

８．组织块可反复加入胰酶消化５～８次，所得细胞悬液在１０００rpm离心５min , 弃去上清，沉淀用少量培养液重悬；９．细胞计数后，将细胞稀释成１×106cells/ml的浓度，转移入培养瓶中，３０cm2的培养瓶加入５ml ，轻轻摇晃培养瓶，使细胞均匀分布；10.37℃95%空气－５％CO2条件下培养１h，然后轻轻摇动，将未贴壁的细胞转移到新的培养瓶中继续培养；11.２4h后更换含０.1mmol５－溴脱氧尿苷的培养液，以后每２天更换一次培养液。

心肌细胞全部汇合，自主搏动良好即可用于实验。

（三）、注意事项１．心脏是由多种细胞群组成的，心肌细胞约占５０％。

决定心肌细胞培养成败的关键是：１）不能污染，在整个操作过程中都要注意无菌操作，所用器皿都要严格消毒，所用试液都要预先检验无菌后方可使用。

２）尽量减少非心肌细胞的存在。

乳鼠心肌细胞原代培养综述乳鼠心肌细胞原代培养综述【摘要】：目的乳鼠原代心肌细胞培养在心血管病防治研究领域应用广泛，但是心肌细胞成活率、搏动率，纯化率过低仍是本技术有待解决的关键之处。

本文探讨原代心肌细胞培养的条件和方法以及一些注意事项做一下总结。

【关键词】乳鼠心肌细胞原代培养1．新生大鼠鼠龄的选择乳鼠心肌细胞随年龄的增长，其增殖分化能力亦有变化，如在新生3d内，具有部分增殖能力，而成年大鼠心肌细胞为终末分化细胞，不具备增殖能力，因此，我们在选择鼠龄时，尽量选择出生时间短的乳鼠，这样的心肌细胞成活率及贴壁率较高，所以选择新生1~3d均可，最好为半日龄的大鼠更为理想。

2．消化酶的选择使用分离组织常用的消化液有胰蛋白、胶原酶和透明质酸，如依地酸二钠(EDTA)，其作用是利于组织块分散为单个细胞，利于细胞的贴壁生长。

消化液的浓度、消化能力、消化的时间、温度对组织离散效果影响较大，甚至会损伤细胞，导致培养细胞状态不佳，失去贴壁生长能力，增加心肌细胞死亡率。

其中胰蛋白酶的消化力较强，常用浓度为0·05~0·50%，在37℃、PH8·0条件下作用最强，易造成心肌细胞损坏，因此，有学者认为“单纯应用胰蛋白酶消化对细胞的存活率有极大的负面影响”[1]，而TDTA作为一种化学螯合剂，价格低、毒性小，对细胞有一定的离散作用。

所以，选用胰蛋白酶与EDTA联合应用，可降低细胞损害，具有更好的消化分离效果。

另外，胶原酶作用较温和，通过水解细胞间胶原蛋白来实现离散组织的目的，对细胞的损伤较小，也是理想的细胞分离液，针对心肌细胞间含有不同胶原酶类型，可联合使用Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶。

且要知道的是在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主，故我们选用胶原酶I，文献报道胶原酶的工作浓度一般在0。

61 g·L-1，我们使用的为0。

8 g·L-1。

胶原酶最好现用现配。

3．污染防治虽然污染本身是不可能完全避免的，但可以降低其发生率、减轻其产生的严重后果。

西藏小鼠心肌原代干细胞培养技巧（一）前言西藏小鼠是我国唯一野生高原兽种，具有高寿命、高抗氧化、高抗缺氧、高红细胞密度等特性。

为了更好地研究和利用这一资源，在研究中心的引导下，我积极参与了有关西藏小鼠心肌原代干细胞培养技术的学习和研究工作。

在这一过程中，我积累了许多经验并发现了一些问题，现将我的一些心得体会分享给大家。

（二）心肌原代干细胞的提取提取心肌原代干细胞是研究心脏干细胞的一个重要步骤。

在提取过程中，需要仔细操作，以确保提取到的细胞数量和质量达到要求。

1. 准备工作。

在提取心肌原代干细胞前，需要准备好所需的仪器和试剂，例如工作台、培养皿、培养液、离心机等。

2. 切割心脏组织。

首先，需要将小鼠的心脏组织切割成小块。

切割时应注意不要受到污染。

3. 消化组织。

将心肌块加入消化液中，并放入恒温水浴中，可使心肌块中的细胞逐渐分离。

4. 筛选出心肌原代细胞。

将消化液中的细胞用过滤网进行筛选，将细胞培养在含有胰酶的培养液中几分钟，胰酶可使心肌细胞逐渐分离。

（三）心肌原代干细胞的培养1. 培养基的选择。

为了更好地培养心肌原代干细胞，我们选择了以DMEM/F12为基础的培养基，添加适量的FBS、酵母抽提物、L-谷氨酰胺、丝氨酸等营养成分，促进心肌干细胞的生长。

2. 恒温箱的设定。

在细胞培养的过程中，需要保持适宜的温度和湿度，使细胞能够良好地生长和繁殖。

3. 细胞培养周期的控制。

要保证心肌干细胞能够稳定地生长和繁殖，需要控制细胞培养周期和对培养液中营养成分的添加。

（四）细胞活力的检测细胞活力是心肌干细胞繁殖和生长的重要指标，也是评价心肌干细胞培养质量的重要标准。

因此，在进行心肌干细胞培养的过程中，需要对细胞活性进行监测和控制，以确保实验的可靠性和有效性。

1. 测定细胞的生长曲线。

生长曲线是细胞生长和繁殖的重要指标，通过细胞培养基中的OD值来测定细胞生长情况。

2. 检测细胞彗星现象。

细胞彗星现象是细胞死亡的标志之一，通过对细胞DNA的断裂情况和细胞核的形态进行观察和检测，可以得出细胞的生命状态和活性。

乳鼠心肌细胞培养详细步骤乳鼠心肌细胞培养物品准备眼科剪、眼科镊、泡沫板、75%酒精、细胞培养皿、细胞培养瓶、胰蛋白酶、胶原酶II、5-溴脱氧尿苷（Brdu）、离心机、温控水平摇床、二氧化碳培养箱、普通倒置显微镜、细胞计数板、胎牛血清、DMEM培养基、生理盐水、细胞过滤器、除菌过滤器、15ml离心管、50ml离心管试液配制（1）培养液A:按每90ml培养液加入10ml胎牛血清即为10%DMEM培养液（含双抗）。

（2）培养液B:含0.1mmol/LBrdU配制的DMEM高糖型培养液（含双抗）。

（3）消化液：0.1%胰酶和0.1%胶原酶Ⅱ型分装冻存于-20C。

将0.1%胰酶与0.1%胶原酶Ⅱ型混匀，现用现配。

操作步骤（1）取1-3天龄的新生乳鼠，断头处死，固定于泡沫板上;（2）应用75%酒精常规消毒;（3）从左侧肋下缘剪开胸腔,用镊子取出心脏，置入含无血清DMEM培养液的平皿中;（4）全部心脏取出后，剪去心房及周围血管组织，移入一干平皿中;（5）剪碎，用无血清培养液洗1-2遍后，转移入50ml离心管中;（6）加入10ml 消化液，放入37℃摇床 100rpm，15min，弃掉上清，收集沉淀。

（7）沉淀的心室组织中加入10ml消化液，37℃摇床100rpm，10min，充分吹打后静止，待未消化完全细胞沉淀后小心收集上清（避免吸入组织块）置于 20ml 培养液中。

（8）重复5-6次消化步骤，至完全消化为止，收集上清。

用200μm 筛网过滤，1000rpm，4℃，离心 8min。

（9）用培养液A将收集到的细胞悬液再次重悬，接种于T25 培养瓶，放入 5%CO2 恒温（37℃）细胞培养箱培养1.5h（即差速贴壁分离法）。

（10）将T25培养瓶中的上清液转移至另一无菌T25培养瓶，放入细胞培养箱培养 1h，进行第二次差速贴壁。

（11）收集上清并计数后，离心 1000rpm，4℃，8min，弃上清，留取细胞沉淀。

15-20 只动物用 200ml 消化液。
另记住加双抗
如想加胶原酶，则 100ml 需胶原酶 II 110mg
3．注意事项: a. 1 次最多养 20 只【每 T25 需 1.2 只乳鼠（1-3 天）】 b. 酒精需浸泡乳鼠两次消毒 c. 消化时间不能超过 16 次，8 次以内最佳
试剂
200ml
250ml
Trypsin
0.16
0.2
NaCl
1.6g
2
NaHCO3 葡萄糖
0.0706g 0.1982g
0.088 0.24775
KCl
0.0596g
0.0745
HEPES
0.4
0.5
ddH20
200ml
250ml
完成后，用 0.22μm 滤器过滤除菌（现用现配）
用加转子的瓶搅拌 1hr 后用 0.22μm 滤器过滤除菌。5-10 只 动物用 100ml 消化液，
＞1 个滤器 3 个玻璃平皿 吸管
试剂 PBS 溶液
含 10%FBS 的 乳鼠心肌细胞
DMห้องสมุดไป่ตู้M
消化液
数个塑料平皿
恒温磁力搅拌 器
二．实验步骤： 1. 超净台紫外线照射 30 分钟，3 个平皿中加适量的 PBS，4 个 50ml 离心管中各
加 10ml 含 10%FBS 的 DMEM；用 75％酒精消毒乳鼠后，左手捏住其颈部， 伸长其躯干，剪刀从剑突左缘剪开胸骨，暴露心脏后用镊子夹出置于 PBS 中 清洗。 注意：酒精中不要混有杂物，拿取酒精泡过后的乳鼠时，尽量不要碰其心胸 部，以防污染。 2. 将清洗后的心脏置入另一个平皿中小心尽可能多的除去结缔组织，收集心脏 用剪刀剪碎：左手弯镊在心房口处夹住，右手直镊摘取多余结缔组织。 3. 加 10ml 消化液后用吸管移至刻度瓶中，37 度水浴调节到适当的转速。头二个 8 分钟消化后，弃去上清，第三个 8 分钟收集的消化后的上清转移至含 10ml10%FBS 的 DMEM 的 50ml 离心管中。此后每 8 分钟收集一次。每次加 10ml 消化液。当消化后的上清变成近似于无色澄清后可以终止消化。 4. 收集的消化液离心 1200rpm，12 分钟，25 度（室温）。弃去上清，加适量含 10％FBS 的 DMEM，260 目滤器过滤后进行差速贴壁。(每 T75 瓶 12ml,3 瓶