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免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用比较及常见问题分析ppt课件

有机溶剂中的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和p-碘硝基四唑
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用比较及常见问题分析
10
免疫组织化学结果分析
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用比较及常见问题分析
11
免疫组织化学常见问题分析
1.显色过深
➢一抗浓度过高或孵育时间过长，建议降低一抗浓度或减少孵育时间。
3
二抗
IHC
一
反
抗
应原
抗
理
原
示
意
图
辣根过氧化物酶（HRP）
棕褐色络合物
3，3-二氨联苯胺（DAB）显色剂
细胞
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用比较及常见问题分析
4
组织切片/芯片制作
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用比较及常见问题分析
5
组织芯片/切片应用
1. 组织芯片
➢组织芯片（或组织微阵列）是将数十个甚至上千个不同个体的组织标本集成在一张固相载体上，组织芯片中含有蛋白，RNA及 DAN分子，是一种高通量的研究分析工具。研究者一次可有效利用成百上千份正常或疾病状态下的组织标本来研究特定基因及其所表达的蛋白质与疾病之间的关系。
2. AEC显色法
➢产品描述：3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9ethylcarbazole，AEC) 是过氧化物酶 (Peroxidase) 的显色底物，在过氧化物酶的催化下，AEC显色工作液会于反应部位产生溶于酒精的红色沉淀，必须在水溶性介质中复染和封片。本试剂盒适用于辣根过氧化物酶（HRP）系统的免疫组化显色，包括AEC 显色原和与之配套的稀释液。 ➢试剂盒组成： AEC显色原（试剂A） AEC底物缓冲液（试剂B）

《间接免疫荧光实验》课件

的准确性和可靠性。
培训与技能提升
为提高实验结果的可靠性，应进行重复实验，并对结果进行统计分析，以确定结果的稳定性和可重复性。
06
CATALOGUE
实验应用与拓展
在生物学研究中的应用
细胞生物学
用于标记和观察细胞表面的抗原，研究细胞结构和功能。
微生物学
用于检测和鉴别病原体，如细菌、病毒和寄生虫。
03
解读结果的意义
解释实验结果的生物学意义，并将其与实验目的和预期结果进行比较。
结果分析的注意事项
排除非特异性荧光
01
在解释荧光信号时，需排除非特异性荧光的干扰，确保结果的
准确性。
重复实验验证
02
为确保结果的可靠性，需进行重复实验验证，并对结果进行统
计学分析。
结果解读的局限性
03
了解实验结果的局限性，避免过度解读或误导性解读。
免疫学
用于研究免疫系统的抗原和抗体反应，探索免疫疾病的发病机制。
在医学诊断中的应用
感染性疾病诊断
用于检测和鉴别各种感染性疾病的病原体，如病毒、细菌和寄生虫。
自身免疫性疾病诊断
用于检测自身抗体，辅助诊断和治疗自身免疫性疾病。
肿瘤诊断
用于检测肿瘤标志物和癌细胞表面抗原，辅助肿瘤的诊断和分类。
实验方法的改进与拓展
其他试剂设备
其他试剂和设备包括洗涤液、封片剂、显微镜、荧光显微镜
等。
洗涤液用于清洗细胞或组织样本，去除未结合的抗体和荧光
标记物。
封片剂用于固定细胞或组织样本，防止荧光标记物的脱落。
显微镜和荧光显微镜用于观察和检测荧光标记物，提高实验的准确性和可靠性。
03
CATALOGUE

免疫荧光技术概要课件

-
24
2.改良法
（1）试剂配制：
①0.01mol／LpH7.2的PBS配法：NaCl 18g、 Na2HPO4 1.15g、KH2PO4+0.2g溶于2000ml 蒸馏水中，校定pH值至9.0。
②0.5mol／LpH9.0碳酸盐缓冲液配法：取 0.5mol／LNa2CO3（5.3％）10ml加入0.5mol ／L NaHCO3（4.2％）90ml，混合后，校定 pH值至9.0。
与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫
碳氨基键, 结合成为标记荧光免疫球蛋白, 即荧光抗体。1个IgG分子上最多能标记15~20个 FITC分子。
-
15
2. 四甲基异硫氰酸罗达明(tetramethyl rhodamine isothcyanate, TRITC) 是一种紫红色粉末, 较稳定, 是罗达明(Rhodamine) 的衍生物, 易溶于水。最大吸收光谱为 550nm, 最大发射光谱为620nm, 呈橙红色荧光, 与FITC发射的黄绿色荧光对比鲜明。经常用于双标记染色, 使用较多。
⑤荧光素容易溶解, 溶解后不会和其他物质发生化学反应。
⑥荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明, 能清晰判断结果。
-
13
二、可用于标记抗体的荧光素
用于标记抗体和蛋白质的荧光色素到目前为止有以下几种。
-
14
1. 异硫氰酸荧光黄（fluorescien isothiocyanate, FITC）纯品为黄色粉末, 有两种异构体, 易溶于水和乙醇等溶剂, 在溶解状态下呈黄绿色荧光。性质稳定, 低温干燥下可保存多年, 室温下也可保存两年以上。FITC分子质量为390u, 最大吸收光谱为490～495nm, 最大发射光谱为520～ 530nm, 呈现明亮的黄绿色荧光。其中异构体I型荧光效率更高, 与蛋白质结合更稳定。其结构式, 在碱性条件下, FITC的异硫氰酸基在水溶液中

《间接免疫荧光法》课件

06
问题与展望
常见问题及解决方案
荧光染色不均
可能是由于抗体浓度过高或孵育时间不足，解决方案是调整抗体
浓度和孵育时间。
非特异性染色
可能是由于血清内源性荧光物质干扰，解决方案是使用去内源性荧光物质处理。
荧光淬灭
可能是由于荧光物质不稳定，解决方案是使用更稳定的荧光物质或采用避光染色技术。
研究展望
01
02
03
04
医学诊断
用于检测和诊断各种疾病，如自身免疫性疾病、感染性疾病
等。
生物学研究
用于研究细胞表面抗原、细胞内抗原等，以及探索细胞与细
胞之间的相互作用。
农业科研
用于检测植物病毒、细菌和真菌等病原微生物，以及研究植
物抗病性等。
环境监测
用于检测环境中的有害物质和污染物，如重金属、农药等。
优化抗体标记技术
探索更高效、特异性和稳定的抗体标记技术，提高荧光染色的敏感度和特异性。
深入研究荧光物质
研究荧光物质的性质和作用机制，为提高染色效果提供理论支持。
拓展应用领域
将间接免疫荧光法应用于更多疾病的研究和诊断，如肿瘤、感染性疾病等。
建立标准化操作流程
制定标准化的操作流程和质控标准，提高实验结果的可靠性和可比性。
通过使用针对特定抗原的抗体，间接免疫荧光法能够特异地识别和标记目标抗原。
定位准确
间接免疫荧光法能够准确地定位抗原的位置，有助于了解抗原在细胞或组织中的分布情况。
可视化结果
通过荧光显微镜观察，间接免疫荧光法能够直观地展示抗原的存在和分布，便于结果的解
读和分析。
局限性
抗体依赖
间接免疫荧光法依赖于针对特定抗原的抗体，如果抗体不适用或不可获得，该方法可能无法应用。

免疫荧光组化技术PPT课件

详细描述
抗体不结合的原因可能包括抗体选择不当、抗体浓度过低、抗体保存不当或抗原处理不当等。为解决此问题，应确保选择适合的抗体，适当增加抗体浓度，正确保存抗体，并优化抗原处理条件，如采用适当的抗原修复方法。
染色不均问题
总结词
染色不均一是指免疫荧光组化染色过程中出现的非特异性染色问题，影响结果的解释。
详细描述
染色不均的原因可能包括抗体孵育时间过长、抗体浓度过高、组织切片厚度不均或组织中内源性酶的存在等。解决此问题的方法包括控制抗体孵育时间、调整抗体浓度、确保组织切片厚度一致以及通过灭活内源性酶来减少背景染色。
荧光淬灭问题
要点一
总结词
荧光淬灭是指在免疫荧光组化染色过程中，荧光信号的强度减弱或消失的现象。
05
案例分享与结果展示
案例一：肿瘤标志物检测
肿瘤标志物检测
利用免疫荧光组化技术检测肿瘤细胞表面或内部的抗原，以辅助肿瘤诊断和预后评估。
技术流程
固定、切片、抗原修复、阻断、一抗孵育、荧光二抗孵育、洗涤、封片。
结果展示
通过荧光显微镜观察，可以清晰地看到肿瘤细胞表面的抗原表达，为肿瘤诊断提供有力证据。
将抗体与荧光物质结合，以便在显微镜下观察到荧光信号。选择适当的荧光标记，如FITC、Cy3 等，确保信号的稳定性和敏感性。
荧光显微镜观察
荧光激发
使用适当的光源激发荧光标记，以产生荧光信号。
信号采集
使用高灵敏度的相机或CCD设备，捕捉荧光信号并将其转换为数字信号。
图像分析
对采集到的数字信号进行图像处理和分析，提取所需的信息。
适当延长孵育时间，使抗体与抗原充分结合，提高荧光信号的强度。
降低背景噪声

免疫荧光技术课件PPT课件

蛋白质相互作用研究
总结词
免疫荧光技术可用于研究蛋白质之间的相互作用，揭示生命活动的分子机制。
VS
详细描述
利用两种不同颜色的荧光标记抗体分别与两种蛋白质结合，通过荧光共振能量转移等技术，可以观察到两种蛋白质在空间上的接近程度，从而推断它们之间的相互作用。
药物筛选与开发
总结词
免疫荧光技术可用于药物筛选和开发过程中，评估药物对细胞或组织的影响。
多模态成像融合
将免疫荧光技术与光声成像、光学相干成像等其他成像技术融合，实现多模态、多维度的生物分子成像，将有助于更全面地了解生物样本的结构和功能。
临床应用转化
加强免疫荧光技术的临床应用研究，将其应用于疾病的早期诊断、疗效评估和预后判断等领域，提高临床诊疗水平。
THANKS
感谢观看
研究和发展新的抗体和荧光标记技术，提高免疫荧光技术的灵敏度和特异性，降低假阳性结果。
多标记检测
实现多标记免疫荧光技术，能够在同一样品上同时检测多种目标分子，提高实验的信息量。
05
免疫荧光技术的应用实例
细胞内抗原定位
总结词
通过免疫荧光技术，可以精确定位细胞内的抗原，有助于研究细胞结构和功能。
详细描述
抗体
结合方式
荧光物质通过化学键与抗体结合，形成荧光抗体，这种荧光抗体可以特异性地结合抗原，形成抗原-抗体-荧光抗体的复合物。
抗体是免疫系统产生的一种蛋白质，能够特异性地结合抗原，形成抗原-抗体复合物。
荧光信号的激发与检测
激发方式
荧光信号的激发通常采用特定波长的光，如紫外光或蓝紫光，这些光能够激发荧光物质发出可见
光。
检测设备
检测设备通常采用荧光显微镜，能够检测到荧光信号并对其进行

间接免疫荧光讲(共8张PPT)

10
min到数小时，一般30
min已
荧（光+）标荧记光物较对足弱照，：但够P清BS楚。+可荧见光染；标记色物温度多采用室温（25℃左右），高于37℃
2M碳酸盐缓冲液1份配制
4的PBS三缸可浸泡，加每缸强3-5染min色，不效时振果荡。，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎
4的PBS 1500ml）
01mol/L，pH7. 01mol/L，pH7. 4的PBS 1500ml）
荧光标记物对阴照：性PBS对+荧照光标：记物阴性血清+荧光标记物
荧光显微镜、玻片架、滤纸、37℃温箱等。阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
01mol•/L，pH7阳. 性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。阳性对照：阳性血清+荧光标记物
试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释
缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制
搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
01mol/L，pH7.
2M碳酸盐缓冲液1份配制
染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而 2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 n已足够。
4的PBS进行稀释
变化，染色时间可以从 4的PBS 1500ml）
01mol/L，pH7.
如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。

间接免疫荧光法精品PPT课件

[材料]
1、淋巴细胞分层液（葡蔗糖-泛影葡胺，比重为 1.077±0.001g/L） 2、 2％台盼蓝染液 3、 Hank’s液或者RPMI-1640培养基 4、试管、吸管、水平离心机等
[方法] 1、无菌采集静脉血2ml注入盛有2ml Hank’s液（含
100u/ml肝素）的试管中，混匀。
2、吸取淋巴细胞分层液2ml加入离心管中，再将稀释抗凝血液小心沿管壁加至分层液上，应注意保持两者界面清晰。（关键）
First antibody secondary antibodyfluorochrome
原理
PBMC
Target cells
材料
• PBMC • 兔抗人白细胞血清 (Ab1) • FITC-抗兔单克隆抗体 (Ab2)
方法
• 吸管取1滴PBMC液体（约10ul）滴加到标本片黑色圈圈背面中央, 静止5-10分钟，待PBMC干燥。
间接免疫荧光
武汉大学基础医学院免疫学教研室潘勤
外周血单个核细胞分离
----- 葡蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法
[原理] 外周血单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞、
单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同。红细胞和多核细胞比重较大，为1.092左右，而淋巴细胞和单核细胞比重为1.075左右。利用比重为 1.077左右的分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
3、室温2000r／min离心20min。管内可分为四层。
4、用毛细吸管轻轻吸出乳白色的单个核细胞，加入另一支已含有2~5 mlHank’s液的离心管中，混匀。
5、室温下，1500 rpm离心10 min。
6、弃上清，将PBMC用1ml PBS稀释，混匀

九免疫荧光染色观察肿瘤细胞骨架PPT课件

THANK YOU
感谢参与细胞形态维持、运动、分裂等多种生命活动。
通过对肿瘤细胞骨架的研究，可以深入了解肿瘤的生物学特性，为肿瘤的诊断和治疗提供新的思路和方法。
肿瘤细胞骨架的结构和功能异常，与肿瘤的发生、发展和转移密切相关。
02
免疫荧光染色技术
免疫荧光染色原理
将肿瘤细胞接种在适当的培养基中，并维持在适当的温度和湿度条件下。
抗体与细胞结合
将标记的抗体与细胞样本孵育，使抗体与细胞骨架蛋白结合。
观察
使用荧光显微镜观察染色后的细胞，记录观察结果。
实验结果分析
观察结果记录
详细记录每个细胞样本的染色情况，包括荧光染料的分布和强度。
结果分析
根据记录的染色情况，分析细胞骨架蛋白的表达和分布情况，并与正常细胞进行比较。
参考文献2
肿瘤细胞骨架是肿瘤细胞的重要结构之一，与肿瘤的生长、侵袭和转移等生物学行为密切相关。通过免疫荧光染色观察肿瘤细胞骨架，可以深入了解肿瘤细胞的生物学特性，为肿瘤的诊断和治疗提供重要的理论依据和实践指导。
参考文献3
近年来，随着免疫荧光染色技术的发展和完善，其在肿瘤研究中的应用越来越广泛。通过免疫荧光染色观察肿瘤细胞骨架，可以揭示肿瘤细胞的生长、增殖和转移机制，为肿瘤的早期诊断、治疗和预后评估提供有力支持。同时，该技术还可以用于研究肿瘤细胞与其他细胞的相互作用，以及肿瘤细胞对药物的反应等。
结论总结
根据分析结果，总结实验结论，阐述肿瘤细胞骨架的特点和意义。
04
肿瘤细胞骨架与药物作用研究
药物对肿瘤细胞骨架的影响
药物对肿瘤细胞骨架的改变
某些药物能够影响肿瘤细胞的骨架结构，导致细胞形态、运动和黏附能力的改变。

免疫荧光技术和细胞骨架的染色与观察ppt

11. 滤纸上吸干玻片上残余的液体，在干净载玻片上滴一小滴（10 ul)甘油 /PBS封片剂(pH7.5，PBS:甘油=1:9，v/v)封固剂，细胞面朝下盖于封固剂上，在载玻片上贴好，赶走气泡;轻轻在四边点上几小滴指甲油，防止移动
12. 荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜观察（或避光保存待观察）。
DAPI 标示细胞核的基本原理
7. 0.05% Triton X-100-PBS 漂洗5次，每次5 min;
8. 滴加荧光素标记的二抗（已经稀释，请老师帮忙添加）50 ul，同样覆盖修剪过的小封口膜片覆盖，室温孵育60 min（避光黑暗条件下进行）;
9. 0.05% Triton X-100 PBS漂洗4次，每次5 min; 10. 50 ul DAPI（已经稀释，请老师帮忙添加）染色5 min ，PBS漂洗 2 min；
决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。
抗原的概念
1. 抗原是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答，并能与相应的免疫应答产物即抗体和致敏淋巴细胞在体内或体外发生特异性结合的物质，也称为免疫原。
2. 前一种性能称为免疫原性或抗原性，后一种性能称为反应原性或免疫反应性。
抗体
DAPI与溴化乙锭（EB）类似：与DNA双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与 DNA的双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，可用UV（紫外光）的激发波长356nm进行观察。
细胞核内的染色质主要是脱氧核糖核酸（DNA） DNA的双螺旋结构
实验目的与要求
1. 掌握免疫荧光技术的基本原理及其应用； 2. 掌握荧光显微镜的成像基本原理及其应用。
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。

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(3)四乙基罗达明(RB200) 呈褐红色粉末状，溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光谱570nm，最大发射光谱596～600nm，呈明亮橙红色荧光，分子量580，RB200不能直接和蛋白质结合，要先经五氯化磷反应，转化成硫酰氯，再与蛋白质的氨基结合。
(4)1-二甲基氨基-5-硫酰氯 (5)4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪（SITS） (6)得克萨斯红（Texas red） (7)藻红蛋白（PE） (8)花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5）
四、荧光抗体的质量控制主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。 1.特异性染色效价测定 2.非特异性染色测定 3.吸收试验 4.F/P比值的测定方法
五、免疫荧光组织化学染色方法 1.直接法简便、快速，用已知特异性标记荧光的一抗与组织细胞内抗原结合。操作流程：(1)冰冻切片经固定，凉干PBS 洗；石蜡切片脱蜡至水，消化30min，PBS 洗。
发射以辐身方式跃迁时，能量转化成相应波长的光，这个过程叫发射。
荧光跃迁到激发态的电子，大多处于单
重激发态。如果电子直接从单重激发态以辐身方式跃迁到基态，由于单重激发态很不稳定，半衰期很短，发射持续的时间也很短，这种发射光，叫荧光。
二、荧光素能够产生荧光并能作为染料的化合物
称为荧光色素，必须具备：吸收激发光的光能并发射荧光。
操作流程 (1)冰冻切片经固定，凉干后PBS洗；石蜡切片脱蜡至水，PBS洗，酶消化，PBS 洗3×3min。 (2)适当稀释特异性一抗，37℃孵育1h，或室温4h，或4℃过夜，PBS洗3×3min。
(3)荧光标记二抗适当稀释37℃ 30min， PBS洗3×3min。 (4)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min，PBS洗 3×3min。 (5)封片，镜检。
(2)滤片系统是荧光显微镜的重要组成部分，是获得特定波长光，清晰的荧光影像和发挥显微镜最佳性能之关键。了解滤片性能，正确地选择滤片是观察荧光效应的前提和必要条件。
滤片系统包括激发滤片，阻断滤片、隔热滤片，分光镜和其他一些中性滤片。
荧光显微镜的滤片系统
激励法 U V BV
B
IB G
IG
(2)适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上，湿盒内37℃温育1h，PBS洗3×3min。 (3)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min，PBS洗 3×3min，蒸馏水洗2次，除去Nacl结晶。 (4)pH9.0缓冲甘油封片。 (5)镜检
2.间接法是直接法的重要改进，先用标记的已知特异性一抗与组织细胞内抗原结合，随后用间接荧光标记二抗与一抗特异性结合。
免疫荧光组化技术
主要内容
一、荧光的特征二、荧光素三、荧光素标记抗体的方法四、荧光抗体的质量鉴定五、免疫荧光组化染色方法六、荧光显微镜七、非特异性荧光的消除方法
思考题： 1.什么叫荧光？ 2.常用荧光素有哪些特征？ 3.标记荧光抗体有哪二种主要的制备
方法？
4.免疫荧光组化直接法、间接法的原理和主要操作流程？
FITC- N – C – N - 蛋白质 ‖
H SH
(2)操作流程抗体与荧光素比例为50-100:1
抗体的准备：20mg/ml，碳酸盐缓冲液为总量的1/10。
荧光素的准备：用分析天平准确称取 0.01mgFITC/1mg抗体。
结合：边搅拌边将称取的荧光素加入抗体溶液中。
透析过柱 SephadexG50或 G25 保存 4℃ ,-40℃等量甘油分装保存。 2.Chadwick法 3.改良法 4.透析标记法（二）四乙基罗达明标记抗体方法（三）藻红蛋白标记抗体方法
三、荧光素标记抗体的方法 (一)FITC标记抗体的方法 1.Marsshall法 (1)原理：当FITC在碱性溶液中与抗体反应时，主要是抗体分子上的赖氨酸ε -氨基与 FITC上硫碳胺键结合，一个IgG分子中有86 个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个。
荧光素FITC-N＝C ＋ N-蛋白质→ ‖ S HH
分光镜 DM400 DM455 DM455
DM500
DM505 DM570
DM565 DM600
5.观察荧光组化片时应注意哪些问题？ 6.非特异性荧光的消除方法有哪几种？
一、荧光的特征
分子都含有电子，电子在不停地运动着。根据量子理论，运动着的电子可以处于一系列不连续的能量状态中，电子遵守一定的规则，要以从一个能级向另一能级跃迁，并伴随着与能级差相对应的特定能量的吸收或释放。
激发当电子吸收能量跃迁到较高能级，这个过程叫激发。
(6)荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判断结果。
2.荧光素的种类 (1)异硫氰酸荧光黄（FITC）：分子量 390D，最大吸收光谱为490～495nm，最大发射光谱为520～530nm。呈现明亮的黄绿色荧光，分子量389.4。
(2)四甲基异硫氰酸罗达明（TRITC）是罗达明的衍生物，易溶于水，最大吸收光谱为550nm，最大发射光谱为620nm，呈橙红色荧光。
六、荧光显微镜检查方法 1.荧光显微镜荧光显微镜是免疫荧
光组织化学的基本工具。它是由超高压光源，滤片系统(包括激发和压制滤板)，光学系统和摄影系统等主要部件组成，是利用一定波长的光激发标本发射荧光。
(1)光源光源的亮度应根据荧光素的类型选择。小功率汞灯可满足激励一般荧光染料的要求。对于免疫荧光染色需用大功率超高压汞灯。其工作时，两个电极间放电，引起球内水银蒸发，经过5～15min，球内气压升至50～70标准大气压，此时达到最高亮度，成为稳定工作状态。

1、具备用于标记抗体的荧光素条件
(1)应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基团，结合后不易离解，而未结合的色素及其降解产物易排除。
(2)荧光效率高，与蛋白质结合后荧光素质量下降不多。
(3)标记后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响。
(4)结合方法简便而快速，并且较稳定。
(5)荧光素容易溶解，溶解后不会和其他物质发生化学反应。