细胞培养标准操作程序(SOP).doc

背景知识:细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。

因此及时进行细胞冻存十分必要.细胞冷冻储存在—70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达—196℃，理论上储存时间是无限的。

原理:细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融,实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化,避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

主体内容(操作步骤）：一、材料（一）仪器1. 净化工作台2。

离心机3。

恒温水浴箱4. 冰箱(4℃、—20℃、—70℃)5. 倒置相差显微镜6. 培养箱7。

液氮冰箱易生物仪器库：http://www.ebioe。

com/yp/product—list-42。

html（二)玻璃器皿1. 吸管（弯头、直头）2。

培养瓶3. 玻璃瓶(250ml、100ml）4。

废液缸（三）塑料器皿1。

吸头2。

枪头3. 胶塞4。

移液管(10ml）5. 15ml离心管6. 冻存管（1～2ml）（四）其他物品1。

微量加样枪2. 红血球计数板3. 记号笔4. 医用橡皮膏5。

移液枪（五）试剂1。

D—Hanks液2。

小牛血清3。

培养液4. 双抗(青霉素、链霉素）5。

胰蛋白酶(0。

08％)6。

1NHCl7。

7。

4％NaHCO38. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油易生物试剂库：http://www.ebioe。

com/yp/product-list—43.html二、操作步骤(一）细胞冻存1。

配制含10％DMSO或甘油、10～20％小牛血清的冻存培养液；2. 取对数生长期的细胞,用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；3。

1. 目的建立原代细胞制备操作规程，以保证试验的顺利进行和制备的细胞生长良好，满足检验和试验需要。

2. 范围适用于实验室原代细胞的制备，如：牛肾原代细胞、牛睾丸细胞制备等。

3. 职责3.1. 质量管理部：负责本规程的起草。

3.2. 质量管理部QC人员：负责本规程的实施。

3.3. 总经理：负责本规程的审批。

4. 定义无5. 引用标准无。

6. 材料6.1. 材料准备：6.1.1．细胞培养液：见《细胞培养液的制备SOP》。

6.1.2．EDTA－胰酶：见《胰酶的制备程序》6.2．实验器具6.2.1．手术器械：眼科剪、眼科镊、手术剪、手术刀、镊子、止血钳等。

6.2.2．玻璃器皿：大平皿、三角烧瓶250ml（含盖）、三角烧瓶（含盖）500ml、烧杯（含盖）100ml、烧杯500ml（含盖）、烧杯 1000ml（含盖）、注射器、离心管（含盖）、玻璃漏斗、吸管、玻璃珠等。

6.2.3．对以上器材按其性质高压蒸汽消毒或干烤消毒6.2.4. 消毒纱布6.3．仪器6.3.1．36℃培养箱培养用6.3.2 普通冰箱贮藏试剂用7. 流程图无8. 内容8.1. 取材：无菌采取代细胞的动物组织，置于消毒器皿中。

8.2. 漂洗：用灭菌培养液反复清洗组织，后移入洁净区内。

将组织在500单位双抗菌素溶液中浸泡三次，浸泡时间分别为20min和30min。

8.3. 剪切：剪去组织被膜，然后剪下组织的所需部分，放入PBS液反复漂洗除净血渍。

将洗净的组织块移入小烧杯中，用剪刀剪成0.5-1.0mm2小块。

8.4. 消化：收集剪切后的组织小块，移到装有小玻璃珠的三角烧瓶中，用PBS液洗1-2次，加入沉淀量5-8倍量的0.25%胰蛋白酶37℃作用30-60min。

8.5. 制备细胞悬液8.5.1．方法一：弃去胰蛋白酶消化液，加入培养液轻摇三角烧瓶后弃去培养液，以降低消化液的浓度，加入培养液后剧烈摇动三角烧瓶使小玻璃珠冲击组织小块分离细胞制取细胞悬液，吸取上清细胞悬液，再加入培养液，再继续摇三角烧瓶收集上清细胞悬液，反复数次，把所收集的细胞悬液混合到一起，分到细胞培养瓶中。

SOP-细胞常规维持培养细胞培养操作-sop一、实验目的：通过维持培养得到一定数量状态良好的细胞，为后续预实验、筛靶、验证实验做准备。

二、实验器材：超净工作台37℃二氧化碳恒温培养箱离心机倒置显微镜移液枪6cm培养皿 1.5mL EP管枪头（1mL 200ul 20ul）废液桶 CO2三、实验试剂：0.25%胰蛋白酶或含0.53mMOL EDTA胰蛋白酶溶液PBS高糖DMEM或RPMI 1640完全培养基贴壁细胞系培养（6cm培养皿为例）四、操作流程：1）镜下观察细胞密度及培养基颜色，颜色微黄，密度80％以上可进行传代2）用1mL移液器吸起原有培养基，弃去3）沿着6cm培养皿的侧壁，缓慢加入1mL的PBS液,稍微换匀6cm培养皿以洗掉残余的培养基4）加入500uL的0.25%胰蛋白酶或含0.53mMOL EDTA胰蛋白酶溶液迅速放入培养箱，2min后在倒置显微镜下观察，细胞开始回缩变圆，弃去胰酶溶液5）加入1ml培养基终止细胞消化，吹打使细胞脱离分散，然后收集于1.5mL EP管中准备离心6）离心机离心1000rpm 2min7）离心后弃去上清，加入1mL新鲜培养基重悬，轻轻吹打成均匀细胞悬液8）根据实验需要，接入适量的细胞到培养皿中，最后补足到5mL，摇匀后放入培养箱培养。

悬浮细胞一、操作流程：1）接收客户提供的悬浮细胞，观察细胞状态，直立T25瓶使细胞沉降下去2）吸去上清培养基，余下细胞收集与1.5Ml EP管中离心3）离心机离心1000rpm 2min4）离心后弃去上清，加入1mL新鲜培养基重悬，轻轻吹打成均匀细胞悬液5）根据实验需要，接入适量的细胞到实验孔板中，余下细胞在T25瓶中继续培养半贴壁细胞半贴壁细胞传代时，首先把悬浮于培养基中的细胞收集于管中，然后贴壁的细胞操作手法跟贴壁细胞相同，两者混合离心传代即可。

细胞培养的操作步骤细胞培养是一种在体外培养和繁殖细胞的方法，广泛应用于医学、生物学和生物工程等领域。

下面是细胞培养的操作步骤，包括细胞的收获、传代和检测。

1.材料准备：- 细胞培养基：选择适合细胞类型和培养要求的培养基，常用的包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）和RPMI（Roswell Park Memorial Institute）等。

-细胞：选择合适的细胞系，如人类胚胎肺成纤维细胞（HELF）和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）等。

-细胞培养器具：包括培养皿、细胞培养瓶、细胞离心管等。

2.细胞收获：-细胞培养器具消毒：用70%乙醇或其他消毒剂将培养器具进行消毒。

-细胞培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。

-细胞培养皿涂覆：将培养皿或瓶子内壁涂覆一层细胞黏附物，如明胶或聚-卵氨酸等，以增加细胞附着。

3.细胞传代：-培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。

-细胞收获：将细胞培养瓶中的培养基倒掉，用生理盐水等缓冲液洗涤细胞。

- 细胞分离：使用胰酶（Trypsin）或胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）将细胞从细胞培养瓶上析离下来。

-细胞计数：使用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，以确定细胞的密度。

-细胞培养：将细胞培养在新的细胞培养瓶中，加入适量的预热培养基。

4.细胞检测：-细胞形态观察：使用倒置显微镜或显微摄像系统观察细胞的形态变化和增殖情况。

- 细胞活力检测：使用细胞活力检测试剂，如MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）或CCK-8（Cell Counting Kit-8）等，评估细胞的存活率和代谢活力。

- 细胞凋亡检测：使用凋亡检测试剂盒，如Annexin V-FITC和PI （Propidium Iodide）等，评估细胞凋亡的程度。

1、目的:建立Vero细胞培养传代标准操作规程，确保检验操作标准化、规范化.为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养传代的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养传代操作流程。

2、范围：适用于Vero细胞培养传代实验人员。

3、编制依据《企业注册标准WS4—（S-009-2）—2003Z》。

4、Vero细胞培养传代操作规程4。

1试药与试液1、细胞：Vero细胞.2、液体：0。

25％胰蛋白酶溶液；7.5％碳酸氢钠溶液；小牛血清；PBS缓冲液；10×199培养液、灭菌注射用水、EDTA溶液。

4.2仪器与用具1、恒温培养箱;2、倒置生物显微镜。

4。

3操作方法4。

3.1细胞培养、传代1、准备好细胞培养传代所需物品，紫外线照台30min。

2、挑选细胞形态佳、无污染的Vero细胞，弃旧生长液。

3、细胞面经少量EDTA溶液洗涤后,加入胰蛋白酶等消化液适量（胰酶铺平培养瓶底为佳),倒置显微镜下观察培养瓶内细胞，一旦发现大量细胞胞质回缩，细胞间隙增大，但未脱离培养瓶底，立刻用吸细胞液的滴管吸出胰酶弃去,4、把细胞培养瓶置37.0℃±0。

5℃孵育让残存的胰酶继续消化，（在37℃胰酶消化效果最佳）,每1min把培养瓶拿到倒置显微镜下观察，当观察到细胞变圆，透亮,细胞间隙明显增大时，加入先配好的完全培养基适量终止消化，用吸管轻柔吹打分散细胞，制备成均一的细胞悬液。

5、取一滴细胞悬液进行计数(此步骤是为了积累培养细胞的经验，观察多少密度的细胞具体几天可以长满，待有经验后此步骤可以省略。

）6、传代：不同细胞根据细胞数量、生长快慢、难易等，一般按照1：3—1:5比例进行传代。

先用滴管吹打混匀细胞悬液,平均分配细胞悬液到各个培养瓶中,补足完全培养基使液体总体积达到40ml左右，平放到培养箱中继续培养。

7、收拾所用物品、用75％酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。

4。

3。

2填写记录：1、随试验进程做好试验记录（按实验记录规范要求）,包括试剂的厂家、批号、效期，试验时间，试验结果。

背景知识：细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。

因此及时进行细胞冻存十分必要。

细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。

原理：细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

主体内容（操作步骤）：一、材料（一）仪器1. 净化工作台2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃）5. 倒置相差显微镜6. 培养箱7. 液氮冰箱易生物仪器库：/yp/product-list-42.html（二）玻璃器皿1. 吸管（弯头、直头）2. 培养瓶3. 玻璃瓶（250ml、100ml）4. 废液缸（三）塑料器皿1. 吸头2. 枪头3. 胶塞4. 移液管（10ml）5. 15ml离心管6. 冻存管（1～2ml）（四）其他物品1. 微量加样枪2. 红血球计数板3. 记号笔4. 医用橡皮膏5. 移液枪（五）试剂1. D-Hanks液2. 小牛血清3. 培养液4. 双抗（青霉素、链霉素）5. 胰蛋白酶（0.08%）6. 1NHCl7. 7.4%NaHCO38. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油易生物试剂库：/yp/product-list-43.html二、操作步骤（一）细胞冻存1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；3. 离心1000rpm，5min；4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107 /ml；5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。

DC-CIK培养操作流程1.单采获取血液50ml分别置于2支50ml离心管中，2500r/min离心5min后，把黄色上清液倒入新的50ml离心管中离心灭活备用（注意不要倒掉白膜层），剩下的合并到一支离心管中并加入生理盐水至25ml混匀。

2.另取一支50ml离心管，加入25ml淋巴细胞分离液，用无菌吸管小心的将上述血细胞悬液沿管壁缓慢加到淋巴细胞分离液的表面，使两者之间形成清晰的界面。

3.2000r/min，离心20min后，用滴管轻轻插到白膜层，吸出该层细胞（注意观察淋巴细胞分离液层的红细胞，尽量不要吸到红细胞）。

移入另外的离心管里，加生理盐水至50ml，混匀，1500r/min，离心5min，弃上清，将底部细胞混匀，再加入生理盐水，，按照1500r/min，离心5min离心洗涤两次。

4.最后一次离心结束后，弃上清，用手轻柔的晃动离心管，把细胞晃匀，用培养液将沉淀细胞重悬，根据回输安排把所有细胞平均分配到规定数量的225ml培养瓶中，每瓶中培养液的量为20--30ml，放入培养箱中进行培养。

5. 2-12h后，取出培养瓶，将6瓶内悬浮细胞液收集到离心管，平均的分置在2个182CM 培养瓶中，再向6瓶DC培养瓶内加入30ml CIK细胞培养液，和H1因子。

置于培养箱中以DC(贴壁)细胞培养。

当天记为第0天。

6. 3个182CM²培养瓶中，分别补培养液至100ml，并分别加入γ因子，自体血清，置于培养箱中以CIK（悬浮）细胞培养。

当天记为第0天。

7. 24小时后向CIK细胞液中加入CI因子。

继续培养。

8.应定期观察细胞生长状态，当培养液变黄时，需要补液（每两至三天补液一次，偶尔也有一天换液的情况）。

CIK细胞补液后，按培养基全部液体体积，按终浓度为2ul/ml的比例加入白介素-2因子。

当补液后培养液体积超过200ml时，把全部两瓶CIK细胞连同培养液转移至培养袋中。

9.培养第6天，向所有DC细胞培养瓶中加入特异的细胞靶向激活液。

NK 细胞培养sop日程：第0天：NK激活剂的处理，分血第2天：补液20ml第4天：补液第7天：装袋第9天：补液第11 天：分袋第13 天：检菌第14、15 天：收获1. 研究背景与目的采用从病人自体外周血细胞中分离得到的单个核细胞，经体外操作使其扩增活化，再静脉回输，将其输回病人体内，通过激活体内特异性免疫反应达到杀灭肿瘤细胞目的的一种体细胞治疗方法。

2. 定义和缩写2.1. NK 自然杀伤细胞2.2. rhIL-15 人源重组白细胞介素152.3. IL-2 白细胞介素3. 主要仪器、耗材3.1. 仪器3.1.1 生物安全柜3.1.2 流式细胞仪3.1.3 水平低速离心机3.1.4 灭菌锅3.1.5 CO 2 孵箱3.1.6 倒置显微镜3.1.7 血细胞记数器3.1.8 血细胞计数板3.1.9 移液器3.1.10 -20℃-4℃冰箱3.2. 耗材3.2.1 75cm2培养瓶3.2.2 225 cm2培养瓶3.2.3 移液管3.2.4 15ml、50ml离心管、250ml离心管3.2.5 医用塑胶手套3.2.6 一次性帽子、手套3.3. 试剂3.3.1 无血清培养液3.3.2 IL-2 (100万IU/瓶)3.3.3 IL-153.3.4 0.4%苔盼蓝溶液3.3.5 生理盐水3.3.6 人淋巴细胞分离液3.4 原材料3.4.1 外周血，脐血，骨髓等4 操作步骤分血：4.1 培养瓶的处理：吸取NK细胞激活剂500ul，用生理盐水稀释至6ml，加到75cm 2 的培养瓶中混匀后，放置于37°C。

1h后取出备用。

4.2 将不同来源的血样，用生理盐水稀释一倍；4.3 Ficoll密度梯度离心，2000rpm，25分钟；4.4 吸取血浆，置56°C，灭活20min；灭活血浆，3000rpm，15min；4.5 白膜层用移液管吸入到新的50ml离心管中，用生理盐水洗涤细胞两次，第一次为2100rpm，6min；第二次为1500rpm，6min；4.6 从培养箱中取出处理的培养瓶，吸除激活剂，加入生理盐水10ml，轻轻晃动培养瓶，吸除生理盐水；4.7 用10-15mlNK培养液重悬细胞悬液，同时补加10%血浆，1000U/ml的IL-2,50ng/ml IL-15；将细胞置于CO2培养箱中培养。

293T细胞培养准则操作规程
百利药业⽣物药研发部
标准操作规程
题⽬：293T细胞传代培养操作规程
编号：SOP-M-e-003-
制定者：（签名）⽇期：年⽉⽇
批准者：（签名）⽇期：年⽉⽇
按照⽣物安全柜的标准操作规程，将⽣物安全柜的紫外开启半⼩时。

3.2将含10%胎⽜⾎清和100U/ml双抗的DMEM及PBS放于37℃⽔浴锅中预热。

3.2.1将已长到80%-90%的293T细胞培养瓶从37℃，5%的CO
培养箱中取出，先⽤75%的酒
2
精喷洒于瓶表⾯，将细胞培养瓶旋转放于⽣物安全柜中，⽤⽆菌的移液管吸净其中的培养基，加5ml的预热的PBS洗涤⼀次，吸净PBS。

3.2.2将含EDTA-0.25%tyption⽤PBS稀释两陪到五倍，向该75cm2的细胞瓶中加⼊3ml稀释好的EDTA-0.25%tyption，让其充分平铺于细胞表⾯。

盖好瓶盖，将细胞瓶放在显微镜下观察，直到细胞变圆，加含10%胎⽜⾎清的DMEM终⽌反应，⽤移液管轻轻将瓶上的细胞吹下，
将细胞液移到15ml⽆菌的离⼼管中，1000rpm离⼼3分钟。

3.2.3将离⼼上清吸弃掉，⽤⼿指轻轻拍打离⼼管底将底部细胞分散开，再加3mlDMEM培养基将分散的细胞重悬稀释开，取⼀定量的细胞液进⾏n倍稀释后计数，按照细胞计数标准操作规程进⾏。

3.2.4计数好之后细胞传代密度按照2~5×104个细胞/cm2进⾏传代培养，每个75cm2的培养瓶中加10mlDMEM培养基，放于37℃，5%的CO
培养箱中培养。

2
3.2.5 24⼩时后观察细胞状态，待细胞长到80%-90%时进⾏下⼀次传代培养。

细胞培养相关常用液体配制标准SOP操作规程样本（一）胰酶的配制：（浓度为1‰，1L）1、认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。

2、称取牛胰蛋白酶1.0g；EDTA 2 g；3、用超纯水溶解；4、磁力搅拌器搅拌至胰酶完全溶解，溶液变得澄清；5、超纯水定容至1L；6、不锈钢滤器加0.22um滤纸两张高温灭菌后，在超净工作台过滤；7、在血清瓶中加入少量滤好的胰酶，置于细胞培养箱中检测是否染菌，其余置于4℃待用；8、过滤后洗净滤器再次灭菌，避免残留的胰酶降解蛋白。

（二）DMEM配制：1、所需试剂及材料：试剂：DMEM干粉（GIBCO 10L）、超纯水（Milli-Q）、Na2CO3 （Sigma）材料：10L玻璃瓶、500ml盐水瓶（灭菌）、0.22um滤膜、滤器（事先放好两层滤膜并高压灭菌）、磁力搅拌器大号搅拌子蠕动泵胶塞2、操作步骤：(1)10L玻璃瓶洗涤，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。

(2)在10L玻璃瓶中加入超纯水9.5L，将DMEM干粉倒入，在磁力搅拌器上搅拌溶解。

(3)按照3.7g/L 加入Na2CO3 。

(4)调节pH值至7.2~7.4。

(5)过滤分装，并注明名称及配制日期。

此过程注意无菌操作！(6)最后用血清瓶取10ml左右置于细胞培养箱中检测是否染菌。

(7)清洗滤器，10L玻璃瓶，软管，将所有实验器具归位。

（三）1640、MEM培养基的配制同上，Na2CO3的用量见包装说明（四）细胞间100×双抗（青霉素、链霉素）的配制青霉素及链霉素配制的终浓度为1万单位/毫升。

配制的步骤以400ml为例：1.认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。

2.准备5瓶青霉素（80万单位/瓶）、4瓶链霉素（100万单位/瓶）。

3.加入1-2ml细胞间专用PBS进入青霉素、链霉素的瓶子内，浸泡后吹吸数次至全部溶解，溶解后的液体吸入配制容器内。

实验一传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养一、实验目的了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。

二、常用细胞的种类BHK-21：仓鼠肾传代细胞、PK-15：猪肾传代细胞、IBRS-2：猪肾传代细胞、Hela：人的子宫瘤细胞、Vero：非洲绿猴肾细胞、Marc-145：来源于Vero细胞、Sf9：昆虫细胞。

三、材料1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞3、0.25%胰酶4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM四、传代细胞培养的条件要求1）细胞密度：2-3×105个/ml2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培养温度哺乳动物细胞一般为37℃昆虫细胞28-30℃五、常用细胞分散剂与作用原理1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。

2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。

3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。

六、营养液1、人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。

2、血清1）血清的种类胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。

2）血清的处理无菌采集，过滤除菌。

用前56℃灭活30min。

七、传代细胞系培养1、优点：1) 可以无限的传代。

2) 不少细胞系对病毒很敏感。

3) 某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。

4) 生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。

NK 细胞培养sop日程：第0天：NK激活剂的处理，分血第2天：补液20ml第4天：补液第7天：装袋第9天：补液第11 天：分袋第13 天：检菌第14、15 天：收获1. 研究背景与目的采用从病人自体外周血细胞中分离得到的单个核细胞，经体外操作使其扩增活化，再静脉回输，将其输回病人体内，通过激活体内特异性免疫反应达到杀灭肿瘤细胞目的的一种体细胞治疗方法。

2. 定义和缩写2.1. NK 自然杀伤细胞2.2. rhIL-15 人源重组白细胞介素152.3. IL-2 白细胞介素3. 主要仪器、耗材3.1. 仪器3.1.1 生物安全柜3.1.2 流式细胞仪3.1.3 水平低速离心机3.1.4 灭菌锅3.1.5 CO 2 孵箱3.1.6 倒置显微镜3.1.7 血细胞记数器3.1.8 血细胞计数板3.1.9 移液器3.1.10 -20℃-4℃冰箱3.2. 耗材3.2.1 75cm2培养瓶3.2.2 225 cm2培养瓶3.2.3 移液管3.2.4 15ml、50ml离心管、250ml离心管3.2.5 医用塑胶手套3.2.6 一次性帽子、手套3.3. 试剂3.3.1 无血清培养液3.3.2 IL-2 (100万IU/瓶)3.3.3 IL-153.3.4 0.4%苔盼蓝溶液3.3.5 生理盐水3.3.6 人淋巴细胞分离液3.4 原材料3.4.1 外周血，脐血，骨髓等4 操作步骤分血：4.1 培养瓶的处理：吸取NK细胞激活剂500ul，用生理盐水稀释至6ml，加到75cm 2 的培养瓶中混匀后，放置于37°C。

1h后取出备用。

4.2 将不同来源的血样，用生理盐水稀释一倍；4.3 Ficoll密度梯度离心，2000rpm，25分钟；4.4 吸取血浆，置56°C，灭活20min；灭活血浆，3000rpm，15min；4.5 白膜层用移液管吸入到新的50ml离心管中，用生理盐水洗涤细胞两次，第一次为2100rpm，6min；第二次为1500rpm，6min；4.6 从培养箱中取出处理的培养瓶，吸除激活剂，加入生理盐水10ml，轻轻晃动培养瓶，吸除生理盐水；4.7 用10-15mlNK培养液重悬细胞悬液，同时补加10%血浆，1000U/ml的IL-2,50ng/ml IL-15；将细胞置于CO2培养箱中培养。

1.细菌、真菌检测：1.1取1ml 培养上清液，均匀涂布于羊血平皿、沙保弱氏平皿中。

1.2倒置平板，写上患者姓名、日期、批号。

1.3分别于37℃、25℃生化培养箱中培养。

1.4 24h 、48h 、72h 看结果。

1.5 做好记录。

2.支原体检测在获得能提供系统发育学信息的16S rRNA 分子时需要利用通用PCR 引物对16S rRNA 分子进行扩增。

16S rRNA 序列的对比分析需要在这类“通用引物”的脱氧核糖核酸分子的辅助下完成。

27F 5`-----aga gtt tga tcy tgg yty ag----3`519R 5`-----gwa tta ccg cgg ckg ctg-----3` 2.1取1ml 细胞上清液，1000rpm ，离心3min 。

(注：此步骤针对悬浮细胞）2.2取上清至另一个1.5ml EP 管中，13000rpm ，离心10min 。

2.3吸弃上清，留沉淀作为PCR 模板。

2.4 配制反应体系20ul ：Taq 酶（R028A ）（DNA 聚合酶） 10ulPrimer F （前引物） 0.5ulPrimer R （后引物） 0.5ulTemplate （模板） 2ul灭菌水 补足至20ul 细胞制品细菌、真菌、支原体检测标准操作程序制定部门：同济大学医学院干细胞研究同济医院临床转化中心编号：SOP-TJSC-QM-005页数：1/2生效日期 年 月 日 目的：严格按照标准操作规程检测 范围：所有用于细胞制品的检测 职责：实验室质检员2.5反应条件95℃ 5min95℃ 30s55℃ 30s 32 cycles72℃ 50s72℃ 10min2.6 PCR产物扩增完后，配制1.5%琼脂糖支持介质（例：35mLTAE（一倍）缓冲液则加0.525g琼脂糖），凝固待用。

每个EP管加4ul 6×Loading buffer（指示剂、增加密度）。

2.7上样（每格5ul）：凝胶板第一格加DL2000 DNA Marker 5ul凝胶板第二格加阳性对照凝胶板第三格加阴性对照三格以后加检测样品2.7 120V，20min电泳检测。

一、细胞多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。

由Dr. Nagy的实验室制备。

2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。

3．J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。

我们得到时大约传了7－9代。

4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr. Jaenish的实验室友情提供。

5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr. Nagy的实验室提供。

二、一般培养——维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。

为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。

建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。

将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。

培养基ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。

分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。

通过将21ml该溶液，HS 和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。

贮存于4℃。

注：一瓶DMEM 是500ml。

贮存液DMEM(高糖)马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTESGRO复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。

然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。

步骤1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。

细胞培养标准操作程序（SoP1.目的：为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养操作流程。

2 .适用范围：适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。

3 •操作规程：3.1培养液、PBS、胰蛋白酶的配制3.1.1 100Oml培养液的配制1、准备用品：培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2〜3天内的新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）、NaHCo3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml× 10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2〜3个过滤器、注射器。

紫外线照台30min。

2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末。

3、充分搅拌,按说明添加成分（如InVitrogen公司的RPMl-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2.0g , InVitrogen公司的DMEM需加NaHCo3粉3.7g等），再充分搅拌。

无需加谷氨酰胺，因该培养基里已含有。

4、用1M （1mol∕L ）HCl调PH至7.0左右（细胞适宜在PH7.2〜7.4生长，配制好后PH值会升高0.2〜0.3 ,故配时调PH至7.0左右）。

5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到1000ml。

6、配青霉素80万/瓶+ 4ml蒸馏水溶解配链霉素100万/瓶+ 4ml蒸馏水溶解取0.5ml青霉素和0.4ml链霉素加入到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml ,充分搅拌混匀。

7、在无菌操作台里用0.22Um的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口，盖上橡皮塞，放-20 C保存备用。

注意：（1 ）配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）配制。

一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。

（2）准备的100ml× 10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。

细胞培养标准操作程序（SOP）1．目的：为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养操作流程。

2．适用范围：适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。

3．操作规程：培养液、PBS、胰蛋白酶的配制1000ml培养液的配制1、准备用品：培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2～3天内的新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml×10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2～3个过滤器、注射器。

紫外线照台30min。

2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末。

3、充分搅拌，按说明添加成分（如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml需加NaHCO3粉，Invitrogen 公司的DMEM需加NaHCO3粉等），再充分搅拌。

无需加谷氨酰胺，因该培养基里已含有。

4、用1M（1mol/L）HCl 调PH至左右（细胞适宜在～生长，配制好后PH值会升高～，故配时调PH 至左右）。

5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到1000ml。

6、配青霉素80万/瓶+ 4ml 蒸馏水溶解配链霉素100万/瓶+ 4ml 蒸馏水溶解取青霉素和链霉素加入到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml，充分搅拌混匀。

7、在无菌操作台里用的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口，盖上橡皮塞，放-20℃保存备用。

注意：（1）配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）配制。

一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。

（2）准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。

PBS（平衡盐溶液）的配制NaCl 8gKCl ＋新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至1000mlNa2HPO4*H2OKH2PO4（1）无需调PH值，其成分溶解后PH为，不需除菌滤膜过滤除菌，放于4℃保存，用前直接高压灭菌（高压时，装PBS的瓶子的瓶盖要插针头!）（2）Na2HPO4*H2O 则Na2HPO4*12 H2O需（3）如欲配制500ml，以上成分减半即可%胰蛋白酶的配制胰蛋白酶粉EDTA（乙二胺四乙酸二钠）NaClKCl` +新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至1000ML NaHCO3Glucose(葡萄糖)酚红（1）配出来的PH值为，在PH值～范围内，故不需调PH值。

细胞传代标准操作规程-细胞传代培养SOP（消化法）1. 传代前准备：1.1 预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。

1.2 用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。

1.3 正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。

1.4 点燃酒精灯：注意火焰不能太小。

1.5 取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。

1.6从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。

1.7打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。

2. 胰蛋白酶-EDTA消化：2.1 加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶-EDTA液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。

2.2 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。

2.3 吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。

3. 吹打分散细胞：3.1吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。

3.2吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。

3.3平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。

3.4弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。

4. 分装稀释细胞：4.1 分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。

4.1 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。

注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。

最后要做好标记。

5. 继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。

传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。