重组dna技术的三大基本元件

基因工程育种技术基因工程又称重组DNA技术，是指将一种或多种生物的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物(受体)，使受体按人们的愿望表现出新的性状。

基因工程诞生于1972年，在其后几年中由于担心重组生物对环境安全的影响，基因工程技术的发展曾一度受挫。

但随着人们对DNA重组所涉及的载体和受体系统进行有效的安全性改造，以及相应的DNA重组实验室设计和操作规范的建立，再加上重组DNA技术的巨大应用潜力的诱惑，重组DNA技术迅速发展，现在，基因工程已成为生物学实验室的一项常规技术，并广泛应用于医药、农业、食品、环保等许多领域。

第一节基因工程的基本过程和原理基因工程最典型的操作如图6-1所示一般包括以下三个步骤：1．外源DNA的获得与酶切；2．外源DNA与经同样酶切的载体的连接；3．连接产物转化受体细胞及阳性转化子的筛选；分离D NA酶切酶切供体细胞重组转化子图6-1 基因工程的基本过程由图6-1可见，基因工程操作过程需要以下基本材料：外源DNA(基因)、载体、DNA 体外重组用的酶以及宿主细胞。

一、 载体外源基因导入受体细胞一般都要借助于载体，基因工程中最常用的载体是质粒载体。

图6-2所示pUC19就是最常用的载体之一。

图6-2 载体pUC19及其多克隆位点载体一般含有以下几个基本元件：(一) 复制原点载体在宿主细胞中要独立存在则应具有独立复制的能力，复制原点又称为复制起始位点(Origin，简称ori)，控制载体复制。

不同生物的载体复制原点不同，同一种生物的不同载体拷贝数和稳定性有很大差别，这主要决定于载体的复制原点的性质。

图6-2所示的pUC 系列载体的复制原点是pAM1的一个突变体，在合适的大肠杆菌宿主细胞中(如大肠杆菌JM109)其拷贝数可达500。

整合型载体的复制原点被整合位点的同源序列替代。

(二) 筛选标记一般是载体上的一段编码酶的基因，能赋予转化子新的性状，便于转化子的筛选。

载体pUC19的筛选标记是β-内酰氨酶基因（常简写为bla或Amp r），能分解氨苄青霉素中的β-内酰氨环使其失活，因此在含氨苄青霉素的平板上，只有含质粒的转化子能生长而不含质粒的宿主细胞不能生长。

高考生物三轮复习回归教材：选择性必修3之基因工程基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。

第1节重组DNA技术的基本工具一、有关核酸的方向性问题①核苷酸：1’碳连碱基；2’碳（脱氧核糖连无氧；核糖有氧）；3’碳连羟基（-OH）；5’碳连磷酸②一条脱氧核苷酸链（DNA单链）:一端的3’碳上有游离的羟基（-OH），叫3’端；另一端的5’碳上有游离的磷酸基团，叫5’端。

一条核糖核苷酸链（RNA链）也是如此。

③DNA是由两条脱氧核苷酸链，按反向平行的方式构成④DNA聚合酶：总是从引物的3’端连接脱氧核苷酸（沿着模板链的5’-3’方向合成子链）⑤RNA聚合酶：总是从引物的3’端连接核糖核苷酸（沿着模板链的5’-3’方向合成子链）⑥tRNA的3’端结合氨基酸⑦翻译时核糖体的移动方向：沿着mRNA的5’-3’方向移动⑧限制性内切核酸酶识别的序列：沿5’-3’方向读取二、重组DNA技术的基本工具（一）限制性内切核酸酶——“分子手术刀”1、来源：主要是原核生物2、对原核生物的作用：防止外来病原物的侵害,将外源DNA切割保证自身安全3、作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。

结果：切割DNA成为两个DNA片段识别的序列：①沿5’-3’方向读取；②大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数4个、8个。

；③多数为回文序列（因此，切割形成的黏性末端碱基序列：既相同，又互补）黏性末端：当限制酶在它识别序列的中心轴线(图中虚线）两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端；平末端：当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。

（二）DNA连接酶——“分子缝合针”1、E.coli DNA连接酶：①从大肠杆菌中分离得到；②只能连接黏性末端，不能连接平末端③恢复磷酸二酯键2、T4 DNA连接酶：①从T4噬菌体中分离出来；②既能连接黏性末端，又能连接平末端，但连接平末端的效率相对较低；③恢复磷酸二酯键（三）基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”1、最常用的载体：质粒质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。

1、基因工程，是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。

（供体基因、受体细胞、载体是重组DNA技术的三大基本元件。

）2、同尾酶：识别的靶序列也各不相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，这一类限制酶特称为同尾酶。

这两个相同的粘性末端称为配伍未端。

3、同裂酶：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶特称为同裂酶。

同裂酶的切点位置可相同或不同。

4、1酶活性单位（U）：某种限制性核酸内切酶在最适反应条件下，60 min内完全切割1μg λDNA所需的酶活性5、星号（*）活性：如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称星号（*）活性。

6、停滞效应：PCR中后期，随着目的DNA扩展产物逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和，DNA扩增产物的增加减慢，进入相对稳定状态，即为停滞效应，又称平台期。

7、PCR扩增引物：是指与待扩增互补的人工合成的寡核苷酸短片段，其长度通常在15～30个核苷酸之间。

8、linker：是指用化学方法合成的一段由8~12个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段。

9、衔接头：它是一类人工合成的一头具有某种限制酶切的粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。

10、粘性末端：因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称），酶切后形成得具有互补碱基的单链末端结构。

酶切后产生两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。

11、平末端：因酶切位点在两条DNA单链上相同，酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端不易重新连接起来。

12、基因克隆载体：通过不同途径将承载的外源DNA片段（基因）带入受体细胞且能在其中维持的DNA分子。

也称DNA克隆载体。

13、cos位点：λDNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的书暗恋区域称为~~14、受体细胞:又称为宿主细胞或寄主细胞(host cell)等，从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。

第二章《基因工程》复习题一、选择题1. 限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是（D）A 修复自身的遗传缺陷B 促进自身的基因重组C 强化自身的核酸代谢D 提高自身的防御能力2.生物工程的上游技术是（D）A 基因工程及分离工程B 基因工程及发酵工程C 基因工程及细胞工程D 基因工程及蛋白质工程3. 基因工程操作的三大基本元件是:(I 供体 II 受体 III 载体 IV 抗体 V 配体) （A）A. I + II + IIIB. I + III + IVC. II + III + IVD. II + IV + V4. 多聚接头（ Polylinker ）指的是（A）A. 含有多种限制性内切酶识别及切割顺序的人工 DNA 片段B. 含有多种复制起始区的人工 DNA 片段C. 含有多种 SD 顺序的人工 DNA 片段D. 含有多种启动基因的人工 DNA 片段5.下列五个 DNA 片段中含有回文结构的是（D）A. GAAACTGCTTTGACB. GAAACTGGAAACTGC. GAAACTGGTCAAAGD. GAAACTGCAGTTTC6. 若将含有 5' 末端 4 碱基突出的外源 DNA 片段插入到含有 3' 末端 4 碱基突出的载体质粒上，又必须保证连接区域的碱基对数目既不增加也不减少，则需用的工具酶是（D）I T 4 -DNA 聚合酶 II Klenow III T 4 -DNA 连接酶 IV 碱性磷酸单酯酶A. IIIB. I + IIIC. II + IIID. I + II + III7.下列有关连接反应的叙述，错误的是（A）A. 连接反应的最佳温度为 37 ℃B. 连接反应缓冲体系的甘油浓度应低于 10%C. 连接反应缓冲体系的 ATP 浓度不能高于 1mMD. 连接酶通常应过量 2-5 倍8. T 4-DNA 连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段 DNA 片段连接在一起，其底物的关键基团是（D）A. 2' -OH 和 5' –PB. 2' -OH 和 3' -PC. 3' -OH 和 5' –PD. 5' -OH 和 3' -P9. 载体的功能是(I 运送外源基因高效进入受体细胞 II 为外源基因提供复制能力 III 为外源基因提供整合能力) （D）A. IB. I + IIIC. II + IIID. I + II + III10.克隆菌扩增的目的是 (I 增殖外源基因拷贝 II 表达标记基因III 表达外源基因) （D）A. I + IIB. I + IIIC. II + IIID. I + II + III11. 下列各组用于外源基因表达的受体细胞及其特点的对应关系中，错误的是（C）A. 大肠杆菌－繁殖迅速B. 枯草杆菌－分泌机制健全C. 链霉菌－遗传稳定D. 酵母菌－表达产物具有真核性12.考斯质粒（cosmid）是一种（B）A. 天然质粒载体B. 由λ -DNA 的 cos 区与一质粒重组而成的载体C. 具有溶原性质的载体D. 能在受体细胞内复制并包装的载体13. 某一重组 DNA （ 6.2 kb ）的载体部分有两个 SmaI 酶切位点。

基因工程1.基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA 分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。

2.1944年，艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移3.1958年，梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。

随后不久，克里克提出中心法则。

4.1953年，沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。

5.1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。

6.1972年，伯格首先在体外进行了DNA改造的研究，成功地构建了第一个体外重组DNA 分子7.1973年，科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流。

至此，基因工程正式问世。

8.1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼9.1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。

此后，基因工程进入了迅速发展的阶段。

10.1985年，穆里斯等人发明PCR，为获取目的基因提供了有效手段。

11.2013年，华人科学家张锋（1982—）及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术——CRISPR（成簇规律间隔短回文重复）技术编辑了哺乳动物基因组。

该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。

第1节重组DNA技术的基本工具1.切割DNA的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶，这类酶主要是从中分离纯化出来的。

它们能够的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的断开，产生两种形式的末端。

2.DNA连接酶分为两类，一类是，另一类是。

后者既可以缝合双链DNA片段互补的，又可以缝合双链DNA片段的，但连接后者的效率比较低。

1.基因工程：是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。

Or 通过基因操作来定向改变或修饰生物或人类自身，并且有明确应用目的的活动。

Or是在分子水平上进行的遗传操作，指将一种或多种生物体（供体）的基因或基因组提取出来，或者人工合成基因，按照人们的愿望进行严密的设计，经过体外加工重组，转移到另外一种生物体（受体）的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。

2.上游技术：指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）。

3.下游技术：涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。

4.重组DNA技术：是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。

重组DNA技术的三大基本元件：供体、受体、载体。

5.载体：指基因工程中携带外源基因进入受体细胞的“运载工具”，它的本质是DNA复制子。

6.质粒载体：是基因工程中最常用的载体，主要是以细菌质粒的各种元件为基础组建而成的，它必须包含有3种共同的组成部分：复制必需区、选择标记基因和限制性核酸内切酶的酶切位点（克隆位点）。

7.表达质粒载体：指专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体。

8.质粒：是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。

质粒常见于原核细菌和真菌中；绝大多数的质粒是DNA型的。

绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA。

质粒DNA的分子量范围：1 - 200 kb。

9.限制性核酸内切酶：识别双链DNA分子中的特定序列，并切割双链DNA特意位点的酶。

主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌的限制与修饰作用。

10. Star activity现象：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性。