分子生物学实验室常用DNA marker

DNA分子量标准DNA marker简介DNA Marker 是分子量大小不同的DNA片段。

主要用途就是DNA 分子凝胶电泳时，通过其大小可以粗略估算样品DNA分子量的大小。

现在常用的DNA Marker 有两种，一种是质粒、病毒等DNA经过酶切获得的，分子量大小有零有整；另外一种是固定数值的，比如100 bp，200 bp等，它是通过PCR获得的片段混合物。

本公司生产的DNA Marker是由单一条带混合而成的，带型均匀清晰，克服了传统的酶切分子量DNA Marker的缺点，如小片段和大片段摩尔数相同，但在紫外光照射下亮度极其不均匀的现象。

本公司严格按照每条带的DNA含量（一次一条带约为50 ng）来配置DNA Marker，因而亮度均匀，带型清晰，而且可用于DNA定量的参照物，每种DNA Marker中都有一条带更亮（含量约为100 ng），便于电泳后观察。

DNA凝胶电泳的原理琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。

其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。

琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。

蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此移动的速度不同，根据这个原理可将其分开。

电泳缓冲液的pH在6 ~ 9之间，离子强度0.02 ~ 0.05最为合适。

常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。

琼脂糖凝胶约可区分相差100 bp 的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2 ~ 20 kb。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。

转化：一种生物由于接受了另一种生物的遗传物质而表现出后者的遗传性状，或发生遗传性状改变的现象叫做转化熔解温度Melting temperature ：即通过加热由双链变为单链这一系列温度的位于中部的那点复性Renaturation(annealing)：DNA双螺旋分子变性后的互补单链再结合成双链的过程称为复性点突变：是包括单碱基改变的一种变化回复突变Revertants ：通过逆转已发生变化的突变细胞或有机体而获得自发突变Spontaneous mutations ：是由于自然界的影响而发生，其产生原因是由于DNA复制发生错误或是由于环境的损伤转换Transition：是一种突变，即指一种嘧啶被另一种嘧啶代替，一种嘌呤被另一种嘌呤代替，G-C对被A-T对替换，或者相反如亚硝酸作为氧化脱氨基试剂将胞嘧啶转化为尿嘧啶颠换Transversion ：是一种突变，即嘌呤被嘧啶代替或者相反，因此A-T对变成了T-A或C-G 突变热点：是突变发生频率高的位点或重组频率高的那些位点修饰碱基Modified bases ：是除了那些在DNA(T、C、A、G)、RNA(U、C、A、G) 合成时的四种通用碱基之外的一些碱基，由核酸合成后修饰产生等位基因Allele：是指位于染色体同一位置分别控制两种不同性状的基因。

eg：现有一基因型Aa，A和a就互为等位基因。

同位基因：是指位于染色体上同一位置控制同一性状的基因。

eg：现有一基因型AA，A和A就互为同位基因。

(染色体上同一基因座上的基因，相互作用主要表现为显性、隐性和共显性）。

共显性：一对等位基因的两个成员在杂合体中都表达的遗传现象——人类的ABO血型。

互补测验：比较顺式和反式构型个体的表型以判断两突变是否发生在一个基因座内的测验，称为互补测验又称顺反测验功能获得型突变Gain-of-function mutation ：表示使蛋白质获得新的活性(或功能)，这种性质显性的无效突变Null mutation：一个基因被确定后，可以构建一个缺失该基因的体系来检测它的功能。

12分子量Marker210211212214215216216216217218218218219219219DNA 分子量Marker 图预混合的即用型DNA Marker DNA Step Ladders DNA Ladders 常用DNA Marker 放射自显影Marker 超螺旋DNA Ladder 染色体DNA Marker 荧光DNA Marker RNA Markers 蛋白Marker 体外翻译Marker 基因组DNA 上样染料其它常见水生植物(亚马逊河之剑)Echinodorus paniculatus 的花粉。

放大倍数：1325×。

单个花粉直径为25µm ，这些植物生长在水中，或露出水面，但是花蕾只在水上开放。

DNA 分子量Marker 图分子量Marker核酸分子量Marker说明: Promega 提供用于传统及脉冲电场凝胶电泳(PFGE )所需的范围广泛的DNA 及RNA 分子量Marker (molecular weight marker )。

传统双链DNA 电泳Marker 包括ladders ，限制性内切消化的lambda, φX174和pGEM ® DNA 。

蓝色/橙色上样染料与大多数DNA Marker 一同提供。

同时提供未消化的DNA (如, Lambda, φX174,pBR322等) 以用于自制分子量Marker 。

提供的RNA Marker 的大小范围为281到6,583个碱基。

PFGE 大小Marker 包含Promega-Markers ® Lambda Ladders 。

PFGE Marker 大小范围大约为50kb 到1.0Mb 。

提供的PFGE Marker 为储存于50mM EDTA 缓冲液的橙色琼脂糖系列条带。

Promega 同时还提供蛋白Marker 及体外翻译Marker 。

BenchTop DNA MarkersAgarose, LE, Analytical Grade24Ethidium Bromide Solution, Molecular Grade 29Wizard ®SV Gel and PCR Clean-Up System 92– 1,353bp– 1,078– 872– 603– 310– 281/271– 234– 194– 118– 722% agarose3176T A 12_0ABenchTop φX174 DNA/HaeIII Markers Cat.# G7511 Load 5µl/lane.– 2,645bp– 1,605– 1,198– 6762% agarose– 517– 460– 396– 350– 222– 179– 126– 75/65 [51,36]3177T A 12_0ABenchTop pGEM ®DNA Markers Cat.# G7521 Load 5µl/lane.bp – 1,000– 750– 500– 300– 150– 502% agarose0094T A 05_3ABenchTop PCR MarkersCat.# G7531 Load 6µl/lane.bp– 250, 253– 500– 750– 1,000– 1,500– 2,000– 2,500– 3,000– 4,000– 5,000– 6,000– 8,000– 10,0000.7% agarose1409T A03_6ABenchTop 1kb DNA LadderCat.# G7541 Load 6µl/lane.bp – 1,500– 1,000– 900– 800– 700– 600– 500– 400– 300– 200– 1002% agarose0973T C 03_5ABenchTop 100bp DNA LadderCat.# G8291 Load 6µl/lane.预混和的即用型DNA Marker分子量Marker说明: BenchTop DNA Markers 可以方便地储存于室温(22-25℃)，并可以在琼脂糖凝胶上直接上样。

分子生物学专业名词AAllele(等位基因)：在染色体上占据给定位点基因的不同形式。

Alu family (Alu 家族)：人类基因组中一系列分散的相关序列，每个约300bp 长。

每个成员其两端有Alu 切割位点(名字的由来)。

Amber codon ( 琥珀密码子)：核苷酸三联体UAG，引起蛋白质合成终止的三个密码子之一。

Aminoacyl-tRNA ( 氨酰-tRNA)：是携带氨基酸的转运RNA，共价连接位在氨基酸的NH2基团和tRNA 终止碱基的3`或者2`－OH基团上。

Aminoacyl-tRNA synthetases ( 氨酰-tRNA 合成酶)：催化氨基酸与tRNA 3`或者2`－OH 基团共价连接的酶。

Amplification ( 扩增)：指产生一个染色体序列额外拷贝，以染色体内或者染色体外DNA形式簇存在。

Annealing (退火)：两条互补单链配对形成双螺旋结构。

Antibody ( 抗体)：由B 淋巴细胞产生的蛋白质(免疫球蛋白质)，它能识别特殊的外源“抗原”，从而引起免疫应答。

Anticoding strand (反编码链)：DNA 双链中作为膜板指导与之互补的RNA合成的链。

Antigen (抗原)：进入基体后能引起抗体(免疫球蛋白质)合成的分子。

Antitermination protein ( 抗终止蛋白质)：能够使RNA 聚合酶通过一定的终止位点的蛋白质。

Apoptosis ( 细胞凋亡)：细胞进行程序性死亡的能力；对刺激应答使通过一系列特定反应摧毁细胞的途径发生。

Attenuation (衰减)：控制一些细菌启动子表达中涉及的转录终止调控。

Attenuator (衰减子)：衰减发生处的一种内部终止子序列。

Autonomous controlling element ( 自主控制元件)：玉米中一种具有转座能力的转座元件。

BBacteriophage (细菌噬菌体)：侵染细菌的病毒，通常简称为噬菌体。

第1篇一、实验目的1. 掌握限制性核酸内切酶的原理和应用。

2. 熟悉质粒DNA的提取和纯化方法。

3. 学习琼脂糖凝胶电泳技术，分析酶切结果。

4. 探讨影响酶切效率的因素。

二、实验原理限制性核酸内切酶（RE）是一种能够识别双链DNA上的特定序列，并在识别序列处切割DNA的酶。

根据酶切位点的不同，限制性核酸内切酶可分为两类：Ⅰ类酶和Ⅱ类酶。

本实验所使用的是Ⅱ类酶，如HindⅢ、EcoRⅠ等。

质粒DNA的提取和纯化是分子生物学实验中的基本操作，通过提取和纯化可以获得高纯度的质粒DNA，便于后续的酶切、连接、转化等操作。

琼脂糖凝胶电泳技术是一种常用的分子生物学分离技术，通过电泳分离不同分子量的DNA片段，从而对酶切结果进行鉴定。

三、实验材料1. 质粒DNA2. 限制性核酸内切酶（如HindⅢ、EcoRⅠ）3. 琼脂糖4. DNA marker5. Tris-HCl缓冲液6. 10×Loading buffer7. 1×TAE电泳缓冲液8. 0.5×TAE电泳缓冲液9. 0.5%琼脂糖凝胶10. 紫外灯11. 显影液四、实验步骤1. 质粒DNA的提取和纯化（1）将质粒DNA加入Tris-HCl缓冲液中，加入等体积的酚/氯仿，剧烈振荡，静置5分钟。

（2）取上清液，加入等体积的氯仿，剧烈振荡，静置5分钟。

（3）取上清液，加入2/3体积的95%乙醇，混匀，室温放置10分钟。

（4）将沉淀物用70%乙醇洗涤，室温放置5分钟。

（5）将沉淀物溶于适量TE缓冲液中，即为纯化的质粒DNA。

2. 酶切反应（1）将纯化的质粒DNA加入酶切缓冲液中，加入限制性核酸内切酶，混匀。

（2）37℃水浴孵育2-3小时，或根据酶的说明书进行。

（3）加入适量DNA loading buffer，混匀。

3. 琼脂糖凝胶电泳（1）制备0.5%琼脂糖凝胶，加入1×TAE电泳缓冲液。

（2）将酶切反应产物加入凝胶孔中，同时加入DNA marker。

《分子生物学检验技术》实验指导【实验目的】1、把握动物组织DNA提取的方法；2、把握紫外分光光度法检测、鉴定DNA浓度和纯度的方法。

【实验原理】获得相当纯度和完整性的基因组DNA，可用于DNA酶切图谱、多态性分析、基因诊断、构建基因组文库等。

因此，DNA样品质量的好坏将直截了当关系到实验的成败。

较理想的DNA样品应达到以下三点要求：①不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②最大程度地降低蛋白质、多糖和脂类分子的污染；③排除RNA分子的污染和干扰。

DNA以核蛋白形式存在于细胞中，提取DNA的原则是即要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等成分分离，又要保持DNA分子的完整。

本实验中，用阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠（SDS）消化破裂细胞膜、核膜，并使组织蛋白变性沉淀，DNA从核蛋白中游离分开；为操纵组织中脱氧核糖核酸酶（DNase）对DNA的降解，加入柠檬酸钠或乙二胺四乙酸二钠（EDTA－Na2）以除去兴奋该酶的金属离子，SDS也能使DNase变性失活；蛋白酶K 可水解蛋白质，消化DNA酶；分离后的DNA用饱和酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染；最后用无水乙醇沉淀DNA，得到欲提取的基因组DNA。

260nm处DNA有最大吸取峰，测DNA的A260，可运算其浓度。

而蛋白质在280nm处有最大吸取峰，可测定A260nm/A280nm比值，检测DNA的纯度，该比值介于1.8~2.0之间。

【实验器材和试剂】1、动物小白鼠2、设备移液器、台式离心机、水浴箱、陶瓷研钵等；751紫外分光光度计、石英比色皿、洗瓶、滤纸等。

3、试剂（1）基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技公司）：包括Buffer CL、Buffer PP、Buffer GE、RNase A、Proteinase K（7）生理盐水，4℃贮存（8）无水乙醇、70%乙醇【操作步骤】1、制备肝匀浆迅速处死小白鼠，称取新奇肝脏组织50 mg，用预冷生理盐水洗去血液，滤纸吸干后剪碎组织，将剪碎组织放于组织匀浆器或研钵中研磨，同时加入300 μl Buffer CL。

DNA Marker 类100bpDNAMarkerⅠ 概述： 100bpDNAMarkerⅠ是由单独的 PCR 扩增 目录号 包装 价格PBZ0301-1 PBZ0301-1 50 次 100 次 75.00 140.00 产物混合而成，已含有 1xLoading Buffer,可以 直接电泳。

包括 11 条双链 DNA 片断：100bp、 200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、 800bp、900bp、1000bp 和 1500bp。

特异性加强 500bp。

每次上样 4～5μL。

100bpDNAMarkerⅡ 概述： 100bpDNAMarkerⅡ是由单独的 PCR 扩增 目录号 包装 价格PBZ0302-1 PBZ0302-2 50 次 100 次 75.00 140.00 产物混合而成，已含有 1xLoading Buffer,可以 直接电泳。

包括 6 条双链 DNA 片断： 100bp、 200bp、 300bp、400bp、500bp 和 600bp，适用于短片断 DNA 大小的分析。

特异性加强 500bp。

每次上样 4～5μL。

200bpDNAMarker 概述：200bpDNAMarker 是由单独的 PCR 扩增 目录号 包装 价格PBZ0303-1 PBZ0303-2 50 次 100 次 75.00 140.00 产物混合而成，已含有 1xLoading Buffer,可 以直接电泳。

包括 10 条双链 DNA 片断：200bp、 400bp、 600bp、 800bp、 1000bp、 1200bp、 1400bp、 1600bp、 1800bp 和 2000bp， 特异性加强 1000bp。

每次上样 4～5μL。

1kbDNAMarker 概述： 1kbDNAMarker 是由 8 条 DNA 条带组成，由小到大分别为： 1.0kb, 2.0kb, 3.0kb, 4.0kb,目录号 包装 价格PBZ0303-1 PBZ0303-2 50 次 100 次 75.00 140.005.0kb, 6.0kb, 8.0kb 和 10.5kb 。

(10)申请公布号 (43)申请公布日 2013.09.04C N 103276004 A (21)申请号 201310066305.8(22)申请日 2013.03.01C12N 15/63(2006.01)C12N 15/66(2006.01)C12Q 1/68(2006.01)C12N 15/11(2006.01)C12N 15/10(2006.01)(71)申请人生工生物工程（上海）股份有限公司地址201611 上海市松江区车墩工业区香闵路698号(72)发明人孔凡静 王素莲 王乾(74)专利代理机构上海脱颖律师事务所 31259代理人李强(54)发明名称一种DNA marker 质粒及其制备与应用(57)摘要本发明公开了一种DNA marker 质粒及其制备与应用。

本发明的DNA marker 质粒为双链闭合环状DNA 分子，所述DNA marker 质粒的核苷酸序列为：SEQ ID NO:3。

本发明由于选择了高拷贝复制子pUC ori ，使质粒抽提得率提高，且由于人工合成的全序列的高度可变性，使重组DNA marker 质粒不含有重复序列，提高了质粒的稳定性，并且使重组DNA marker 质粒以最小的长度涵盖最多酶切现象可能性。

(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书5页序列表11页 附图3页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书5页序列表11页 附图3页(10)申请公布号CN 103276004 A*CN103276004A*1/1页1.一种DNA marker 质粒，为双链闭合环状DNA 分子，所述DNA marker 质粒的核苷酸序列为：SEQ ID NO:3。

2.如权利要求1所述DNA marker 质粒的制备方法，包括下列步骤：A.制备母本质粒M1，所述母本质粒M1为将全长核苷酸序列为SEQ NO.1的双链DNA 分子用AflII 酶切后，自身环化获得；B.合成全长序列为SEQ ID NO.2的双链DNA 分子M2，用NdeI/AflII 酶切后，克隆到母本质粒M1上，获得本发明的DNA marker 质粒。

DNA Marker 使用问题分析
条带模糊
∙凝胶浓度不合适
对于长片段，低浓度胶分离效果好；对于小片段，高浓度的胶分辨率高。

∙电泳缓冲液缓冲能力差
电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。

∙电压太高，电泳时间长
电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃。

如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。

特别是电压太高易出现缺带现象。

电泳过程中由于会产热，因此电泳时间长容易发生带模糊，特别是小片段会变的模糊。

∙凝胶放置时间太长
∙DNA上样量多
∙琼脂糖的质量差，导致DNA条带分辨率
亮度不够
∙上样量少
∙EB浓度低
如电泳结束后，用 EB染胶的方法，则染胶时间短。

DNA Marker 降解
∙污染了核酸外切酶。

建议用灭菌的枪头，用后及时将管盖拧紧。

∙点样时将电泳缓冲液带入DNA Marker中，建议及时更换枪头。