第四章 基因工程制药

制 备 基 因 工 程 药 物 的 一 般 程 序
Get Target Gene
Filtration
Bacteria Free
Construction Recombinant Plasmid
Identification
Construction Gene Engineering Bacterium
Semi-manufactured Goods
Culture Engineering Bacterium
Identification Finished Products
Separate and Purify the Products
Make up or Packaging
基因工程药物的上游技术：
1、基因克隆载体:质粒载体， 2、重组DNA技术的有关工具酶及其应用 3、核酸制备技术：制备纯净、高质量的 载体DNA和待克 隆的 核酸，才能有效地进行后续的酶切、反转录、连接等 分子克隆操作。 1）用碱抽提法分离质粒DNA 原理：细胞pH12.0-12.6线状DNA变性，cccDNA不变性，加酸 恢复pH到中性，变性的染色体DNA交织成网而沉淀，上清 用酚处理使蛋白变性，用醇沉淀质粒DNA。 A）质粒DNA的小量制备 B）质粒DNA的大量制备
2）染色体DNA的制备
3）真核细胞RNA的制备 4) DNA的凝胶(Agarose)电泳和 凝胶中DNA的 回收 5) SDS-PAGE电泳和 凝胶中DNA的 回收
心 肝 脾 肺 肾 胃 脑 大肠睾丸 心 肝 脾 肺 肾 胃 脑 大肠卵巢
第一节 目的基因的获得
问题：来源于真核细胞的产生基因工程药物的目的基因，为什 么不能进行直接分离？
10mM Tris 1mM EDTA
纤维素柱纯化Poly(A)mRNA 流程图
Poly(A)mRNA
2、cDNA第一链的合成：一次好的逆转录反应可使
oligo(dT)选出的mRNA有5—30%被拷贝。
3、cDNA第二链的合成：
4、cDNA cloning：expression vector pUC
以Fusion Protein的形式表达药物基因 许多蛋白质药物与原核生物的蛋白质融合后，能保留原有 的免疫原性。一些免疫原性弱的多肽制成融合蛋白，其免疫 原性能得到加强。用这种融合蛋白免疫动物所制备的抗体， 能够用于检测原来的多肽药物，也可用于药代动力学研究， 药物受体研究以及药物产品的检测。
T10 Expression in Eukaryotic Cells
1
2
3
1
2
3
Fig. 2A
Fig.2B
Fig. 2A pCMV/myc-T10 expressed in 293T cells. Lane1: Mr; Lane2: negative control; lane3: expressed T10 protein. Fig. 2B pCMV/myc-T10 expressed in 293T cells. Lane1: Mr; Lane2: negative control; lane3: expressed T10 protein.
Incision(切割),recombinant ,transformation and expression. Gene Manipulation/Gene cloning/DNA recombination. ● 基因工程技术最成功的成就:用于新型生物技术药物的研制
● 基因工程技术的主要工具: * Tool enzyme 工具酶:restriction enzyme, ligase, repair. * Nucleic acid and protein sequence:Basis for gene analyze and synthesis. * Transfer vector: gene transfer * Expression vector: Manufacture plant for gene replication and expression target products. Good Vectors: Ecol. ,---- High efficiency expression but glycoprotein Beer yeast , mammalian cell ----glycoprotein
基因工程技术的应用特点：
A、为癌种、病毒性疾病、心血管疾病和内分泌疾 病的预防、治疗和诊断提供新型疫苗、新型药物和 新型诊断试剂。 B、基因工程技术的最大好处在于它能从极端复 杂的机体细胞内取出所需要的基因，将其在体外进 行剪切拼接、重新组合，然后转入适当的细胞进行 表达，从而生产出比原来多数百、数千倍的相应的 蛋白质。
进行基因表达研究的主要问题是目的基因的表达产量、 表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯 化。因此，建立最佳的基因表达体系，是基因表达设计的关 键。
GST-T10 Fusion Protein Expression
1
Phosphorylase Albumin 97 KD 66 KD
2
小量制备
挑单菌落接种在2ml含 抗菌素的 LB中，过夜
将1ml培养物用0.5ml 水和 Solution I 100ul 悬浮 Solution II 200ul冰浴裂解 Solution III 150ul恢复pH 酚/氯仿抽提 乙醇沉淀DNA
大量制备
用10ml过夜培养物接种500ml含 抗菌素的 LB, 37℃,振荡，使 OD600为0.8－1.0。 离心回收菌体，用50ml 水和 Solution I 10ml 悬浮，加溶菌酶 Solution II 20ml 冰浴裂解 Solution III 15ml恢复pH 上清加0.6倍异丙醇，得沉淀 70％乙醇洗DNA 酚/氯仿抽提 乙醇沉淀DNA
5、将重组体导入host cell 6、cDNA library identification 7、目的cDNA 克隆的分离和鉴定 （限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测 序、确定基因的 转录方向、转录起始点等。）
二、化学合成法
较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成 法获得。化学合成法有个先决条件是：必须知道目的基 因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序， 再按相应的密码子推导出DNA的碱基系列。
3
GST-T10
Glutamic dehydrogenase 53 KD Glyceraldehyde-3-Phosphate 36KD
Trypsinogen
24 KD 17 KD
Fig.2 GST-T10 fusion protein expressed in BL21 induced with 1mM IPTG. Lane 1: Mr; Lane 2: Negative control; Lane 3: expressed GST-T10 fusion protein .
c. 费用太高。
第二节
基因表达
克隆蛋白质药物基因的一个主要目的使为了高效的表达该 基因，从而大量地市场原本难以获得的药物。
基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有 加工过程。基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的 表达活动，即剪切下一个外源基因片段，拼接到另一个基因 表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产 物。
小鼠胚胎学
DNA序 列分析 插入生殖细胞 定点突变改 变基因结构 功的诞生与及其相关学科的关系
“863”高技术计划在生物技术领域研究的三个主
题之一是：新型药物、疫苗和基因治疗，重点是 利用现代生物技术手段，开发化学合成法难以生 产的药品。
陈 杨 王 淦 芳 嘉 大 昌 允 墀 珩
● 传统制药存在的问题：
A、材料来源困难或制造技术问题而无法付诸应用；
B、从动物脏器中提取出来，也因造价太高，或因来
源困难而供不应求；
C、由于免疫抗原等缘故，使它们在使用上受到限制。
● 基因工程技术的特点：就是能够十分方便有效地生
产许多以往难以大量获取的生物活性物质，甚至可 以创造出自然界中不存在的全新物质。
基因工程技术生产药品的优点：
a. 可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质，为 临床使用提供有效的保障； b. 可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理生化 和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；
c. 利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性
物质；？？ d. 内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处， 可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造；？？ e. 利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来
中 中 国 国 科 科 学 学 院 院 院 院 士 士 、 ， ， 著 中 著 “十五”期间，863计划选择了信息技术、生物和现代农业技术、新材料、先进制造与自动 名 国 名 化技术、能源技术、资源环境技术等6个高技术领域 。 高 电 工 空 能 子 程
基因工程药物生产的基本过程
基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段： 上游阶段：主要是分离目的基因、构建工程菌(细 胞)。目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表 达。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋 白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。 此阶段的工作主要在实验室内完成。 下游阶段：从工程菌的大量培养一直到产品的分离 纯化和质量控制。此阶段是将实验室的成果产业化、 商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确 立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置 的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备 技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造， 电子计算机的优化控制等。
方法：合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷
酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片 段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成 较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。