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第二章基因工程制药(二).pptx

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《基因工程制药》PPT课件

《基因工程制药》PPT课件

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21
一、反转录法
反转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA，再反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的 克隆表达。
cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内 含子。
cDNA:真核基因经过转录后,经过剪切、拼 接、修饰形成的成熟的mRNA，mRNA反转录的 结果为cDNA。
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22
第一个合成蛋白质的国家。
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10
基因工程药物种类
基因工程技术可生产的药物和制剂包括: (1)免疫性蛋白,如各种抗原和单克隆抗体; (2)细胞因子,如各种干扰素,白细胞介素,集
落刺激生长因子,表皮生长因子,凝血因子; (3)激素,如胰岛素,生长激素,心素纳; (4)酶类,如尿激酶,链激酶,葡激酶,组织型纤
50%!
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8
20世纪70年代基因工程诞生最先应 用在医药科学领域。
1982年第一个基因工程产品--人胰 岛素在美国问世。
优点:大量生产、应用临床、深入研 究、扩大应用。
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9
结晶牛胰岛素：1965年9月17日，中国首次人 工合成结晶牛胰岛素。这是当时人工合成的具有 生物活力的最大的天然有机化合物，使中国成为
维蛋白溶酶原激活剂,超氧化物歧化酶.
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11
基因工程药物：采用基因工程技术研制的， 能预防和治疗某种疾病但含量极微而难以 用传统方法制取的特殊药物。
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12
第二节 基因工程药物生产的基本过程
基因工程技术是将重组对象的目的 基因插入载体，拼接后转入新的宿主细 胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗 传物质的重新组合，并使目的基因在工 程菌内进行复制和表达的技术。
除菌过滤

基因工程制药PPT课件

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在体外反转录成cDNA，与适当的载体 常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌， 则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增， 这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集 合称为该组织细胞的cDNA。第二章基因工程制药
主要内容： 基因工Fra bibliotek制药的基本过程。 目的基因的获得及基因的表达。 基因工程菌的生长代谢特点，其质粒不稳定 产生的原因及提高质粒稳定性的方法。 基因工程菌的培养方式，发酵工艺及培养设 备。 基因工程药物的分离纯化。 基因工程药物的质量控制。
第一节
概
述
传统生物药物由于来源及制备上的困 难、价格等因素的影响，此外在制备过程 可能受到的病毒、衣原体、支原体等的感 染等问题，促使人们寻求安全、实用、疗 效可靠的新方法来制备生物药物。
20世纪70年代基因工程诞生最先应 用在医药科学领域。 1982年第一个基因工程产品--人胰 岛素在美国问世。 优点:大量生产、应用临床、深入研 究、扩大应用。
结晶牛胰岛素：1965年9月17日，中国首次人 工合成结晶牛胰岛素。这是当时人工合成的具 有生物活力的最大的天然有机化合物，使中国 成为第一个合成蛋白质的国家。
上游：主要指的是目的基因分离、工程菌 （或细胞）构建。上游阶段的工作主要在 实验室内完成； 下游：主要指的是从工程菌（或细胞）的大 规模培养一直到产品的分离纯化、质量控 制等。
工程菌（或细胞）构建中重要的工具
该过程中重要的工具便是酶：限制性内切 酶和连接酶是将所需目的基因插入适当的载体 质粒或噬菌体中并转入大肠杆菌或其他宿主菌 （细胞）大量复制目的基因过程中的重要工具。
人体来源：人血浆中制备人血浆白蛋白； 男性尿中制备尿激酶；孕妇尿中制备绒膜促 性激素；人血白细胞中制备白细胞介素等。

基因工程制药新版(2)ppt课件

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（二）关于限制酶
1、宿主限制现象 2、限制酶的定义 3、限制酶的特征 4、限制酶的作用 5、基因工程所用到的限制酶 6、影响限制酶作用的因素
1、宿主限制现象
病毒或噬菌体在宿主A细胞中生长良好,但在 宿主B细胞中生长很差,原因是它的DNA受 到宿主B的限制,这种现象是宿主控制性限
制 （restriction）与修饰(modification) ,简
※EcoB(大肠杆菌B株)的核酸酶不能识别已甲基化
的序列。
甲基化酶
ECOB核酸酶
TGAN8TGCT ACTN8ACGA
CH3 TGAN8TGCT ACTN8ACGA CH3 CH3 CH3
噬菌体来源序列
宿主来源序列

R/M体系的作用：
保护自身的DNA不受限制； 破坏外源DNA使之迅速降解
பைடு நூலகம்
※限制性内切酶本是微生物细胞中用于
称（R/M体系）。

细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别 自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降 解掉。

R/M体系： 是由两种酶活性配合完成的： 一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶
E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶
※当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有 EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。 而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列， 但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲 硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列 的特定碱基，使之甲基化。
3、限制酶的特征
具有专一性的识别 位点。
能够形成固定的核 苷酸单链末端。 比较适合于进行 DNA结构的分析 和进行基因重组。

第二章 基因工程制药.ppt

第二章 基因工程制药.ppt

2019-10-13
谢谢你的关注
五、重组蛋白质的分离纯化
1. 离子交换层析：
是以离子交换剂为固定相， 依据流动相中的组分离子与交换 剂上的平衡离子进行可逆交换时 的结合力大小的差别而进行分离 的一种层析方法。
6. 降低成本，提高产品质量。
2019-10-13
谢谢你的关注
二、基因工程药物生产的基本过程
1. 目的基因的获得 2. 构建DNA重组体 上游技术 3. 构建工程菌 4. 工程菌的发酵 5. 外源基因表达产物的分离纯化 6.产品的检验
2019-10-13
谢谢你的关注
2019-10-13
谢谢你的关注
1．小分子量的蛋白或多肽 2．已知核苷酸顺序或氨基酸顺序 3．费用较高
2019-10-13
谢谢你的关注
V第it三a节m基in因表B达2
基因表达的成败，直接影响药品的质量、成本。基因表达是外 源基因在生物体转录、翻译以及所有加工过程，是外源基因异源转录 翻译利用宿主功能的过程，也是外源DNA、RNA、Pr克服宿主细胞 进攻，保护自身的过程。
2019-10-13
谢谢你的关注
Vitamin A
2019-10-13
谢谢你的关注
第二节 目的基因的获得
一、 反转录法 二、化学合成法
2019-10-13
谢谢你的关注
一、反转录法
1．mRNA的纯化
（1）选择表达目的蛋白质丰度高的 mRNA的生物材料。
（2）分离总RNA。 （3）分离mRNA（多聚T纤维素）
三、国内外基因工程药物研究进展
目前研制的基因工程药物主要包括: 1. 免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体; 2. 细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子

生物技术制药-第二章-基因工程制药(201309-201401-2)

生物技术制药-第二章-基因工程制药(201309-201401-2)


7、目的cDNA克隆的分离和鉴定
cDNA克隆示意图
mRNA
逆转录酶
ss-DNA
DNA聚合酶I Klenow片段
ds-cDNA 核酸酶S1
ds-cDNA
二、逆转录－聚合酶链反应法（RT-PCR）
1985，PCR发明以后，RT-PCR得到了广泛的应用。
特异引物 mRNA 逆转录酶 ss-DNA PCR 目的cDNA链
优点：表达产物可由重组转化细胞分泌到培养 液中，纯化容易。产物是糖基化的接近天然物。 缺点：生长慢，生产率低，培养条件苛刻，费 用高，培养液浓度稀。
二、大肠杆菌体系中的基因表达
（一）表达载体 表达载体必须具备的条件
（1）载体能独立地进行复制 (复制起点，ori)
（2）应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记
核酸酶S1
第三节 目的基因的获得
克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合 成法。（不能直接分离？）
一、逆转录法
逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再 反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表达。 cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内含子。
逆转录法的步骤
1、mRNA的纯化 2、cDNA第一链的合成 3、cDNA第二链的合成 4、cDNA克隆
利用基因工程技术生产药品的优点：
（1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋 白和多肽； （2）可以提供足够数量的生理活性物质；
（3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的
内源性生理活性物质；
（4）基因工程和蛋白质工程进行改造和去除 内源性生理活性物质的不足之处。 （5）利用基因工程技术可获得新型化合物，
又分为普通表达载体和精确表达载体

基因工程制药2课件

基因工程制药2课件
（4）大肠杆菌中不存在翻译后的修饰系统，不能对 蛋白质产物进行糖基化. （5）大肠杆菌内的蛋白酶会对目的蛋白质造成破坏。 （6）大肠杆菌会产生内毒素，难以除去。
2、枯草芽孢杆菌
优点： （1）分泌能力很强，可以将蛋白质产物直接分 泌到培养液中。 （2）不会形成包含体。
缺点： （1）不能使蛋白质产物糖基化。 （2）枯草芽孢杆菌具有很强的胞外蛋白酶分泌 系统，常常对蛋白质产物造成破坏。
质粒pBV220的结构框：（图2－3）
ori-------复制起始点；
clts857-------抑制子基因，在31℃时，其基因产物 具有阻抑PL的活性，当温度升高时，这种阻抑活 性就丧失，PL就开始指导合成mRNA；
PR-------启动子1；PL--------启动子2； BglII、EcoRI、SmaI、BamHI、SalI、PstI、
缺点： （1）生产慢、 （2）生产率低、 （3）培养条件苛刻、费用高， （4）培养液浓度较稀。
二、大肠杆菌体系中的基因表达
（一）表达载体 （二）影响真核基因在大肠杆菌中表达的因素 （三）真核基因在大肠杆菌的中表达的形式
（一）表达载体
表达载体必须具备的条件：
（1）载体能独立地进行复制：分严紧型和松弛型，前 者在宿主细胞中拷贝数仅1~3个，后者在宿主细胞中 拷贝数可高达3000个。
表达载体必须具备的条件
（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信 号，即起始密码AUG和SD序列（ShineDalgarno sequence），以便转录后能顺利翻译。
大肠杆菌表达载体的构成：
复制及选择系统 （载体）
转录系统
（目的基因）
蛋白质翻译系统 （目的蛋白）
23
外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理：
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第二章 基因工程制药
14
影响目的基因在酵母菌中表达的因素
外源基因的拷贝数 外源基因的表达效率 外源蛋白的糖基化 宿主菌株的影响
第二章 基因工程制药
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外源基因的拷贝数
拷贝数要适当，高拷贝数的质 粒载体可使外源基因高效表达， 但会引起细胞生长量的降低， 单拷贝的质粒载体对细胞的最 大生长没有影响，能达到较高 效的表达。
优点：在周质中稳定，有活性，不 含蛋氨 酸残基。
缺点：产量不高， 信号肽不被切割。
第二章 基因工程制药
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酵母中的基因表达
载体：
酵母载体是可以携带外源基因在在酵母细 胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子 代细胞的DNA 或RNA单位。
从大肠杆菌中制备质粒要比从酵母中容易 得多，因此酵母质粒的加工和制备大部分 是通过大肠杆菌进行的，只有在最后阶段 在转入酵母中。
9
非融合蛋白形式表达药物基因
非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的 蛋白质以真核蛋白的mRNA的 AUG为起始，在其氨基端不含细 菌多肽序列。
优点：保持原有蛋白活性。 缺点：易被蛋白酶破坏。
第二章 基因工程制药
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分泌型表达药物基因
将外源基因接到信号肽之后，使之在胞质 内有效地转录和翻译，当表达的蛋白质进 入细胞外膜和细胞内膜之间的周质后时， 被信号肽酶识别切割，从而释放出有生物 活性的外源基因表达产物。
终止序列保证了转录产物在适当的部位终止和加 上多聚腺苷酸尾巴，这样形成的mRNA可能比较 稳定并被有效地翻译。
第二章 基因工程制药
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外源蛋白的糖基化
外源蛋白在酵母细胞中可发生N-糖 苷键和O-糖苷键连接的两种不同的 糖基化。
外源蛋白经糖基化后可以以有效的 活性型分泌到培养基中。
某些蛋白质糖基化后更加稳定，便 于分离精制。
外源基因是克隆到载体上的，所以 载体在宿主中的拷贝数就直接与外 源基因的表达相关，应将外源基因 克隆到高拷贝的质粒载体上，这对 于提高外源基因的总体表达水平非 常有利。
第二章 基因工程制药
3
外源基因的表达效率
启动子的强弱 核糖体接合位点的有效性 SD序列和起始密码ATG的间距 密码子组成
第二章 基因工程制药
粒）
第二章 基因工程制药
13
表达载体
普通表达载体：只能方便地引入外源基因并
进行表达，对表达产物的组成，特别是对其氮末 端氨基酸是否有增减并无严格要求。
精确表达载体：要求在启动子或前导肽编码
序列的适当部位有内切酶位点，以利于接入外源 基因，并使它在表达和加工后氮末端氨基酸序列 与天然产物相同，既无多余的氨基酸，也无缺失 的氨基酸。
第二章 基因工程制药
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载体的复制系列
分四类：
Yep类（yeast episomal plasmid，酵母附加体质粒） YRp类（yeast replication plasmid，酵母复制型
质粒） YCp类（yeast centromeric plasmid，酵母着丝粒
质粒） YIp类（yeast integrative plasmid，酵母整合型质
第二章 基因工程制药
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宿主菌株的影响
菌体生长力强 菌体内源蛋白酶要较弱 菌体性能稳定 分泌能力强
第二章 基因工程制药
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动物细胞中的基因表达
优点：
哺乳动物细胞外源基因表达产物可由 重组转化的细胞分泌到培养 液中，使 产物易纯化。
基因产物糖基化接近天然产物。
第二章 基因工程制药
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动物细胞中的基因表达
缺点：
细胞生长慢，生产率低 条件刻苛，费用高 培养液浓度较小 表达的外源细胞均为传代细胞 表达产物是否致癌尚有疑问
第二章 基因工程制药
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主要基因工程表达体系比较
表达体系
产 物 产生部位 培养方式 提 纯 产物活性 潜在危险性
大肠杆菌 多肽蛋白质 菌体内 融合蛋白质
容易
一般
部分高产
对原核好 对真核差
第二章 基因工程制药
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外源基因的表达效率
要使外源基因在酵母中表达必须将外源基因克隆 到酵母军表达载体的启动子和终止子之间，构成 表达框架。
分泌信号包括信号肽部分以及前导肽部分的编码 序列，它帮助后面的表达产物分泌出酵母细胞， 并在适当的部位由胞内蛋白酶加工切断表达产物 与前导肽之间的肽键，产生正确的表达产物。
4
表达产物的稳定性
利用大肠杆菌的信号肽或某些真核多肽中 自身的信号肽，把真核基因产物运输到胞 浆周质的空隙中，而使外源蛋白不易被酶 降解；
组建融合基因，产生融合蛋白；
采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋 白二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定 性；
选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞。
第二章 基因工程制药
5
细胞的代谢负荷
外源基因的表达产物属于异己物质，并可能对宿 主细胞有毒性。调节表达物质的积累与细胞的生 长和代谢之间的平衡有利于外源基因的高效表达。
另外通过将细胞的生长和外源基因的表达分成两 个阶段，或将宿主细胞的生长与重组质粒的复制 分开两种手段也可以减轻细胞代谢的负荷。
形成不溶性的包含体可以降低表达产物对宿主细 胞的毒害作用。
第二章 基因工程制药
6
工程菌的培养条件
除宿主、载体和克隆基因三者之间 的关系影响外源基因的高水平表达 外，培养条件亦是非常值得研究的 因素。
优化培养条件使外源基因大量表达。
第二章பைடு நூலகம்基因工程制药
7
真核基因在大肠杆菌中的表达形式
三种表达形式： 融合蛋白 非融合蛋白 分泌型。
第二章 基因工程制药
不大
酵 母 多肽蛋白质 菌体内 糖基化蛋白 外分泌
8
融合蛋白形式表达药物基因
融合蛋白的氨基端是原核序列，羧基端是 真核序列，这样的蛋白质是由一条短的原 核多肽和真核蛋白结合在一起的。
优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定， 易实现高效表达。
缺点：只能作抗原用。原核多肽序列可能 会影响真核蛋白的免疫原性。可再切割成 两个多肽链。
第二章 基因工程制药
第二章 基因工程制药 (二）
第二章 基因工程制药
1
影响目的基因在大肠杆菌中 表达的因素
外源基因在宿主中的表达受许多因 素影响的，所以在建立表达体系时 要综合考虑各种因素的作用，建立 一个合适的表达体系，从而使外源 基因得到最大的表达量，获得最多 的表达产物。
第二章 基因工程制药
2
外源基因的拷贝数