细胞传代标准操作规程版

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细胞传代操作步骤细胞传代呀，就像是一场细胞世界的接力赛！咱就来好好唠唠这个操作步骤。

先得准备好比赛场地呀，也就是超净工作台啦，把它收拾得干干净净，可不能有啥灰尘杂质来捣乱。

然后把咱要用的那些瓶瓶罐罐、吸管啥的都放进去，消消毒，这就好比给运动员们准备好崭新的运动装备。

接下来，就该主角细胞们登场啦！把培养瓶从培养箱里小心翼翼地拿出来，就像迎接冠军队伍一样。

看看细胞们长得咋样啦，如果它们已经密密麻麻地挤在一起，就像人多到快没地方站了，那就是该传代的时候啦。

这时候，就得来点温柔的操作啦。

先用吸管把培养液吸出来，这可不能太粗鲁，不然会伤到细胞宝宝们的。

吸完培养液，再给它们洗个澡，加点缓冲液轻轻晃一晃，把那些杂质啥的都冲掉。

然后呢，就该给细胞们分家啦！可以用胰酶来帮忙，就像个温柔的分割大师。

把胰酶加进去，让细胞们稍微泡一泡，等它们松松地贴在瓶底上，就可以开始下一步啦。

轻轻拍打培养瓶，让细胞们都松动起来，这感觉就像是给运动员们喊加油，让他们活动活动筋骨。

然后再用吸管把细胞们吸起来，分成一小份一小份的，就像把大队伍分成一个个小团队。

把分好的细胞们放进新的培养瓶里，给它们加上新鲜的培养液，这就好比给运动员们准备好充足的能量和营养。

把培养瓶放好，送回培养箱里，让细胞们继续茁壮成长。

你说这细胞传代是不是很有意思呀？就像一场精心安排的比赛，每个环节都不能出错呢。

要是操作不当，细胞们可不高兴啦，说不定就长不好啦。

所以呀，咱得细心细心再细心，就像照顾宝贝一样照顾这些细胞们。

细胞传代可不只是个简单的操作，它关系到细胞能不能健康生长，能不能为我们的实验提供有力的支持呢。

每次做细胞传代的时候，都感觉自己像是个细胞世界的魔法师，掌握着细胞们的命运。

大家可别小瞧了这个过程哦，它可是很多实验的基础呢。

只有把细胞传代做好了，才能让细胞们好好发挥作用呀。

就好比只有运动员们状态好，才能在比赛中取得好成绩一样。

总之呢，细胞传代是个既有趣又重要的操作，大家可得好好掌握呀！让我们一起在细胞的世界里愉快地玩耍吧！。

细胞传代培养标准操作规程一、实验名称：细胞传代培养二、实验目的：传代培养细胞株三、背景知识：随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一方面细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。

此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。

这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。

对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。

细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。

在一代中，细胞倍增3～6次。

细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。

常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100个细胞。

一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。

细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。

四、实验原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代(再培养)。

传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。

同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。

悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

五、实验材料和药品：（一）实验药品：DMEM培养基，小牛血清，0.25％胰蛋白酶，PBS缓冲液。

（二）实验仪器和材料：CO2培养箱，倒置显微镜，超净台；培养瓶，弯头吸管，废液缸，离心管；75％酒精棉球，酒精灯，培养细胞六、实验步骤：1．入无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手。

2．倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。

将实验所需培养基置37℃下预热。

3．手在进入超净台前应消毒；超净台台面应整洁，用75％酒精溶液擦净。

4．打开超净台的紫外灯照射台面30min左右，打开抽风机，关闭超净台的紫外灯，清洁空气，除去臭氧。

细胞培养传代冻存复苏操作规程自编.doc细胞培养传代、冻存、复苏操作规程第一章总则第一条目的为规范细胞培养实验室的操作流程，确保细胞培养的质量和安全，特制定本操作规程。

第二条适用范围本规程适用于所有进行细胞培养、传代、冻存和复苏的实验室人员。

第三条安全与健康实验室人员在操作过程中必须遵守生物安全和个人防护的相关规范。

第二章细胞培养传代第四条传代前的准备检查细胞培养基、血清、胰蛋白酶等消耗品的质量和数量。

确保无菌操作台、培养箱、显微镜等设备正常运行。

第五条传代操作步骤细胞观察：在显微镜下观察细胞形态，确认细胞健康状况。

培养基更换：使用无菌操作吸去旧培养基，加入适量的胰蛋白酶。

细胞分离：待细胞变圆后，轻敲培养瓶，使细胞脱落。

细胞计数：使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。

细胞传代：根据细胞密度和传代比例，将细胞加入新的培养基中。

第六条传代后的观察观察细胞在新培养基中的附着情况。

定期检查细胞的形态和生长状态。

第三章细胞冻存第七条冻存前的准备准备冻存管、冻存液（含DMSO）、标签等。

确保液氮罐或程序降温仪处于良好状态。

第八条冻存操作步骤细胞计数：确保细胞密度和活力符合冻存要求。

冻存液配制：按照比例加入DMSO至冻存液中。

细胞悬液制备：将细胞与冻存液混合均匀。

细胞冻存：将细胞悬液分装至冻存管中，标记信息。

降温过程：将冻存管放入程序降温仪或直接浸入液氮中。

第九条冻存后的管理将冻存管放入液氮罐中，记录存放位置。

定期检查液氮罐的液位和温度。

第四章细胞复苏第十条复苏前的准备准备培养基、胰蛋白酶、无菌操作台等。

检查培养箱、显微镜等设备是否正常。

第十一条复苏操作步骤取出冻存管：从液氮罐中取出所需冻存管。

快速解冻：将冻存管置于37°C水浴中快速解冻。

细胞悬液制备：将解冻后的细胞迅速转移到含有培养基的离心管中。

离心去除DMSO：低速离心以去除DMSO。

细胞培养：将细胞重悬于新鲜培养基中，转入培养瓶中培养。

一、生物安全柜的操作规程1.进入细菌、细胞间进行实验，必须穿上白大褂和乳胶手套，才能开始后续所有实验操作。

2. 生物安全柜内必备用品：酒精灯、打火机、1000μl枪、200μl枪、200μl枪头一盒、1000μl枪头一盒、移液枪、擦台面的泡有棉球的酒精瓶、装有EP管的瓶子、镊子、记号笔、细胞培养瓶（最多一袋）。

3. 开启紫外灯灭菌之前，请用酒精棉球擦拭台面，并且注意检查如下几点：准备一个废液缸，放入生物安全柜中；移液管是否够用，生物安全柜里面保证至少有一筒装有移液管的铁皮桶；酒精灯的酒精量是否够，若不够请及时添加工业酒精；移液枪是否有电，发现移液枪吸液速度慢了请及时充电；1000μl和200μl枪头是否够，保证生物安全柜里面有各有一盒；擦台面的棉球是否还有，若没有了请及时添加棉球（将医用脱脂棉撕成适宜大小的棉球）和75%酒精；各种型号EP管是否还有，没有了请及时灭菌放入生物安全柜内。

4. 灭菌消毒：开启紫外灯灭菌20-30分钟保证柜内空间无菌，如果紧接着其他实验使用生物安全柜，灭菌5-10分钟即可。

5. 灭菌完后，请打开风机，将挡板升高到一定高度，抽气5-10分钟，将臭氧全部排出。

6. 生物安全柜内所有操作必须带乳胶手套。

7. 实验完毕后，请适当处理废弃物，并且再次用酒精棉球擦拭台面。

8. 生物安全柜内只放一些必备用品，以免影响操作。

如果是私人实验所需物品，请在紫外灭菌之前将其放入进行灭菌。

紫外灭菌后，带入生物安全柜内操作的物品必须先经过灭菌处理。

为了方便他人实验，实验完毕后请务必将私人的实验用品取出。

二．细胞培养箱操作规程1. 培养箱每周换两次超纯水，每两月清洁培养箱一次。

清洁时用75%医用酒精擦拭培养箱，擦拭过程中应关闭培养箱。

2. 取放细胞的过程中严禁对着培养箱内说话，避免引入细菌；取放细胞的手套要喷过酒精，放进培养箱的培养瓶盖最好用75%医用酒精擦拭过。

3. 调节CO2钢瓶的压力为0.05–0.08 MPa，调节压力的时候应关闭培养箱，除仪器负责人不应随便调节CO2压力和仪器参数。

细胞传代标准化流程：
穿戴好白大褂和手套，用75%酒精擦手；
1、取出细胞，显微镜下观察细胞形态和密度，确定细胞生长状况，是否需要传代或换液；
2、将培养基（如有需要还有血清和大瓶高糖培养基）、PBS、胰酶培养基等预热及超净台消毒
结束后，将试剂及细胞等喷酒精后移入超净台，将废液缸喷足酒精移入超净台，取酒精棉放入超净台；
3、点燃酒精灯，将瓶口拧松，过火消毒；
4、在确定细胞生长状况良好且没有污染的情况下，将培养皿中的培养基取（大培养皿6ml，中
培养皿3ml）至一个新的15ml离心管中；（一个1ml枪头）
5、用适量PBS清洗细胞表面（大皿5ml，中皿3ml），并弃去PBS；（一个5ml枪头）
6、加入适量胰酶消化细胞（大皿1ml，中皿0.5ml），此时可将细胞置于37°C细胞培养箱内消
化；（C2C12用5min，3T3-L1用1.5min），（一个1ml枪头）
7、待消化完全后，用胰酶6倍体积的完全培养基中止消化，并吹打培养皿皿底，将细胞移入离
心管；（一个5ml枪头）
8、1000rpm，5min离心，离心间隙可以准备好传代的细胞培养皿，并加好培养基；
9、弃上清，口擦酒精，烧口；
10、加适量完全培养基吹打混匀细胞(沿壁轻轻吹打24次左右)，按合适比例进行细胞传代，
在盖上标记好细胞名称、代数及传代日期并放入孵箱。

（一个1ml枪头）
11、将所有试管收至冰箱，将废液缸及废液取出，装至一次性PE手套，废液缸喷酒精清洗
12、用酒精棉仔细擦拭操净台表面，检查显微镜、离心机是否关闭，孵箱是否正常；
13、做试验记录，打开超净台和细胞间紫外，15min后关闭。

细胞传代标准化流程：
穿戴好白大褂和手套,用75%酒精擦手；
1、取出细胞,显微镜下观察细胞形态和密度,确定细胞生长状况,是否需要传代或换液；
2、将培养基如有需要还有血清和大瓶高糖培养基、PBS、胰酶培养基等预热及超净台消毒
结束后,将试剂及细胞等喷酒精后移入超净台,将废液缸喷足酒精移入超净台,取酒精棉放入超净台；
3、点燃酒精灯,将瓶口拧松,过火消毒；
4、在确定细胞生长状况良好且没有污染的情况下,将培养皿中的培养基取大培养皿6ml,
中培养皿3ml至一个新的15ml离心管中；一个1ml枪头
5、用适量PBS清洗细胞表面大皿5ml,中皿3ml,并弃去PBS；一个5ml枪头
6、加入适量胰酶消化细胞大皿1ml,中皿,此时可将细胞置于37°C细胞培养箱内消化；
C2C12用5min,3T3-L1用,一个1ml枪头
7、待消化完全后,用胰酶6倍体积的完全培养基中止消化,并吹打培养皿皿底,将细胞移入
离心管；一个5ml枪头
8、1000rpm,5min离心,离心间隙可以准备好传代的细胞培养皿,并加好培养基；
9、弃上清,口擦酒精,烧口；
10、加适量完全培养基吹打混匀细胞沿壁轻轻吹打24次左右,按合适比例进行细胞传
代,在盖上标记好细胞名称、代数及传代日期并放入孵箱;一个1ml枪头
11、将所有试管收至冰箱,将废液缸及废液取出,装至一次性PE手套,废液缸喷酒精清
洗
12、用酒精棉仔细擦拭操净台表面,检查显微镜、离心机是否关闭,孵箱是否正常；
13、做试验记录,打开超净台和细胞间紫外,15min后关闭。

细胞转瓶传代一、目的：用于规范细胞传代，使细胞传代规范有序。

二、适用范围：适用于转瓶细胞穿代。

三、责任者：细胞穿代操作者。

四、正文1器材及试剂1.1器具：酒精灯止血钳酒精棉打火机消毒纱布培养转瓶瓶转瓶胶塞倒置显微镜转瓶机废液桶。

1.2 试剂：培养液（DMEM）0.25%胰酶消化液小牛血清等。

2 操作步骤2.1 取刚长成单层的BHK-21转瓶细胞，先用对转瓶表面消毒处理。

2.2 在局百下无菌操作下，打开转瓶胶塞，倒掉转瓶中的培养液。

2.3 先加入50ml胰酶消化液，均匀快速转动转瓶，让胰酶流遍所有细胞表面，洗一遍细胞，中和残余血清，倒掉胰酶消化液。

2.4 重新加入50ml胰酶消化液，均匀快速转动转瓶，让胰酶流遍所有细胞表面，开始消化细胞，边缓慢转动转瓶，边观察，当细胞间隙增大，瓶壁细胞现白雾状时，迅速倒掉胰酶，让残余的胰酶继续消化细胞。

2.5 当瓶壁出现细微划痕时，加入200ml 10血清的细胞生长液，快速让培养液流过所有细胞表面，终止消化。

2.6 盖上胶塞，快速摇动转瓶，利用培养液的剪切力将细胞摇散。

2.7 根据细胞密度及需要，确定扩传比例，在局百下打开转瓶胶塞，加入适量10%血清生长液，摇匀，将细胞分瓶，标记细胞种类，代次，传代时间。

2.8 分好的转瓶放入转瓶机中，转速设定为10r/h，37℃温室恒温培养。

3 清场和记录3.1 工作结束后应全面清场并填写工序记录表转瓶清洗一、目的：用于规范转瓶清洗，使转瓶清洗规范有序二、适用范围：适用于转瓶清洗三、责任者：转瓶清洗操作。

四、正文1、用过的转瓶应立即倒入洗衣粉，灌满自来水浸泡过夜，至少12h小时以上。

而接过毒的转瓶应先高压灭菌再浸泡2、用干净的毛刷刷洗转瓶瓶口残留的污渍，特别是瓶颈及瓶身对接处3、倒掉洗衣液，残留100ml用于刷洗。

刷洗时应注意均匀，避免留有死角，来回刷洗两遍，再用流水冲洗干净、晾干4、晾干的瓶子用重铬酸钾流酸洗液浸泡瓶底6h以上，再放到转瓶机上浸泡过夜，至少12h以上5、泡酸过后的转瓶自流水冲洗3min，注意瓶口及瓶身外面的冲洗。

间充质干细胞传代培养标准操作流程1 目的和范围：1.1 目的：规范间充质干细胞培养操作流程，保证间充质干细胞传代产品制备的稳定性、均一性。

1.2 范围：适用于本实验室细胞培养技术人员间充质干细胞传代培养的全过程。

2 文件：2.1 间充质干细胞传代培养标准操作流程。

3 记录：3.1 间充质干细胞传代培养记录。

3.2溶液配制记录。

3.3清场记录。

4 试剂与耗材：4.1试剂：75%酒精、生理盐水、DMEM培养基（低糖）、Ultroser G(血清替代物)、干细胞冻存液、0.25%胰蛋白酶（含EDTA）。

4.2 仪器设备：超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、镊子、1ml移液枪、水浴锅、离心机、细胞计数仪、电动移液枪、试管架。

4.3耗材：50ml离心管、T175培养瓶、T25培养瓶、2ml冻存管、1ml枪头、10ml移液管、封口膜、无菌纱布。

5工作程序：5.1实验前准备：5.1.1 洁净区及超净工作台紫外照射≥30min，风机开启≥5min。

5.1.2 耗材准备：将已灭菌且在有效期内的器械放入传递窗内紫外照射≥30min后，去包布，经酒精擦拭后放入超净工作台备用。

5.1.3 将DMEM培养基、生理盐水、Ultroser G(血清替代物)、0.25%胰蛋白酶提前30min从冰箱取出待用。

5.1.4 将DMEM培养基、生理盐水、Ultroser G(血清替代物)、0.25%胰蛋白酶用酒精擦拭后放入超净工作台，以便恢复至室温。

5.1.5 将50ml离心管、T175培养瓶、T25培养瓶、2ml冻存管、1ml枪头、10ml移液管经酒精擦拭后放入超净工作台备用。

5.2溶液配制：5.2.1配制要求：实验室所有试剂配制应在超净工作台内，按照试剂说明书或按照实验室细胞培养要求配制试剂。

5.2.2Ultroser G(血清替代物)溶液配制：取一瓶Ultroser G(血清替代物)粉剂，用一次性注射器加入20ml超纯水（无菌）使其溶解约10-15min，再用0.2um一次性过滤器过滤备用。