《DNA重组技术的基本工具》(课件)

基础理论和技术发展催生了基因工程
E·coliDNA连接酶
3)1977年DNA合成和测序技术的发明
E·coli DNA连接酶
或T4DNA连接酶
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到识别序列的
碱基上，使限制酶不能将其切开。
这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
——特异性
（1）识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列
（2）在特定的位点切割DNA分子。
例如：大肠杆菌的EcoRⅠ限制酶只能识别GAATTC序
列，并在G和A之间切开。
“分子手术刀”---限制性核酸内切酶(限制酶)
• 限制酶的识别序列：
能被限制性内切酶特 大异多性数识限别制的酶切的割识部别位序都列具由
操作。
实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要 进行人工改造后才能用于基因工程操作。
思考与探究 P7
4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？
迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具 有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还 不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA 的酶。
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到识别序列的
碱基上，使限制酶不能将其切开。
Haemophilus influenzae d )中先
后分离到3种限制酶，则分别命名为:
HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成 少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成

2．重组DNA分子的模拟操作 (1)材料用具：剪刀代表 EcoR Ⅰ ，透明胶条代表 DNA连接酶 。 (2)切割位点 ①分别从两块硬纸板上的一条DNA链上找出 G—A—A—T—T—C 序 列，并选 G—A 之间作切口进行“切割”。 ②再从另一条链上 互补的碱基 之间寻找EcoR Ⅰ相应的切口剪开。 (3)操作结果：若操作正确，不同颜色的黏性末端应能 互补配对 ；否 则，说明操作有误。
种类 来源 特点
E·coli DNA连接酶 _大__肠__杆__菌__
缝合 黏性 末端
T4DNA连接酶 T4噬菌体
缝合黏性 末端和平 末端
作用 缝合双链DNA片段，恢复两个核苷酸之间的_磷__酸__二__酯__键___
二、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 1．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” (1)种类 ①质粒：常存在于原核细胞 和 酵母菌中，是一种分子质量较小
[归纳总结] 1．基因工程的原理是基因重组 自然状态下基因重组有两种情况：减数第一次分裂前期四分体 的非姐妹染色单体间的交叉互换和减数第一次分裂后期非同源染色 体的自由组合。基因工程突破了生殖隔离，实现了不同种生物间的 基因重组。
2．基因工程的理论基础 (1)拼接的基础 ①基本组成单位相同：不同生物的DNA分子都是由脱氧核苷酸 构成的。 ②空间结构相同：不同生物的DNA分子一般都是由两条反向平 行的脱氧核苷酸长链形成的规则的双螺旋结构。 ③碱基配对方式相同：不同生物的DNA分子中两条链之间的碱 基配对方式均是A与T配对，G与C配对。
①黏性末端是限制性核酸内切酶在它识别序列的中心轴线两侧 将DNA的两条链分别切开时形成的，如图所示：
②平末端是限制性核酸内切酶在它识别序列的中心轴线处切开 时形成的，如图所示：

有切割位点
质粒是一种裸 露的、结构简 单独立于细菌 染色体之外、 具有自我复制 能力的双链环 状DNA分子。
能复制并带着 插入的目的基 因一起复制
实际上自然存在的质粒DNA 分子并不完全具备上述条件，都 要进行人工改造后才能用于基因 工程操作。
课堂反馈
1、关于限制酶说法中，正确的是（ C ） A．限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱 基序列 B．EcoRI切割的是G—A之间的氢键 C．限制酶一般不切割自身的DNA分子， 只切割外源DNA D．限制酶只存在于原核生物中
G
DNA聚合酶
DNA
A A T C A A T A G T T A G T T A T C G
具有连接单链DNA的本领,将单 个核苷酸通过磷酸二酯键连接 成一条互补的DNA链
DNA聚合酶
DNA连接酶 只可以连接双链DNA
DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙 “缝合”起来，是把梯子两边扶手的断口连 接起来，这样一个重组的DNA分子才能形成。
• 2、限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切 开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的 DNA片段： • (1) …CTGCA (2) …AC (3) GC… • … G … TG CG… • (4)…G (5) G… (6) …GC • …CTTAA ACGTC… …CG • (7) GT… (8)AATTC… • CA… G… • 你是否能用DNA连接酶将它们连接起来？
生物 选修3 专题1 基因工程 1.1DNA重组技术的基本工具
蓝色妖姬
蓝色素基因 (目的基因)
蓝色妖姬是怎么培 育出来的呢?
导入
表达
三色紫罗兰
玫瑰 (受体细胞)
蓝色妖姬
基因工程的概念

限制性核酸内切切割DNA的“手术刀——限制 性核酸内切酶
识别DNA特定的序列,使 DNA分子链的固定部位 分开。
.
磷酸
二酯键
限制酶：如何识别特定序列
2、将DNA片段再连接起来的“缝合针” ——DNA连接酶
DNA连接酶—能够 将两条DNA连接 起来的酶。
分类： E·coliDNA连接酶：
3，质粒DNA分子上有特殊的遗传标记基因，如 抗四环素、氨苄青霉素等标记基因，供重组 DNA的鉴定和选择。
总结
DNA重组技术 的三件工具： 限制性内切酶、 DNA连接酶、 质粒。
质粒 目的基因 限制性 内切酶
连接酶
重组质粒
连接黏性末端。 T4连接酶：
连接黏性末端和 平末端。
3、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
“分子运输车”——质粒
质粒：裸露、结构简单、 独立于细菌染色体之 外，具有自我复制能 力的双链环状DNA分 子。
质粒的优点？
1、其分子上至少有一个至多个限制酶切割位点， 供外源DNA片段插入其中。
2、携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后， 停留在细胞中进行自我复制，或整合到染色体 DNA上，随染色体DNA进行同步复制。
抗虫棉
抗虫棉的培育就用 到DNA重组技术。
要将抗病基因导入棉花细胞，就需要对 含有抗病基因的DNA分子进行切割、 改造、修饰和拼接。
要实现这一过程需要三种工具：
• 准确切割DNA的 “手术刀”。
• 将DNA片段再连 接起来的“缝合 针”。
• 将体外重组好的 DNA导入受体细 胞的“运输工 具”。

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REPORT
SUMMARY
DNA重组技术简介
1
CATALOG
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2
DATE
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3
ANALYSIS
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4
RESUME
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DNA重组技术的定义
该技术涉及基因克隆、基因编辑和基因合成等领域，是现代生物技术的重要组成部分。 DNA重组技术是指通过人工手段将不同来源的DNA片段进行剪切、拼接和重组，从而改变生物体的遗传物质。
DNA重组技术的发展历程
DNA剪切和拼接技术的出现，实现了对DNA片段的体外操作。 基因克隆技术的成熟，使得大量基因能够被分离和克隆。 随着PCR技术和基因合成技术的发展，DNA重组技术得到了更广泛的应用。 CRISPR-Cas9等基因编辑技术的出现，使得DNA重组技术更加精确和高效。 1970年代 1980年代 1990年代 21世纪
02
基因表达调控
通过基因敲除、敲入等方法，研究基因表达调控的机制和作用。
基因治疗与生物制药
利用基因工程技术将正常基因导入病变细胞，纠正或补偿缺陷基因，达到治疗疾病的目的。
基因治疗
利用基因工程技术生产重组蛋白、抗体、疫苗等生物药物，用于疾病的治疗和预防。
生物制药
通过基因工程技术改造细胞，使其具有特定的功能或治疗作用，用于疾病的治疗和细胞替代治疗。
RESUME
REPORT
CATALOG
DATE
ANALYSIS
SUMMARY
《DNA重组技术的基本工具》课件2
目录
1
DNA重组技术简介
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2
DNA重组技术的基本工具

(3)种类
EcoRⅠ和SmaⅠ限制酶识别序列均为6个核苷酸，其中 EcoRⅠ识别的序列为__G_A_A_T_T_C__，从G__和_A__直接切割，产 生的末端为_黏__性__末__端__;SmaⅠ识别的序列为__C_C_C_G_G_G____,从 __C_和__G_直接切割，产生的末端为__平__末__端___

2．目的：按照人们的愿望进行严格的设计，创造出更符 合人们需要的新的_生__物__类__型__和___生__物__产__品___。
3．设计和施工水平：__D_N__A_分__子____水平，因此，基因工 程又叫做DNA重组技术。
二、DNA重组技术的基本工具
1．限制性核酸内切酶——“分子手术刀”(又称限制酶)。 (1)来源：主要是从__原__核__生__物____中分离纯化出来的。
• （补充）限制酶所识别的序列有什么特点？ • 限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，
都可以找到一条中心轴线,中轴线两侧的双链DNA上 的碱基是反向对称重复排列的。
图1-1 限制酶识别序列的中心轴线
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
1、种类：两类 E·coli DNA连接酶（黏性末端） T4 DNA连接酶 （黏性末端和平末端↓）
酯键断开。形成两种末端 • 4、结果 黏性末端
平末端
限制酶
大肠杆菌(E.coli)的一种限 制酶能识别GAATTC序列， 并在G和A之间切开。
• 黏性末端？
限制酶
被限制酶切开的DNA两 条单链的切口，带有几 个伸出的核苷酸，他们 之间正好互补配对，这 样的切口叫黏性末端。
平末端？
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开 的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口 叫平末端。

目 开
①请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后形成的黏性末端。
关 ②请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末
端。
③在 DNA 连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形
成的黏性末端能否连接起来？为什么？
学习·探究区
解析 一般来说，一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核 苷酸序列，并在特定的切割位点切割 DNA，限制酶Ⅰ切割质粒的 过程为：
时 栏
DNA 上的碱基是反向对称重复排列的。
目
开
关如
以中心线为轴，两侧碱基互补对称；
以 为轴，两侧碱基互补对称。
学习·探究区
③结果：经限制酶切割产生的 DNA 片断末端通常有两种形 式：__黏__性__末__端___和__平__末__端__。 a．_黏__性__末__端___
本
课 是限制性核酸内切酶在识别序列的_中__心__轴__线__两__侧___将 DNA
学习·探究区
第1课时
探究点一 基因工程的概念及工具酶
本 1．基因工程的概念
课 时
“工欲善其事，必先利其器”。我国拥有自主知识产权
栏 目
的转基因抗虫棉，就是通过精心设计，用“分子工具”
开 关
构建成的。培育抗虫棉首先要在体外对含有抗虫基因的
DNA 分子进行“切割”、改造、修饰和“拼接”，然后，
导入棉花体细胞内，并使重组 DNA 在细胞中表达。
学习·探究区
由上述资料填写下表，理解基因工程的概念。
通过体外_D_N__A_重___组___和_转__基__因__等技术，
手段
本
赋予生物以新的_遗__传__特__性___
课 时 栏 目
目的
按照人们的愿望，创造出更符合人们需要 的新的_生__物__类__型__和_生__物__产__品__

随堂达标检测
活页规范训练
基因工程的工具酶
1．限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
(1)来源
主要来自于 原核生物
。
(2)特点
① 识 别 双 链 DN特A 定核分苷酸子 的 某 种
序列；
磷酸二酯键
②使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的
断裂。
(3)作用结果
中心轴线两侧
①黏性末端：在所识别序列的
将
DNA的两条链分别切开时形成中的心末轴端线。
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热点考向示例
随堂达标检测
活页规范训练
基因进入受体细胞的载体—— “分子运输车”
1．载体的种类有 质粒 λ噬、菌体
动植的物衍病生毒物、
等。
2．常用载体——质粒
(1)质粒是一种自裸我露复的制、结构简单双、链独环立状于DN细A 菌拟核DNA之外，
并具有
限制酶切割 能 力 的
分子外。源
(2)质粒DNA分子上有标一记至基多因个
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活页规范训练
A．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割 B．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割 C．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割 D．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割 思维导图：
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SUCCESS
THANK YOU
2024/10/15
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3．载体的种类 (1)细菌质粒，它是细菌拟核DNA以外的小型双链环状DNA，有 的细菌只有一个，有的细菌有多个。 (2)λ噬菌体的衍生物和某些动植物病毒的DNA。 一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人 们根据不同的目的和需求，对某些天然的载体进行人工改造。

单链
将游离的脱氧 核苷酸通过磷 酸二酯键连接 起来
思 考 用DNA连接酶连接两个相同的黏性未端要形成几 个磷酸二酯键？ 2个 用限制酶切一个特定基因要切断几个磷酸二酯键？ 4个 外源基因（如抗虫基因）怎样才能运送到受体细胞 （如棉花细胞）？ 需要“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体
如果载体上有遗传标记基因，就可 通过标记基因的表达来检测。 如果载体对受体细胞有害将怎样？ 将影响受体细胞新陈代谢，进而使 转入的外源基因也可能无法表达。
运载体的种类：质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒
质粒：裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外， 并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。
1.要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几刀？ 可产生几个黏性(平)末端？
要切两刀，产生四个黏性(平)末端。
2.如果把两种来源不同的DNA用同种限制酶来切割，会怎样？
会产生相同的黏性(平)末端
3.如果把具有相同黏性(平)末端的DNA连接起来，又会怎样呢？
得到重组DNA
G C G A A T T C C C
D ）
2、以下说法正确的是（ C ） A.所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B.质粒是基因工程中唯一的运载体
C.载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶
切点，以便与外源基因连接
D.基因控制的性状都能在后代表现出来
3、人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗菌
素抗性基因，该抗性基因的主要作用是（ B ）
•DNA双螺旋结构的确立
•遗传信息传递方式(中心法则)的认定 技术保障 • 限制性核酸内切酶 基因工程工具 • DNA连接酶 • 基因载体(如质粒) 的发现和应用
基因工程培育抗虫棉的简要过程

E·coli DNA连接酶 或T4DNA连接酶
T4 DNA连接酶还可把平末端之间的 缝隙“缝合”起来，但效率较低
将人的生长激素基因注射到小白 鼠受精卵中，得到的“超级小 鼠”。
三、“分子运输车” ——基因进入受体细胞的载 体
⒈载体需要的条件： ⑴有1~多个限制酶切点，供外源基因插入其中
⑵对受体细胞无害 ⑶导入基因能在受体细胞中复制，提供大量的目的 基因
(三)基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车”
• 质粒：
有标记基因 的存在，可 用含氨苄青 霉素的培养 基鉴别。
有切割位点
能复制并带 着插入的目 的基因一起 复制
限制性核酸内切酶
主要是从 原核生物中分离纯化出来 的一种酶。
识别双链DNA 分子的某种 特定的核苷酸序列 ， 并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间 的 磷酸二酯键 断开。即具有特异性
转鱼抗寒基 因的番茄
.抗虫转基因植物
将人的生长激素基因注射到小白 鼠受精卵中，得到的“超级小 鼠”。
• 以上几种生物各自的特定性 状是什么生物技术的成果？
基因工程
定向改造生物的新技术
基因工程的概念
基因工程又叫做基因拼接技术或 DNA重组技术。通俗地说，就是 按照人们的意愿，把一种生物的 某种基因提取出来，加以修饰改 造，然后放到另一种生物的细胞 里，定向地改造生物的遗传性状。
在梯子的扶手上。
“分子缝合针”——DNA连接酶 种类：
⑴ E·coli DNA连接 酶
⑵ T4 DNA连接酶
限制酶切割后有两种不同的结果， 一种产生黏性末端，一种产生平 末端。那么恢复它们的连接时， 所用DNA连接酶是否可以不加选 择？
黏性末端
黏性末端