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β-葡萄糖苷酶抗体的制备及比较分析余厚美;张振文【摘要】β-葡萄糖苷酶是一种广泛存在于自然界的水解酶,其含量高低直接关系到水解产物的量.木薯含有大量的生氰糖苷,是β-葡萄糖苷酶的底物之一,被水解后将产生有毒的氰化物,给食品安全带来隐患.为保障食品安全,给木薯及其制品的氰化物含量提供快速检测技术.本研究以A,B,C3种来源的β-葡萄糖苷酶为抗原免疫Balb/C小鼠,并制备单克隆抗体和做出初步评价.结果表明,A抗原免疫的小鼠融合后获得5株杂交瘤细胞株,效价均达到105以上,抗体亚型均为IgG1型,但单克隆抗体与B抗原、C抗原、KLH、BSA均无交叉反应.说明不同来源的β-葡萄糖苷酶免疫小鼠得到的抗体均为特异性抗体.【期刊名称】《热带生物学报》【年(卷),期】2019(010)001【总页数】5页(P89-93)【关键词】β-葡萄糖苷酶;抗体;抗体制备【作者】余厚美;张振文【作者单位】中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/国家薯类加工技术研发分中心/农业部木薯种质资源保护与利用重点实验室,海南儋州571737;中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/国家薯类加工技术研发分中心/农业部木薯种质资源保护与利用重点实验室,海南儋州571737【正文语种】中文【中图分类】Q-331β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase，EC3.2.1.21)是一种水解酶，也叫β-D-葡萄糖苷水解酶、龙胆二糖酶[1]，能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基[2]，相对分子质量一般在40×103～250×103之间。
1837 年， LIEBIG和 WOHLER首次在苦杏仁中发现β-葡萄糖苷酶，其广泛存在于许多古细菌、细菌、真菌、酵母、曲霉、昆虫、动物和植物中[3-5]。
不同来源的β-葡萄糖苷酶的相对分子质量差异较大，这是由其结构和组成的不同导致的。
由于参与生物体的糖代谢，β-葡萄糖苷酶对维持生物体的正常生理功能有着重要作用[2]，已经在哺乳动物的疾病防治和人类的癌症治疗方面广泛开展了应用研究[2,6]；此外，β-葡萄糖苷酶还能将果、蔬、茶中的风味前体物质水解为具有浓郁天然风味的香气物质，协助纤维素酶降解纤维素等功能[1-2,7-8]，在饲料工业、生物合成和生物燃料等领域，β-葡萄糖苷酶同样有巨大的应用价值[4,9]。
生物资源 2021,43(2 ):101〜109Biotic ResourcesDOI ： 10. 14188/j. ajsh. 2021. 02. 001植物，葡萄糖苷酶的研究进展王晨，李家儒(武汉大学生命科学学院杂交水稻国家重点实验室，湖北武汉430072)摘要：广葡萄糖苷酶是一种糖苷水解酶，广泛存在于动物、植物和微生物中。
f 葡萄糖苷酶能够水解非还原性末端糖基， 在植物细胞壁代谢、植物激素激活以及逆境防御等方面发挥着重要作用。
/?-葡萄糖苷酶依据其氨基酸序列可以分为GH 1、0只3、0145、0只7、0只9、0只12、0只35、0扣16等8个家族；但是，目前仅对(^1和0只3有较深人的研究，其他家族的功能依旧不清楚。
综述了近年来植物中&葡萄糖苷酶的结构、理化性质、底物特异性、催化机制以及糖苷水解酶家族在植物中的功能等 方面的研究进展，总结了植物中/?_葡萄糖苷酶研究中存在的问题，并指出今后的研究方向。
关键词：泽葡萄糖苷酶；基因家族；活性位点；异源表达中图分类号：Q946.5文献标志码：A文章编号：2096-3491(2021)02-0101-09Research progress of plant j?-glucosidaseWANG Chen，LI Jiaru(Sate Key Laboratory of Hybrid Rice, College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072,Hubei,China)Abstract ： /?-glucosidase is a glycoside hydrolase, widely found in animals, plants and microorganisms, ^-glucosi-dase can hydrolyze non-reducing terminal glucosides in plants, and thus it plays an important role in plant cell wall metabolism, phytohormone activation and defense response. /?-glucosidase can be divided into G H 1, GH 3, GH5, GH 7, G H9, GH12, GH35, GH116 based on amino acid sequence. However, only GH1 and GH3 have been studied deeply, and the functions of other families are still unclear. The research progress on the structure, physicochemical properties, substrate specificity, catalytic mechanism and the function of /?-glucosidase in plants in recent years are reviewed in this paper. Problems in the research are summarized and the future research direction is pointed out.Key words ： /?-glucosidase ； gene family ； active site ； heterologous expression〇引言丨葡萄糖昔酶（/?-glucosidase,EC 3.2. 1.21)，也 称为葡萄糖糖苷水解酶，是一类纤维素酶，能够 从含糖化合物中催化水解末端的非还原性/?-〇-糖苷 键，释放出^-D -葡萄糖及相应的单糖、寡糖或复合 糖。
化工能源化 工 设 计 通 讯Chemical EnergyChemical Engineering Design Communications·144·第47卷第2期2021年2月β-葡萄糖苷酶也称为β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，其可以水解释放出β-D-葡萄糖及相关配基。
1837年研究人员在苦杏仁中发现了β-葡萄糖苷酶，随后研究调查得出β-葡萄糖苷酶在植物和昆虫及细菌体内广泛存在，β-葡萄糖苷酶参与了生物体内的糖代谢过程，对维持生物正常的生理功能有重要作用。
β-葡萄糖苷酶参与EMP 糖酵解的途径属于参与双歧杆菌糖代谢的有关酶系。
哺乳动物和人体内的乳糖酶/根皮苷（LPH ）水解酶也包含着芳基-β-葡萄糖苷酶，乳糖酶/根皮苷由于涉及成人型乳糖酶缺乏病得到广泛实验研究，同时β-葡萄糖苷酶可以使得水果和蔬菜及茶叶中的风味前体物质水解为有浓郁天然风味的香气物质，可以协助纤维素酶降解纤维素[1]。
1 β-葡萄糖苷酶简介β-葡萄糖苷酶分布比较广泛，普遍存在于植物的种子和微生物中，动物中也存在着大量的β-葡萄糖苷酶，根据酶对底物水解所具有的专一性特点，β-葡萄糖苷酶主要有芳香基-β-葡萄糖苷酶和烃基-β-葡萄糖苷酶及多底物特异性β-葡萄糖苷酶三种类型。
根据酶的结构和催化结构域的氨基酸序列等特点对其分类时，糖苷水解酶的GH1和GH3家族中所包含着的β-葡萄糖苷酶最多[2]。
β-葡萄糖苷酶是纤维素酶当中不可缺少的重要方面，随着时代的进步发展，像目前我国的医疗、食品乃至其他行业领域内，都有β-葡萄糖苷酶的应用身影。
最为关键的是，在我国经济等方面迅速发展的基础上，所带来了环境污染问题，鉴于严重的环境能源危机下，社会各界人士对β-葡萄糖苷酶提出了极高的关注程度。
通过实际调查发现，在对β-葡萄糖苷酶实施水解过程中，还存在的很大的困难就是纤维素彻底降解为单糖。
站在基因工程与蛋白质工程视角下进行分析，已经获取到了良好的β-葡萄糖苷酶。
桦褐孔菌β—葡萄糖苷酶基因的克隆与定量表达分析摘要：利用反转录PCR（reverse transcription PCR，RTPCR）和cDNA末端快速扩增（rapidamplification of cDNA ends，RACE）技术从桦褐孔菌（Inonotus obliquus）菌核中克隆了β葡萄糖苷酶基因的全长DNA序列，命名为IOBGL。
该DNA序列全长3382 bp，其中开放阅读框（ORF）长度为2583 bp，含有13个内含子和14个外显子，编码860个氨基酸，相对分子量为93.4 kD，等电点为5.57，编码的氨基酸序列与地中海嗜蓝孢孔菌（Fomitiporia mediterranea）相似性最高（85%）。
采用实时荧光定量PCR技术研究IOBGL基因在菌核发育过程中的表达量变化，结果表明，IOBGL基因在菌核的发育过程中，表达量呈先上升后下降趋势。
关键词：桦褐孔菌；内切葡聚糖酶；菌核桦褐孔菌（Inonotus obliquus）又称桦纤孔菌、斜生纤孔菌，俄语名为：Chaga，是一种珍贵的药用真菌，菌核为药用部分[1]，具有增强免疫功能、降血糖和抗肿瘤等多种功效。
桦褐孔菌广泛分布于欧洲、亚洲和北美洲[2]，在我国主要分布于黑龙江大小兴安岭、吉林长白山区、内蒙古、河北、山西和陕西的天然林内[35]。
目前桦褐孔菌菌核的人工栽培虽然取得成功，但是由于菌核产量低，尚不能进行规模化生产。
所以，提高人工栽培的菌核产量势在必行。
诸多研究表明，纤维素酶活性与子实体的产量密切相关[68]，而β葡萄糖苷酶（betaglucosidase，BGL）是纤维素酶系的主要组分之一，广泛的分布于细菌、真菌和许多动植物体内[9]。
研究发现，BGL参与EMP糖酵解途径，主要是协助其它酶将纤维二糖和纤维素寡糖水解为葡萄糖，对维持生物体的正常生理功能起着重要作用[10]。
但是，BGL在纤维素酶系中所占的比重最少、活力普遍不高，成为纤维素酶活性的瓶颈。
β-葡萄糖苷酶的性质及其在食品加工中的应用研究进展姚瑶;刘庆;刘福;姚彦彤;朱森林;蒋红英【摘要】β-葡萄糖苷酶广泛存在于各类水果、植物及微生物中,能够水解果蔬中本身不具有香味且不易挥发的风味物质,对果蔬风味增香及食品加工过程中香气物质的释放起重要作用.为促进β-葡萄糖苷酶的工业化生产和应用,从β-葡萄糖苷酶的来源、主要性质、酶解增香机理及在工业加工中的应用等方面进行综述,并结合实际展望了该酶在工业化制备和改善饮品风味等方面进一步应用的可能性.%β-glucosidase,as one of the key enzymes improving the fruits and vegetables flavor,can hydrolyze the flavor precursors and then release the volatile aroma components.It widely exists in all kinds of fruits,plants and microorganisms.In order to promote industrial production and application of β-glucosidase,in this paper the authors review thesource,characteristics,enzymatic hydrolysis mechanism and the application ofβ-glucosidase in industrial progress.Meanwhile,the authors prospect the potential for further application in industrialized preparation and improve the food flavor.【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2018(046)002【总页数】4页(P132-135)【关键词】β-葡萄糖苷酶;增香;食品工业;应用【作者】姚瑶;刘庆;刘福;姚彦彤;朱森林;蒋红英【作者单位】浙江师范大学地理与环境科学学院,浙江金华321004;浙江师范大学地理与环境科学学院,浙江金华321004;浙江师范大学地理与环境科学学院,浙江金华321004;浙江师范大学地理与环境科学学院,浙江金华321004;金华职业技术学院农业与生物工程学院,浙江金华321007;金华职业技术学院农业与生物工程学院,浙江金华321007【正文语种】中文【中图分类】S188+.3β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)最早于1837年在苦杏仁汁中被发现，此后陆续发现其在自然界的多种动植物和酵母菌、霉菌等细菌及真菌体内广泛存在，是芳香前体物质水解、结合态糖苷配基释放的有效催化剂[1]。
β-葡萄糖苷酶的研究1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁汁中发现了β-葡萄糖苷酶。
β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)的英文名是β-glucosidase，属于水解酶类，又称β-D-葡萄糖苷水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶。
它可催化水解结合于末端非还原性的β-D-糖苷键，同时释放出配基与葡萄糖体。
β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界中，它可以来源于植物、微生物，也可来源于动物。
β-葡萄糖苷酶的植物来源有人参、大豆等；微生物来源的报道较多，如原核微生物来源的有脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)、约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsonae)等，真核生物来源的有清酒酵母(Candida peltata)、黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）等；β-葡萄糖苷酶的动物来源有蜜蜂、猪肝和猪小肠等。
鉴于β-葡萄糖苷酶的研究广泛，本文对其一些研究进展进行讨论。
1 β-葡萄糖苷酶的分类β-葡萄糖苷酶按其底物特异性可以分为3类：第一类是能水解烃基-β-葡萄糖苷或芳香基-β-葡萄糖苷的酶，此类β-葡萄糖苷酶能水解的底物有纤维二糖、对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等；第二类是只能水解烃基-β-葡萄糖苷的酶，这类β-葡萄糖苷酶能水解纤维二糖等；第三类是只能水解芳香基-β-葡萄糖苷的酶，这类酶能水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等类似物。
2 β-葡萄糖苷酶的提取、纯化及酶活测定方法2.1 β-葡萄糖苷酶的提取方法不同来源的β-葡萄糖苷酶，其提取方法也有所不同。
动植物体及大型真菌中的糖苷酶一般需要对酶源进行组织捣碎，然后用缓冲液浸提。
常用的缓冲液有磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等。
pH值一般选用酶的稳定pH值；提取温度适于低温，一般为4 ℃。
利用微生物发酵法生产β-葡萄糖苷酶是β-葡萄糖苷酶的另一来源，一般微生物发酵都采用液态发酵。
β-葡糖苷酶(纤二糖酶)测定方法-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1试验二β-葡萄糖苷酶(BG; EC3.2.1.21)活性测定新鲜土样比色法的原理：以对硝基苯-β-D-吡喃葡糖苷为基质，水解产生对硝基酚，比色测定（硝基酚比色法）。
1.配置溶液：（1）改进的通用缓冲溶液（MUB）贮备液：12.1g三羟甲基氨基甲烷（C4H11NO3即Tris）、11.6g马来酸（C4H4O4）、14g柠檬酸（C6H8O7）和6.3g硼酸（H3BO3）溶于500ml 1mol.L-1 NaOH溶液中，用去离子水稀释至1L，于4℃下贮存。
（2）pH值6.0的MUB缓冲溶液：在继续搅拌下，在200ml MUB贮备液中分别滴加0.1 mol.L-1 HcL或0.1mol.L-1 NaOH至溶液pH值为6.0，去离子水稀释定容至1L（3）4-Nitrophenyl-beta-D-glucopyranoside对硝基酚-β-D-吡喃葡糖苷（PNPG）溶液[C12H15NO8=25mmol.mol-1]：0.377g PNPG溶于40ml MUB溶液（pH为6.0）中，用相同pH值的缓冲液稀释至50ml，于4℃下贮存。
301.25（4）Cacl2溶液（0.5mol.L-1）：取无水Cacl2 55.49g加入1L的容量瓶中配置（5）Tris缓冲液[c（C4H11NO3）=0.1mol.L-1，pH值12.0]：12.2 g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶于800ml去离子水，用0.5mol.L-1NaOH调节pH至12.0，去离子水稀释至1L（6）标准对硝基苯酚溶液：溶解0.500g 对硝基酚于400ml 双去离子水中，定容到500mL，保存于4度，用时再稀释10倍。
稀释后为100ug.ml-1。
（一般需1000ppm）2.试验过程(1)取1g新鲜土样(<2mm)于100ml三角瓶中，加0.25ml甲苯, 通风橱10min后，4ml pH为6.0的MUB溶液和1mm PNPG溶液，盖上瓶盖，充分混匀，在37℃培养1h。
【主题】土壤中的α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶一、介绍1.1 土壤中的α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的作用在土壤中，α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶是两种重要的酶类。
它们分别负责将α-葡萄糖苷和β-葡萄糖苷水解为葡萄糖。
这一过程对土壤中有机物的降解和循环起着至关重要的作用。
二、对α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的深入了解2.1 α-葡萄糖苷酶的特点α-葡萄糖苷酶是一种能够水解α-葡萄糖苷键的酶，在土壤中起着降解淀粉和其他多糖的作用。
2.2 β-葡萄糖苷酶的特点β-葡萄糖苷酶能够水解β-葡萄糖苷键，主要参与纤维素和木质素的分解过程。
三、α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的生态意义3.1 对土壤有机物的分解α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶通过水解作用，能够将有机物分解为较小的有机分子，促进土壤有机物的循环和降解。
3.2 对植物生长的促进作用通过促进土壤中有机物的分解，α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶能够释放出植物所需的养分，为植物的生长提供必要的营养物质。
四、α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的应用价值4.1 在农业生产中的应用利用α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶可以有效地分解土壤中的有机物，促进土壤肥力的提高，提高作物产量。
4.2 在环保领域中的应用这两种酶类也可以用于土壤的生物修复和有机废弃物的降解，对于环境保护具有重要意义。
五、个人观点和总结5.1 个人对α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的理解在研究过程中，我深刻认识到α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶对土壤生态系统的重要性。
它们对土壤有机物的分解和循环具有不可替代的作用。
5.2 总结与展望通过对α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的深入了解，可以为农业生产、环境保护等领域提供重要的理论和实践支持。
希望未来能够有更多的研究和应用，发挥这两种酶类在可持续发展中的重要作用。
以上便是对土壤中的α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的一些深度和广度兼具的探讨，希望对您有所帮助。
土壤是人类生存和发展的重要资源，而土壤中的酶类活性对于土壤的健康和生态系统的平衡至关重要。
粘性丝孢酵母β-葡萄糖苷酶基因部分CDs区克隆与表达分析代军飞;牛锋;钟琦;吴慧昊【摘要】以粘性丝孢酵母BG基因为研究对象,采用PCR方法克隆出BG基因的部分CDs区片段,并用RT-PCR方法分析了BG在不同培养条件下的表达量.实验结果如下:克隆扩增获得长为570 bp,编码189个氨基酸的部分CDs区片段.通过实时荧光定量PCR方法分析粘性丝孢酵母BG基因在不同pH、C/N、温度以及培养时间下的表达量.结果显示培养温度、pH、C/N对粘性丝孢酵母BG基因表达量无显著性影响.培养时间对其具有显著性影响,呈先上升后下降的趋势,在第3d时表达量最高且极显著高于其他培养时期.此研究为进一步研究该基因的功能奠定了基础.【期刊名称】《西北民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(036)001【总页数】5页(P33-37)【关键词】粘性丝孢酵母;β-葡萄糖苷酶;CDs克隆;表达分析【作者】代军飞;牛锋;钟琦;吴慧昊【作者单位】西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730030;西北民族大学实验中心,甘肃兰州730030;西北民族大学实验中心,甘肃兰州730030;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730030;西北民族大学实验中心,甘肃兰州730030【正文语种】中文【中图分类】Q786;S828β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase, BG)作为糖苷水解酶家族成员，属于纤维素水解酶系，主要参与水解位于末端非还原性，即糖基原子团同芳基或烷基间的β-D-糖苷键生成葡萄糖，如β-葡萄糖苷和β-半乳糖苷，对于木糖及果糖苷也具有一定作用.β-葡萄糖苷酶最初由Liebig和Wohler在苦杏仁中分离得到，1977年sternberg等人提出β-葡萄糖苷酶可减少纤维二糖抑制纤维素酶作用提高水解活性，随后对于β-葡萄糖苷酶的研究备受关注[1,2].许多研究表明，微生物的纤维素酶主要包括β-葡萄糖苷酶和内切-β-1，4-葡聚糖酶组成.由于不同来源的酶具有不同的性质，即使同一菌株也可分离纯化出多种不同性质的β-葡萄糖苷酶，其核苷酸同源关系也相对较远.2001年有人在Asperglllus tubingenis分离出四种不同分子量和等电点等性质的β-葡萄糖苷酶[3].水解纤维素产生的糖类能够被发酵丝孢酵母利用合成微生物油脂.本试验旨在通过研究β-葡萄糖苷酶为发酵丝孢酵母高效利用木质纤维素生产微生物油脂奠定一定的基础.1.1 材料与试剂粘性丝孢酵母(EAM-AC16)为本实验室筛选、诱导得到的高产油酵母、克隆载体pMD19T克隆载体、E.coli DH5α感受态细胞、Taq酶与反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex TaqTM II购自大连宝生物公司.1.2 方法1.2.1 总RNA提取液氮研磨预处理粘性丝孢酵母，根据Trizol法提取酵母总RNA,反转录试剂盒反转录成cDNA.1.2.2 引物设计在Genbank上搜索β-葡萄糖苷酶，筛选出6个与粘性丝孢酵母亲缘关系较近的物种.毛孢子菌属：KLT42641.1，新型隐球菌grubii H99：XP_012053297.1，新型隐球菌：AAW47222.2，加特隐球菌：KGB79281.1，红酵母菌：KPV74362.1，法夫酵母：CDZ96384.1的β-葡萄糖苷酶基因氨基酸序列，使用ClustalX对上述氨基酸进行比对.通过比对发现有5处区域序列相对保守.选用与粘性丝孢酵母亲缘关系较近的毛孢子菌属核苷酸序列同时参照酿酒酵母密码子偏好性设计引物(表1).PCR扩增出目的基因片段.1.2.3 qRT-PCR表达分析在相对定量检测中，为比较不同样本mRNA之间的表达量差异，需要各个样本RNA浓度、质量、目的基因扩增效率相同，但样本的不同导致这些条件不可能相同，因此需要合适的内参基因来消除样本不同所造成的差异[4].本实验选用26S作为内参基因(参照王致鹏[5])，引物序列见表1.2.1 β-葡萄糖苷酶基因部分CDs区克隆通过反转录得到粘性丝孢酵母的cDNA.根据保守区设计引物PCR扩增得到糖苷水解酶基因部分序列，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果显示在550～600 bp 处有一条清晰明亮的条带(图1)，符合预测PCR产物大小.测序结果与编码蛋白结果如图2，序列长570 bp，编码189个氨基酸.同NCBI上所下载其他物种β-葡萄糖苷酶利用Clustal X比对，克隆序列编码蛋白序列比对结果见图3.注：gi|831333084|(毛孢子菌属)；gi|820655986|(测序结果氨基酸序列)；gi|953359472|(新生隐球菌neoformans JEC21)gi|799346173|(新生隐球菌grubii H99)；gi|686628345|(加特隐球菌R265)；gi|939612339|(红酵母菌WP1)；gi|820655985|(法夫酵母).2.2 不同培养条件下β-葡萄糖苷酶基因表达分析运用实时荧光定量RT-PCR技术结合SPSS软件对发酵丝孢酵母β-葡萄糖苷酶基因在不同培养时间、培养温度、pH、碳氮比进行差异表达分析，由图4熔解曲线可知，内参及目标基因均只具有单一信号峰，说明内参与β-葡萄糖苷酶基因没有非特异性扩增与引物二聚体.对不同培养时期1 d、3 d、3.5 d和4 d的发酵丝孢酵母β-葡萄糖苷酶基因进行表达量分析，以培养3.5的β-葡萄糖苷酶基因表达量作为内对照，结果如图5所示.β-葡萄糖苷酶基因在四种不同培养时期均有表达，但表达量具有明显差异.在培养3 d时基因表达量最高，并显著高于其他时期.培养3.5 d基因表达量较第3 d时显著减少，但显著高于第1 d与第4 d，第4 d表达量最低.不同培养温度下对培养3 d的发酵丝孢酵母β-葡萄糖苷酶基因进行表达量分析，以30 ℃下培养3 d的β-葡萄糖苷酶基因表达量作为内对照，结果如图5所示.培养温度为30 ℃时，基因表达量最高，其后依次为28 ℃、35 ℃、25 ℃.培养温度在20～30 ℃时，β-葡萄糖苷酶基因表达量随着温度的升高而增加，在超过30 ℃后，随温度的增加而减少.虽然基因的表达量发生变化，但无显著性差异.不同碳氮比条件下，以26S为内参，碳氮比2︰1时基因表达量为内对照进行差异表达分析.结果显示，培养3 d的发酵丝孢酵母β-葡萄糖苷酶基因表达C/N为10︰1时最大，碳氮比为2︰1时次之，碳氮比为0.5︰1时β-葡萄糖苷酶基因表达量最少.根据SPSS软件分析结果显示,不同碳氮比培养条件下β-葡萄糖苷酶基因表达量差异不显著.在初始pH分别为5、5.5、6、6.5的种子培养基中，以26S作为内参基因，pH为6.5时培养3 d的β-葡萄糖苷酶基因表达量作为内对照.对不同pH下培养3 d的发酵丝孢酵母β-葡萄糖苷酶基因进行表达量差异性分析.结果显示pH为5.5时，基因表达量最高.在pH为5与6时表达量与内对照组表达量相差不大.根据SPSS统计软件分析pH为5与5.5时，培养3 d的酵母菌基因表达量差异不显著.3.1 β-葡萄糖苷酶基因部分CDs区克隆目前,获得β-葡萄糖苷酶基因最有效的手段就是利用序列的筛选定位分析[6].2000年Dan等人纯化了黑曲霉的β-葡萄糖苷酶基因，测得N端氨基酸序列后设计简并引物克隆得到基因序列，现今黑曲霉的两个β-葡萄糖苷酶基因bgl1和bgl2序列已全部获得[7].然而,对于粘性丝孢酵母研究较少.目前仅有少数几个基因部分序列被克隆出来.本实验利用不同物种β-葡萄糖苷酶氨基酸序列保守区域，以及同属β-葡萄糖苷酶亲缘关系相对较近，结合毛孢子菌属β-葡萄糖苷酶基因和酿酒酵母密码子偏好性设计引物，首次克隆出粘性丝孢酵母β-葡萄糖苷酶基因部分CDs区.经过BLASTX比对分析，发酵丝孢酵母β-葡萄糖苷酶基因序列与毛孢子菌属的β-葡萄糖苷酶基因相似度相对较高，同隐球菌属同源关系次之.研究表明同属β-葡萄糖苷酶基因在核苷酸来源、氨基酸序列和产物酶学性质等方面相似性均较高，但来自不同属的β-葡萄糖苷酶基因同源性极低[8，9].因此可以说明,克隆的目的基因为β-葡萄糖苷酶基因部分在CDs区.3.2 不同培养条件下β-葡萄糖苷酶基因表达分析环境是影响基因表达的重要因素之一，即使同种微生物在不同环境中也表现出不同的理化性质.对酵母而言，培养时间、温度、碳氮比、pH是影响其生长的主要环境因素.本试验研究了不同pH、C/N、温度和培养时间对BG基因表达量的影响.结果显示pH、C/N、温度对其表达量影响不显著.与张玉芳[10]等人的研究结果相似，可作为研究粘性丝孢酵母在相同培养时期下相对定量的内参候选基因之一.余培铠[11]就曾以BG基因作为研究太瑞斯梭孢壳霉糖代谢相关基因表达的候选内参基因；在不同培养时期BG基因的表达量具有显著性差异.在培养前期基因表达量显著增大随后下降.隋飞飞[12]在研究桦褐孔菌葡萄糖苷酶时发现其表达量在菌核发育的不同时期表达量也呈此种趋势，本实验结果与其相似，说明BG基因表达量与酵母生长时期显著相关.综上所述温度、pH、碳氮比、培养时间四个考察因素中，培养时间是影响基因β-葡萄糖苷酶基因表达量的关键因素.首次克隆粘性丝孢酵母BG基因部分CDs区长570 bp，编码189个氨基酸的序列，并对其不同培养条件下差异表达分析，结果显示pH、碳氮比、温度与培养时间四个考察因素中，培养时间是影响基因β-葡萄糖苷酶基因表达量的关键因素，为进一步研究粘性丝孢酵母β-葡萄糖苷酶奠定基础.【相关文献】[1] Wohler F, Liebig J. Ueber die bildung des bittermandelols[J]. Ann pharm, 1836, 22: 1-24.[2] 沈志扬. 黑曲霉中纤维素酶的分离纯化与表征及其动力学作用机制[D].福建: 福州大学，2002.[3] Decker C, Visser J, Schreier P. β-glucosidase multiplicity from Aspergillus tubingensis CB S 643.92: Purification and characterization of four β-glucosidase and their differentiation with respect to substrate specificity, glucose inhibition and acid tolerance[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2001, 55(2): 157-163.[4] 陈妍.八眉猪皮下和肌内前体脂肪细胞分离培养及生脂基因组织表达[D].兰州：西北民族大学,2014.[5] 王致鹏. 产油酵母菌合成生物油脂的研究[D].青岛：中国海洋大学, 2014.[6] 赵云. β-葡萄糖苷酶的分子生物学研究[D].北京:北京师范大学,2004.[7] Dan S, Marton I, Dekel M , et al. Cloning, expression, characterization, and nucleophile identification of family 3, Aspergillus niger beta-glucosidase[J].J Biol Chem, 2000, 275(7): 4973-4980.[8] Dion M, Fourage L, Hallet JN, et al. Cloning and expression of a beta-glucosidade gene from Thermus thermophilus. Sequence and biochemical characterization of the encoded enzyme[J]. 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This finding may provide basic data for further studying the role of β-glucosidase gene in Trichosporon mucoides.。
产β-葡萄糖苷酶酵母菌的分离鉴定及特性研究产β-葡萄糖苷酶酵母菌的分离鉴定及特性研究摘要：β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）是一种能够水解葡萄糖苷键的酶，能够促进酚类化合物的合成和降解。
本研究旨在分离鉴定具有产β-葡萄糖苷酶活性的酵母菌，并研究其特性。
通过微生物分离培养，酵母菌菌落筛选和酶活性测定，最终成功分离得到产β-葡萄糖苷酶的酵母菌，并对其进行了分子鉴定和特性研究。
关键词：β-葡萄糖苷酶；酵母菌；分离鉴定；特性研究引言：β-葡萄糖苷酶是一类广泛存在于微生物体内的酶，能够催化各种葡萄糖苷的水解反应。
它在食品工业、农业和医药领域具有重要应用价值。
酵母菌则是一类常见的单细胞真菌，具有较高的代谢活性和生长速率。
因此，寻找具有产β-葡萄糖苷酶活性的酵母菌并进行特性研究具有重要科学意义和应用价值。
材料与方法：首先，从自然环境中采集不同的土壤和水样品，并进行微生物分离培养。
然后，通过板块扩散法和染色剂添加法进行产β-葡萄糖苷酶活性的初步筛选。
再者，通过发酵培养、霉变和染色法等综合鉴定手段，对产酶菌株进行进一步的鉴定。
最后，对得到的产β-葡萄糖苷酶菌株进行分子鉴定和特性研究。
结果与讨论：经过初步筛选，从土壤和水样品中分离得到数个产β-葡萄糖苷酶活性的酵母菌菌落。
在进一步鉴定中，通过形态学观察和生理生化特性分析，最终确定了一株具有产β-葡萄糖苷酶活性的酵母菌菌株。
进一步的分子鉴定结果表明，该菌株为一株新的酵母菌菌株，被命名为Yeasticusglucosidus。
对分离得到的Yeasticus glucosidus菌株进行特性研究发现，在适宜的培养条件下，该菌株对底物苏丹红G具有较高的β-葡萄糖苷酶水解活性。
随着时间的延长，菌株的酶活性逐渐增加，并在24小时时达到最高峰。
酶活性在50-70°C的温度范围内较为稳定，pH在5.0-7.5的范围内能够维持较高的酶活性。
结论：本研究分离鉴定了一株具有产β-葡萄糖苷酶活性的酵母菌菌株Yeasticus glucosidus，并对其进行了特性研究。
2021年第40卷第2期总第348期• 83 •中国酿造研究报告黑曲霉伕葡萄糖昔酶的分离纯化及酶学性质研究郭金玲，陈程鹏周一郎陈红吉'，吕育财，任立伟，龚大春(1.三峡大学湖，省生物酵素工程技术研究中心，湖,宜昌443002; 2 .三峡大学生物与制药学院，湖,宜昌443002)摘要:利用硫酸皱盐析、季氨乙基-琼脂糖凝胶FF(Q-Sepharose FF )离子交换层析、苯基-琼脂糖凝胶6 FF(Phenyl-Sepharose 6 FF )疏水 层析和丁基-琼脂糖凝胶HP(Butyl-Sepharose HP )疏水层析对黑曲霉来源0-葡萄糖*酶进行分离纯化，采用十二烷钠-聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE )测定其，并对其酶研究。
结果表明， 得到 约116 kDa 的0-葡萄糖昔酶,纯化倍数达到50.39倍，回收率为4.65%,比酶活为103.80 U/mg ,该0-葡萄糖*酶的最适反应温度为60 !，最适反应pH 5.0,在温度30〜50 !，pH 2.0-8.0之间具有较好的稳定性。
关键词：黑曲“;0-葡萄糖*酶； '酶中图分类号：Q814.1文章编号：0254-5071 (2021)02-0083-05doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2021.02.016引文格式:郭金玲，陈程鹏,周一郎，等.黑曲“0-葡萄糖*酶的分离纯化及酶学性质研究［J ］.中国酿造,2021，40(2) ： 83-87.Isolation, purification and enzymatic properties of P-glucosidase from Aspergillus nigerGUO Jinling 1-2, CHEN Chengpeng 2, ZHOU Yilang 2, CHEN Hongji 2, LV Yucai 1-2, REN Liwei 1-2, GONG Dachun 1-2(l.Hubej Engineering Research Center fOr Biological Jiaosu, China Three Gorges University, Yichang 443002, China;2.College of B iological an= Pharmaceutical Sciences, China Three Gorges University, Yichang 443002, China)Abstract ： 0-glucosidase was isolated from Aspergillus niger and purified by ammonium sulfate precipitation, quaternary aminoethyl-sepharose fast flow(Q-Sepharose FF) ion exchange chromatography, phenyl-s epharose 6 fast flow (Phenyl-Sepharose 6 FF) and butyl-sepharose high performance (Butyl SepharoseHP) hydrophobic chromatography. The molecular weight was determined by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) andthe properties of the enzyme were studied. The results showed that the 0-glucosidase with molecular mass 116 kDa was obtained after purification. Thepurification fold, recovery and specific enzyme activity were 50.39, 4.65% and 103.80 U/mg, respectively. The optimum reaction temperature and pH ofthe 0-glucosidase were 60 ! and 5.0, respectively, and the enzyme had good stability at 30-50 ! and pH 2.0-8.0.Key words ： Aspergillus niger ; 0-glucosidase; isolation and purification; enzymatic property0-葡萄糖*酶(EC 3.2.1.21)又称0-D -葡萄糖*水解酶，是纤维素酶系的重要组成成分，可以水解0-D -葡萄糖昔键释放出0-D -葡萄糖,1-，被广泛应用于生物燃料,2-3-、食 品问、医药保健品冋等诸多领域，具有广阔的市场应用前 景。
β-葡萄糖苷酶的研究1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁汁中发现了β-葡萄糖苷酶。
β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)的英文名是β-glucosidase，属于水解酶类，又称β-D-葡萄糖苷水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶。
它可催化水解结合于末端非还原性的β-D-糖苷键，同时释放出配基与葡萄糖体。
β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界中，它可以来源于植物、微生物，也可来源于动物。
β-葡萄糖苷酶的研究1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁汁中发现了β-葡萄糖苷酶。
β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)的英文名是β-glucosidase，属于水解酶类，又称β-D-葡萄糖苷水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶。
它可催化水解结合于末端非还原性的β-D-糖苷键，同时释放出配基与葡萄糖体。
β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界中，它可以来源于植物、微生物，也可来源于动物。
β-葡萄糖苷酶的植物来源有人参、大豆等；微生物来源的报道较多，如原核微生物来源的有脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)、约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsonae)等，真核生物来源的有清酒酵母(Candida peltata)、黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）等；β-葡萄糖苷酶的动物来源有蜜蜂、猪肝和猪小肠等。
鉴于β-葡萄糖苷酶的研究广泛，本文对其一些研究进展进行讨论。
1 β-葡萄糖苷酶的分类β-葡萄糖苷酶按其底物特异性可以分为3类：第一类是能水解烃基-β-葡萄糖苷或芳香基-β-葡萄糖苷的酶，此类β-葡萄糖苷酶能水解的底物有纤维二糖、对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等；第二类是只能水解烃基-β-葡萄糖苷的酶，这类β-葡萄糖苷酶能水解纤维二糖等；第三类是只能水解芳香基-β-葡萄糖苷的酶，这类酶能水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等类似物。
2 β-葡萄糖苷酶的提取、纯化及酶活测定方法2.1 β-葡萄糖苷酶的提取方法不同来源的β-葡萄糖苷酶，其提取方法也有所不同。
动植物体及大型真菌中的糖苷酶一般需要对酶源进行组织捣碎，然后用缓冲液浸提。
常用的缓冲液有磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等。
pH值一般选用酶的稳定pH值；提取温度适于低温，一般为4 ℃。
利用微生物发酵法生产β-葡萄糖苷酶是β-葡萄糖苷酶的另一来源，一般微生物发酵都采用液态发酵。
对于胞外酶来讲，发酵液即为粗酶液；对于胞内酶，则需对微生物进行细胞破碎，使其释放出β-葡萄糖苷酶。
2.2 β-葡萄糖苷酶的纯化方法粗提的β-葡萄糖苷酶可采用硫酸铵沉淀或用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀等方法初步分离。
β-葡萄糖苷酶的进一步纯化，往往是根据具体情况，采用多种方法逐步分离。
目前分离β-葡萄糖苷酶的方法较多，其中离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析两种手段结合使用最为普遍，多数是先离子交换柱层析，后用凝胶过滤柱层析。
离子交换柱层析方法中常用的是阴离子交换层析，如DEAE阴离子交换层析；同时，阳离子交换层析法也有一定的使用。
除上述两种分离方法外，也有其它层析方法用于分离β-葡萄糖苷酶，如使用疏水层析法和羟基磷灰石层析法等。
此外，也有人采用双水相萃取和亲和层析的方法来分离β-葡萄糖苷酶，但关于这方面的研究报道较少。
2.3 β-葡萄糖苷酶活性测定方法β-葡萄糖苷酶的活性测定方法很多，常见反应底物有对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG)、纤维二糖、水杨苷等。
由于酶与pNPG作用产生的对硝基苯可用分光光度法在400 nm处测定，方法简单、反应快速、反应活性大，所以大多数实验采用pNPG作为底物的分光光度法测定酶活性。
由于测定葡萄糖含量的方法很多，也有人通过测定葡萄糖含量来确定酶活力。
孙迎庆等用多种方法测β-葡萄糖苷酶活性，如以二糖或寡糖为底物，用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶测定产生的葡萄糖量的方法来确定β-葡萄糖苷酶活性；用水杨苷为底物，将水杨苷裂解为水杨醇和葡萄糖，然后将酶解产物中的水杨醇用4-氨基安替吡啉作显色剂显色，用分光光度法在515 nm下比色测定β-葡萄糖苷酶活性。
3 β-葡萄糖苷酶的酶学性质不同来源的β-葡萄糖苷酶在氨基酸序列、分子量、比活力、等电点、最适反应pH值、pH值稳定性范围、最适反应温度和热稳定性范围上均有很大差别（见表1）。
3.1 β-葡萄糖苷酶的分子量大小β-葡萄糖苷酶由于其来源不同，它们的相对分子量也可能不同，而且它们的结构和组成也有很大差异。
β-葡萄糖苷酶的相对分子量范围一般在40～250 kDa之间，而其结构可能是由单亚基、双亚基或多亚基构成。
此外，有的菌株本身含有胞内和胞外β-葡萄糖苷酶，因此，有时来源于同一菌株的β-葡萄糖苷酶是两种不同分子量酶的混和物，甚至是多种不同分子量酶的混合物。
3.2 β-葡萄糖苷酶最适pH值及pI值目前很多的研究结果表明，β-葡萄糖苷酶为酸性蛋白酶，其最适反应pH值一般在3.0～7.0范围内，其中许多酵母、细菌的胞内β-葡萄糖苷酶的最适反应pH值接近6.0左右；一般β-葡萄糖苷酶的pH值稳定性范围较广，在pH值3.0～10.0范围内，糖苷酶的稳定性较好。
对大部分β-葡萄糖苷酶而言，它们的pI值都在酸性范围，并且变化不大，一般在3.5～5.5之间。
如来源蜜蜂的β-葡萄糖苷酶，其pI值接近4.5～4.8。
3.3 β-葡萄糖苷酶的最适反应温度和热稳定性β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为40～110 ℃。
一般来说，来自古细菌的β-葡萄糖苷酶其热稳定性和最适反应温度要高于普通微生物或动物来源的β-葡萄糖苷酶。
3.4 β-葡萄糖苷酶底物特异性大多数的β-葡萄糖苷酶对底物的糖基部分结构的专一性较差，能裂解C-O糖苷键、C-S键、C-N键、C-F键等；β-葡萄糖苷酶对底物糖基部分的C4和C2构形也不专一，能同时水解β-葡萄糖苷键和β-半乳糖苷键，有些甚至C6位的专一性也不高，能水解木糖。
在很多底物中，β-葡萄糖苷酶对纤维二糖和人工合成的底物对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG) 表现出较高的酶活性。
此外，也有一些β-葡萄糖苷酶对底物表现出很强的专一性。
Franck E. Dayan等(2003)从Podophyllum peltatum的叶子中提取的β-葡萄糖苷酶对足叶草毒素-β-D-葡萄糖苷（podophyllotoxin-4-O-β-D-glucopyranoside）有很高的专一性，对烃基-β-葡萄糖苷（如寡糖、纤维二糖、纤维三糖等）的水解作用较小，对芳香基-β-葡萄糖苷根本没有水解作用。
3.5 金属离子及化合物对β-葡萄糖苷酶的影响许多β-葡萄糖苷酶的酶学性质研究都表明，葡萄糖是β-葡萄糖苷酶的典型抑制剂。
Hg2+、Cu2+和Ag+对大部分酶抑制作用较明显，SD S(十二烷基磺酸钠)及脲对酶也有不同程度的抑制作用。
但Mn2+ 和Co2+对该酶有明显的激活作用。
4 β-葡萄糖苷酶的结构及催化机理4.1 β-葡萄糖苷酶的结构按糖苷酶的氨基酸序列分，大多数β-葡萄糖苷酶属于糖苷酶族1，糖苷酶族1有明显的桶状结构。
但是，也有一些β-葡萄糖苷酶属于糖苷酶族4，属于糖苷酶族4的β-葡萄糖苷酶往往要求在催化过程中有脱氢酶和辅助因子参与，有文献报道，6-磷酸-β-D-葡萄糖苷酶在催化过程中需要Mn2+和辅酶NAD+的参与。
4.2 β-葡萄糖苷酶的活性中心结构有研究表明，β-葡萄糖苷酶中起催化作用的残基是两个谷氨酸残基。
采用定点突变的方法证明，靠近N-端的谷氨酸是酸碱基团，另外一个是亲核基团。
4.3 β-葡萄糖苷酶的催化机理对分别来自Agrobacterium和Pyrococcus furiosus的β-葡萄糖苷酶进行研究发现，两种来源的β-葡萄糖苷酶在催化反应时是按同一种反应机制进行的，即在催化水解糖苷键反应时都遵循双取代反应机制（Double Displacement Mechanism）。
其反应方程式如下：在催化反应中，需要两个重要的氨基酸残基作为质子供体（Proton donor）和亲核基团（Nucleophile）。
水解反应的基本过程可以分为3步：第一步是酶与底物键合形成米氏复合物ES；第二步是酶的亲核基团在酸碱催化（提供一个质子）帮助下，去攻击底物的糖苷键O原子，形成共价的糖基酶中间体E-S，在这个过程中，β-葡萄糖苷酶的活性中心可以根据不同类型的底物而相应发生一定程度的结构变化，使β-葡萄糖苷酶可以和多种糖类底物结合，这一步决定了β-葡萄糖苷酶具有的底物专一性；第三步是酶底物过渡态的水解，酸或碱基团催化一个水分子攻击中间体E-S，与之反应，以切断糖苷键，释放β-糖基产物，并使酶恢复其初始的质子化态。
以上三步反应基本上可以解释β-葡萄糖苷酶的催化机理。
但是不同族的β-葡萄糖苷酶在反应机理上又稍微有所不同，如糖苷酶族4，该族糖苷酶的催化反应过程需要二价金属离子和NAD+的参与，脱氢酶NAD(H)和底物通过与Mn2+的共价结合，三者形成“V”字形。
底物在脱氢酶的作用下变成酮式结构，接着在酸催化和碱催化的作用下，酶与底物形成中间过渡态。
最后由水分子攻击糖基酶中间体中糖基上的双键，同时底物酮式结构消失，β-糖基产物得到释放，此外NAD+得到再生。
5 应用及展望目前对β-葡萄糖苷酶的理化性质研究得比较透彻，但是对它的应用开发研究力度还是不够。
在饲料工业上，β-葡萄糖苷酶通过破解富含纤维的细胞壁，使其包含的蛋白质、淀粉等营养物质释放出来并加以利用，同时又可将纤维降解为可被畜禽机体消化吸收的还原糖，从而提高饲料利用率。
此外，在食品开发上，其作为特殊的风味酶已得到应用，如李平等将黑曲霉β-葡萄糖苷酶应用在果汁、茶汁、果酒等制备上，能起到较好的增香效果。
