乙肝病毒基因组中前-x编码基因的界定.docx

乙肝病的基因变异及药物抗性解析乙肝病的进化机制乙肝病（Hepatitis B）是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一种病毒性传染病，该疾病全球范围内广泛存在，被誉为“黄金杀手”。

乙肝病毒的基因变异及相关药物抗性已成为研究的一个热点。

本文通过分析乙肝病毒的基因变异和药物抗性的解析，以及乙肝病毒进化机制的探讨来加深人们对乙肝病的认识。

一、乙肝病毒的基因变异乙肝病毒的基因变异是指乙肝病毒基因组中个别碱基序列的改变。

这种变异性使得乙肝病毒具有一定的适应性和抗药性，对人们的防治乙肝病带来了挑战。

1. 基因型变异乙肝病毒可分为A-H 8个基因型，这些基因型的差异主要表现在S基因和P基因的序列上。

各基因型变异不仅影响了乙肝病的临床表现、病程等特性，还与不同基因型所在地区的感染率和WHO的预防策略有关。

2. 病毒载量变异病毒载量是指病毒在患者血液中的含量，它与乙肝病的患者病情、传播性及预后密切相关。

乙肝病毒的病毒载量主要由HBV DNA水平决定，而乙肝病毒的基因变异可以导致病毒的复制能力和病毒载量的变异。

3. 免疫逃逸变异乙肝病毒为了逃避机体免疫系统的攻击，会发生免疫逃逸的变异，例如在免疫决定性基序列（epitope）上发生变异。

这种变异使得病毒可以避免被机体的免疫系统识别和清除，从而持续感染机体。

二、乙肝病毒的药物抗性1. 乙肝病毒耐药性乙肝病毒的耐药性是指乙肝病毒对治疗药物产生的抗药性。

乙肝病毒的耐药性主要与突变相关，包括碱基突变、氨基酸突变等。

这些突变导致病毒与药物的结合能力下降，从而降低了药物的疗效。

2. 药物选择压力导致的抗药性长期的抗病毒治疗会导致乙肝病毒在人体内产生抗药性。

一方面，药物的选择压力会刺激乙肝病毒基因的变异和突变，从而增加了乙肝病毒对药物的耐药性。

另一方面，抗病毒药物的广泛使用也使得乙肝病毒抗药突变的频率逐渐上升。

三、乙肝病毒的进化机制乙肝病毒的进化机制主要通过基因变异超越了乙肝病毒的进化机制。

乙型肝炎病毒基因分型技术的研究综述乙型肝炎病毒（HBV）是一种主要通过血液和性接触传播的病毒，全球范围内感染乙型肝炎病毒的人数估计高达2亿人，其中大约有数百万人患有慢性乙型肝炎病毒感染。

乙型肝炎病毒感染可以导致急性或慢性肝炎、肝硬化和肝癌等严重疾病。

在乙型肝炎病毒的治疗和防控中，病毒的基因分型技术扮演着重要的角色。

基因分型技术可以帮助研究人员了解乙型肝炎病毒的遗传变异和传播规律，为疫苗和药物研发提供重要信息，同时也可指导临床治疗和预防控制措施。

本文将对乙型肝炎病毒基因分型技术的研究进展和应用进行综述。

一、乙型肝炎病毒基因组结构乙型肝炎病毒是一种双链环状DNA病毒，其基因组包括直径为3.2 kb的DNA，包括四个重叠的ORF，分别被编号为S、C、P和X区域。

其中S区编码HBsAg表面抗原，C区编码内核心抗原（HBcAg）和HBeAg，P区编码聚酶酶和反转录酶，X区编码X蛋白。

病毒的不同基因区在不同的功能和免疫原性上扮演着重要的角色，也是分型技术研究的重点对象。

乙型肝炎病毒的基因分型技术主要包括两种方法：基于序列多态性的分子进化分析和基于生物学特性的免疫学分型。

基于序列多态性的分子进化分析主要应用于基因组的序列设计和测定。

通过测定不同乙型肝炎病毒株的基因序列差异，并在系统发育树上进行演化分析，可以对乙型肝炎病毒的分子流行病学和遗传多样性进行深入研究。

这种方法是发现新的毒株和病毒亚型的重要手段，也是预防控制工作中应用最广泛的技术之一。

基于生物学特性的免疫学分型主要是利用病毒对特定抗体的反应性来进行分型，常用的方法包括免疫结合分析、抗原测定和抗体吸附等。

这种方法主要应用于了解不同基因型病毒的感染特性、免疫抗原性和疫苗效力等方面。

在疫苗的设计和开发过程中，对不同基因分型的病毒进行免疫学分型也是必不可少的工作内容。

乙型肝炎病毒的基因型主要分为A、B、C、D和E五个亚型，其中A-E型病毒在不同地区的分布具有明显的区域性特点。

乙型肝炎病毒基因组序列分析【摘要】目的分析四川省木里县1株乙型肝炎病毒基因组特征。

方法从HBsAg阳性的血清标本11B18中提取病毒DNA，经多聚酶链反应和核苷酸片段测序后，用Mega4软件和Simplot软件做进化树分析和重组分析。

结果S基因和C基因核苷酸序列进化树分析显示11B18分别属于D基因型和C基因型，全基因组核苷酸序列进化树分析显示此株与C1基因亚型参考株在同一进化分枝上；重组分析证实此株为C/D基因型重组株，与D基因型的重组位点大约在nt140～nt740。

结论与我国西部地区的CD1和CD2两种C/D基因型重组株比较，11B18属于C1基因亚型，其与D基因型的重组位点也有差异。

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）属于嗜肝DNA病毒科，其基因组全长约3.2kb，含有4个相互重叠的开放读码框(P基因，PreC/C基因, PreS/S基因和X基因)。

根据基因组或S基因核苷酸序列差异，HVB可分为A～H８个基因型[1～3]；各基因型呈一定的地理区域分布，并与一定的血清亚型相关[4]。

我国HBV以B和C基因型为主，西部地区存在D 基因型及C/D重组基因型[5～8]。

为了解四川省HBV的基因型，对收集到的部分HBsAg 阳性血清标本进行了核苷酸序列分析，在四川省木里县1份血清标本中检测到1株C/D基因型重组HBV，其重组位点与我国西部地区的CD1和CD2基因型重组株不同。

1. 材料与方法1.1 血清来源血清标本编号为11B18,采自木里县1名6岁彝族儿童，血清学检测其HBsAg 和HBeAg均阳性。

1.2 HBV DNA提取使用Maxwell 16 DNA purification Kit（Promega）按厂家说明书提取病毒DNA。

1.3 多聚酶链反应（PCR）和核苷酸测序PCR在PTC-200（MJ）上进行，试剂为PCR Master Mix（Promega），所用引物见表1。

乙型肝炎病毒的突变与耐药性乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒（HBV）引起的肝脏疾病。

虽然乙型肝炎疫苗的广泛使用已经显著降低了乙型肝炎的感染率，但仍然有大量的人口携带乙型肝炎病毒。

乙型肝炎病毒的突变和耐药性是乙型肝炎研究领域的重要课题。

乙型肝炎病毒是一种DNA病毒，其基因组由四个重叠的区域组成，分别是S、C、P和X区。

其中S区编码表面抗原（HBsAg），C区编码核心抗原（HBcAg），P区编码聚合酶（reverse transcriptase），X区编码X蛋白。

乙型肝炎病毒的突变主要发生在S区和P区。

乙型肝炎病毒的突变可以导致病毒的抗原性发生变化，从而影响疫苗的有效性和免疫治疗的效果。

S区的突变可以导致HBsAg的结构改变，使得病毒逃避宿主的免疫攻击。

这些突变通常发生在HBsAg的基因座位上，如a-d、w-r和y-m等。

这些突变不仅可以影响病毒的识别和清除，还可能导致疫苗的失效。

除了影响免疫治疗的效果外，乙型肝炎病毒的突变还可以导致抗病毒药物的耐药性。

目前，乙型肝炎的一线治疗药物主要是核苷（酸）类似物，如拉米夫定和替诺福韦。

然而，长期使用这些药物会导致病毒的突变，从而使得病毒对药物产生耐药性。

这些突变主要发生在P区，可以导致聚合酶的结构和功能改变，从而使药物失去对病毒的抑制作用。

乙型肝炎病毒突变和耐药性的研究对于临床治疗和疫苗设计具有重要意义。

通过对突变位点的监测和分析，可以及时发现病毒的变异情况，并调整治疗方案。

此外，研究人员还可以利用突变位点的信息来设计更有效的疫苗，以提高乙型肝炎的预防效果。

乙型肝炎病毒的突变和耐药性是一个复杂而严峻的问题，需要多学科的合作和持续的研究。

未来的研究应该加强对突变机制的深入了解，开发新的抗病毒药物和疫苗，以更好地控制乙型肝炎的传播和疾病发展。

同时，公众也应该加强对乙型肝炎的认识，积极接种疫苗，遵循医生的治疗建议，以减少乙型肝炎的感染和传播风险。

乙型肝炎病毒的基因突变与治疗乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的肝脏疾病。

虽然已经有预防措施和治疗方法，但乙型肝炎仍然是世界上最常见的慢性感染之一，威胁着全球超过2亿人口的健康。

近年来，科学家们对于乙型肝炎的基因突变及其对治疗的影响进行了深入研究，为制定更有效的治疗方案提供了重要依据。

一、乙型肝炎基因突变概述乙型肝炎是一种DNA嵌合体的RNA-加性反转录逆行转录感染。

其基因组包括四个重叠编码区域：表面抗原(S区)，心净周句核中心(核心编码C区)，P (聚合酶) 编码位点以及E净周判断(Q位点)。

这些编码区域在不同突变中发挥不同作用。

1. 基础分类：根据碳水化合物群体b分布可将基因型分成A-H，从基本组合上说明其遗传变异情况。

2. 特殊突变位点：在HBV基因中有一些特殊的变异位点，如B座的I195M、C座的T1753V、A1762T / G1764A和净库殡锥K130M等。

它们可影响病毒复制能力、感染能力、免疫逃避或发展为肝癌。

二、乙型肝炎基因突变与治疗的关系乙型肝炎基因突变对抗病毒治疗起到了至关重要的作用。

这些突变不仅会导致HBV感染进展为慢性肝炎，还增加了乙型肝炎机构抵抗核苷酸类似物(NAs)药物的风险，并且使得治疗过程更具挑战性。

1. 预测预后：针对特定的突变位点进行分析可以一定程度地预测HVB感染者乙型肝炎是否会发展为慢性和进展为肝脏相关并发症（如肝硬化和肝癌），有助于及早干预以改善预后。

2. 影响治疗效果：HBV基因突变已被证明可以减弱或完全抵消核苷酸类似物对病毒的抑制作用。

例如，A181T和M204I/V突变降低了草甘膦和恩替卡韦对HBV复制的影响。

研究发现这些突变位点可导致耐药性，并且需要调整治疗方案以应对。

三、乙型肝炎的治疗方法目前，乙型肝炎的治疗方法主要包括干预母婴传播、基因与免疫治疗以及药物治疗等方面。

1. 干预母婴传播：乙型肝炎的主要传播途径之一是母婴传播，通过采取相应措施可以有效减少感染率。

World Chin J Digestol 2004 April;12(4):757-762世界华人消化杂志　ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R２００４年版权归世界胃肠病学杂志社PO Box 2345 Beijing 100023, China Fax: +86-10-85381893Email:****************** •述评　COMMENTARY •乙型肝炎病毒新开放读码框架的确定及其意义董 菁，　成 军，　杨 倩董菁，　成军，　杨倩，　中国人民解放军第３０２医院传染病研究所基因治疗研究中心，　全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 １０００３９国家自然科学基金项目，　Ｎｏ．　Ｃ０３０１１４０２，　Ｎｏ．　Ｃ３００７０６８９军队科技攻关项目，　Ｎｏ．　９８Ｄ０６３军队回国留学人员启动基金项目，　Ｎｏ．　９８Ｈ０３８军队科技攻关青年基金项目，　Ｎｏ．　０１Ｑ１３８军队科技攻关面上项目，　Ｎｏ．　０１ＭＢ１３５项目负责人：　成军，　１０００３９，　北京市西四环中路１００号，　中国人民解放军第３０２医院传染病研究所基因治疗研究中心，　全军病毒性肝炎防治研究重点实验室． ｃｊ＠ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ．ｃｏｍ．ｃｎ收稿日期：　２００３－１１－１３ 接受日期：　２００３－１２－１６摘要乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）是一种嗜肝部分双链ＤＮＡ病毒结构基因与调节基因序列之间重叠一直沿用至今．我们在中国流行株ＨＢＶ基因序列的分析中分别发现了２段编码基因序列：　前－前－Ｓ基因长度１３５　ｂｐ编码产物为５６　ａａ．　在前－前－Ｓ基因具有指导报告基因表达的活性．　对１５例慢性乙型肝炎（ＣＨＢ）患者基因型Ｃ型９例Ｂ／Ｃ混合型５例Ｂ型３例Ｂ／Ｃ混合型３例Ｃ型不能编码前－Ｘ区的原因主要是Ａ２６０８Ｂ／Ｃ型都不能编码前－Ｘ区蛋白不仅引起急肝细胞癌（ＨＣＣ）的发生危害严重还没有特效的治疗技术和方法［２－１０］．１９７９年Ｇｅｌｉｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ首次报告了ＨＢＶ　ＤＮＡ的全基因序列并确定４个主要的开放读码框架（ＯＲＦ）之后其结构特点是结构基因与调节基因序列之间重叠一直没有进行系统的研究．　最近我们对于中国ＨＢＶ流行株的全基因序列进行克隆和序列分析改写了ＨＢＶ　ＤＮＡ编码基因序列研究的历史［２１－２４］．１ 乙型肝炎病毒新开放读码框架的（再）发现及其验证１．１　前－前－Ｓ区定义 １９７９年并定位了４个开放读框（ＯＲＦ）．　我国学者于１９８４年报道了大陆ＨＢＶ株（ａｄｒ）的序列［２５］．　目前在美国国立卫生研究院（ＮＩＨ）的核苷酸序列数据库（ＧｅｎＢａｎｋ）中但之后学者对４个ＯＲＦ分区的界定并无异议辅以ＴＡ克隆法将患者体内的ＨＢＶ基因组克隆到质粒载体中又展示了模板多样性获得的数据更精确［２６］． 本研究利用ＬＡ－ＰＣＲ技术扩增了中国ＨＢＶ流行株ＤＮＡ全基因序列在前－Ｓ１区之前发现还存在一个ＯＲＦ命名为前－前－Ｓ区．　初期选择的ＧｅｎＢａｎｋ中６个其他血清型的ＨＢＶ克隆株进行比较前－Ｓ１前－前－Ｓ区较以往认为的大蛋白多出一个小的疏水区．　其中的１９（２１）个疏水氨基酸在前－前－Ｓ区形成了一个小的疏水功能域分别位于第３１９前３个Ｌ是否可形成亮氨酸拉链结构应用ＤＮＡＳＩＳ软件重新确定其ＯＲＦＭｕｋａｉｄｅ　ｅｔ　ａｌ　［２７］将前－前－Ｓ758 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 ２００４年４月１５日 第１２卷 第４期区编码氨基酸序列输入后进行同源性搜索有５个克隆的氨基酸序列与本研究获得的序列有较高的同源性Ｓ４３４９２１９９８年）９３％可以肯定前－前－Ｓ区是实际存在的［２９－３５］． 前－前－Ｓ区ＯＲＦ最早在１９８３年Ｆｕｊｉｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ　［３６］克隆的ａｄｒ亚型的Ｓ基因产物中被提及认为该段多肽是前－Ｓ１多肽内部而不是通常认为的１１９　ａａ或１０８　ａａ．我们认为多种资料的研究结果证明前－前－Ｓ区的存在因而未加以重视［３８－４５］．　我们分析的结果提示具有前－前－Ｓ区的ＨＢＶ克隆株多来自日本和中国这可能是忽视该区域的原因之一．　另外因而早期发现前－前－Ｓ区的学者可能认为一些位点发生变异应当认为前－前－Ｓ区的存在不是一种个别现象在ＨＢＶ前－Ｓ１　ＯＲＦ之前存在有一融合编码的ＯＲＦ将对ＨＢＶ感染的检测表面抗原的表达过程及功能在Ｘ区之前发现还存在一个ＯＲＦ该多肽分子量约为６．２　ｋＤ前－Ｘ区较以往认为的Ｘ蛋白多出一个小的亲水区．　前－Ｘ区编码多肽含有５个Ｃ形成一个亲水功能域发现该区域含有多个Ｓ应用ＤＮＡＳＩＳ软件重新确定其ＯＲＦ其他亚型的克隆表现为ＴＴＧ（Ｘ０４６１５）但在两个起始密码子之间由于发生替换突变将前－Ｘ区编码氨基酸序列输入后进行同源性搜索有１９个克隆中含有的氨基酸序列与本研究获得的序列有较高的同源性另１７个克隆均来自日本学者对肝细胞癌患者体内存在的ＨＢＶ基因组分析所获得的．　我们克隆的氨基酸序列与１８例相关克隆的比较均为ａｄｒ亚型；　第二可以肯定前－Ｘ区是实际存在的． 最早在１９９０年Ｌｏｎｃａｒｅｖｉｃ　ｅｔ　ａｌ　［５６］自ＨＣＣ患者血液中克隆的ａｄｒ亚型的ＨＢＶ基因组中提及了前－Ｘ区Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ自ＨＣＣ患者体内克隆了４０株ＨＢＶ全序列之中的１８株含有前－Ｘ基因结论需要进一步推敲．　我们选择的患者为慢性乙型肝炎患者提示前－Ｘ区的存在可能是一种亚型特异性现象． 总之为前－Ｘ区；　如前－Ｘ多肽的表达得到进一步证实ＨＢＶ的致癌机制的研究均会产生重大影响．　我们早先的研究探讨了Ｘ蛋白不同变异株的反式激活作用的强弱研究的结果提示ＨＢＶ在慢性乙型肝炎患者体内是以准种群形式存在的．　本研究组应用新的序列分析软件结果提示ＨＢＶ存在有新的ＯＲＦ． 目前在美国国立卫生院的ＧｅｎＢａｎｋ中本研究初始以限定条件搜索出符合条件的ＨＢＶ基因组序列共５０株ａｄｗ血清型２２株２２株ａｄｗ血清型的病毒株总一致率为７３．９％基因位点包括替换董菁，　等．　乙型肝炎病毒新开放读码框架的确定及其意义 759 本课题组研究的５０个病毒株中不表达的７个克隆中５个克隆在前－前－Ｓ区起始密码子编码ＡＴＧ处编码ＡＧＧ一致率为８５．２％一致率为７４．８％２５个克隆在前－Ｘ区起始密码子处编码为ＡＴＧ１４株自起始密码子ＡＴＧ至Ｘ基因起始密码子ＡＴＧ之间的区域的１６８　ｎｔ中无终止密码子另１１株克隆发生Ｃ／Ａ２７３３在前－Ｘ区起始密码子处均不表现ＡＴＧ突变形式为Ａ２６０８是被忽视的一段重要序列．　被忽略的主要原因在于：　（１）获得的ＨＢＶ基因组序列的数目尚少在既往的研究中缺少对ａｄｒ血清型ＨＢＶ基因组的深入研究；　（３）Ａ２６０８Ｔ替换突变以及上述２个位点的双替换突变导致前－Ｘ区多肽表达被终止我们应用现有的计算机软件对ＧｅｎＢａｎｋ中存储的５０个ＨＢＶ病毒株全基因组进行了深入分析而前－Ｘ区的编码具有ａｄｒ血清型特异性特点Ｃ／Ｔ和／或Ｃ／Ａ２７３３进一步的分子生物学和抗体流行病学研究正在进行之中［６３－６５］．图１ ＨＢＶ各ＯＲＦ修正图．２ Ｓ区和Ｘ基因启动子的重新定义２．１　前－前－Ｓ启动子 为进一步证实上述的研究结果分析发现该序列富含ＴＡ（６１％）但发现含有ＴＡＴＡ样盒．　以分离克隆株Ｇ３８７－Ａ７为模板将该序列进行克隆瞬时转染ＨｅｐＧ２细胞结果发现我们界定的前－前－Ｓ－基因启动子序列能够激活下游ＣＡＴ的表达但有启动子活性ＳＰ２比较的过程中发现这与ＳＰ２和前－Ｓ１的关系相似．前－前－Ｓ－基因启动子完全包含在ＳＰ１中二者之间是相互重叠还有待于进一步研究聚合酶链反应（ＰＣＲ）法扩增前－Ｘ基因ＯＲＦ起始密码子ＡＴＧ上游２２５　ｂｐ核苷酸序列与ＸＰ序列比较仅有３０　ｂｐ的核苷酸重叠．　以分离克隆株Ｇ３８７－Ａ７为模板将该序列进行克隆瞬时转染ＨｅｐＧ２细胞结果发现确有启动子活性为研究前－Ｘ的存在提供了新的证据（图３）［２４］．３ 前－前－Ｓ基因和前－Ｘ基因的分子流行病学研究３．１　前－前－Ｓ基因的分子流行病学研究 为证实前－前－Ｓ区的存在前－Ｓ区的编码方式探讨基因型与前－前－Ｓ区编码区之间的关系Ｂ型１例均编码前－前－Ｓ区采用ＰＣＲ－ＴＡ克隆－测序方法测定前－Ｘ区的编码方式探讨基因型与前－Ｘ区编码区之间的关系Ａ型１例Ｂ／Ｃ混合型３例；　共测序４５个克隆Ｃ／Ｔ替换突变者１５例Ｔ替换突变者１３例Ｃ／Ｔ替换突变 Ｃ／Ａ２７３３近年来的研究表明ＨＢＶ　Ｃ基因型是中国大陆地区主要流行基因型这同时提示前－Ｘ区的编码具有一定的基因型特异性；　２．　Ｃ型编码前－Ｘ区发生突变而终止前－Ｘ表达的原因主要以Ａ２６０８而Ｂ型我们通过针对文献的再分析和分子生物学方法证实了前－前－Ｓ区和前－Ｘ区的实际存在提出全Ｓ基因和全Ｘ基因在ＨＢＶ基因组中的新位置病毒受体杂志 2001;9:163-1654刘妍，　成军，　董菁，　夏小兵，　李克，　杨继珍．　截短型乙肝病毒表面抗原中蛋白反式激活作用的初步研究．　肝脏 2001;6:8-105刘妍，　董菁，　成军，　夏小兵，　李克，　王琳，　施双双，　段惠娟，　杨继珍．乙肝病毒Ｘ基因在真核细胞中的表达及反式激活ＳＶ４０病毒早期启动子的研究．　解放军医学杂志 2001;26:404-4066成军．　乙型肝炎病毒准种研究的意义．　中华传染病杂志 2001;19: 197-1987Dong J, Cheng J, Wang QH, Liu Y, Wang G, Shi SS, Xia XB, Shao Q , Si CW. 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Virology 2000;267:58-6458洪源，　刘妍，　成军，　杨倩，　王建军．　应用表达谱芯片技术对截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式调节基因的研究．　世界华人消化杂志 2003;11:943-94659成军，　董菁，　刘妍，　王琳，　钟彦伟，　王刚．　准种是乙型肝炎病毒存在的基本方式的研究．　世界华人消化杂志 2003;11:1238-124060刘妍，　成军，　王琳，　王建军，　陆荫英，　李克．　乙型肝炎病毒Ｘ蛋白反式激活基因１的克隆化与序列分析．　世界华人消化杂志 2003;11:1107-111361成军，　董菁，　洪源，　刘妍，　钟彦伟，　王琳，　王刚，　张玲霞，　陈菊梅．　乙型肝炎病毒中国流行株全基因的克隆与序列分析．　世界华人消化杂志 2003;11:1083-109062刘妍，　成军，　王琳，　王建军，　陆荫英，　李克．　羧基末端截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活基因１的克隆化研究．　世界华人消化杂志 2003;11:1102-110663成军，　董菁．　乙型肝炎病毒基因组结构与功能复杂性的新认识．　世界华人消化杂志 2003;11:1073-108064陆荫英，　陈天燕，　成军，　梁耀东，　王琳，　刘妍，　李克，　张健，　邵清，　张玲霞．　乙型肝炎病毒前－Ｓ２蛋白结合蛋白Ｓ２－２９新基因的克隆化研究．　世界华人消化杂志 2003;11:1114-111765陆荫英，　邵清，　成军，　陈天艳，　王琳，　梁耀东，　刘妍，　张健，　李克，　张玲霞．　酵母双杂交技术筛选鉴定乙型肝炎病毒ｅ抗原结合蛋白Ｅ－１９的研究．　世界华人消化杂志 2003;11:1118-112166陆荫英，　陈天艳，　成军，　邵清，　梁耀东，　王琳，　刘妍，　张健，　李克，　张玲霞．　酵母双杂交技术筛选鉴定乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白新基因Ｃ－１２的研究．　世界华人消化杂志 2003;11:1122-112567张忠东，　成军，　钟彦伟，　杨倩，　王业东，　董菁，　杨艳杰，　张树林．　羧肽酶Ｎ调节乙型肝炎病毒核心启动子表达活性的研究．　世界华人消化杂志2003;11:1131-113468陆荫英，　陈天艳，　成军，　梁耀东，　王琳，　刘妍，　张健，　邵清，　李克，　张玲霞．　乙型肝炎病毒Ｘ蛋白与去唾液酸糖蛋白受体２突变体相互作用的研究．　世界华人消化杂志 2003;11:1126-1130762 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 ２００４年４月１５日 第１２卷 第４期ＩＳＳＮ　１００９－３０７９ ＣＮ　１４－１２６０／Ｒ ２００４年版权归世界胃肠病学杂志社• 消息•Ｗｏｒｌｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　稿件来源及论文资助情况随着我国科学研究整体水平的提高研究院所World Journal ofGastroenterology 共收到论文618篇国际论文117篇(18.93%).WJG 2003年1-10期共发表论文521篇食管癌27篇大肠癌39篇幽门螺杆菌20篇临床研究62篇病例报告8篇发表国际论文71篇(13.62%). 作者共2949人国内作者占85.90%. 发表论文分布34个国家和地区巴基斯坦波兰法国荷兰美国日本沙特阿拉伯西班牙匈牙利印度中国台湾各项目基金论文共440篇(84.45%)国家973部分布为26个地区国际论文占6.63%·Ö²¼20个地区基金论文占55%. WJG 2000年共发表论文205篇分布20个地区基金论文占50%. WJG1998年共发表论文183篇基金论文占59.56%.。

World Chin J Digestol 2003 August;11(8):1091-1096世界华人消化杂志　ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R２００３　年版权归世界胃肠病学杂志社P.O.Box 2345 Beijing 100023, China Fax: +86-10-85381893Email:****************** • 病毒性肝炎　VIRAL HEPATITIS •乙型肝炎病毒基因组中前－前－Ｓ区编码基因的界定董 菁，　成 军董菁，成军，　中国人民解放军第３０２医院传染病研究所基因治疗研究中心九十十全军病毒性肝炎防治研究重点实验室．　ｃｊ＠ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ．ｃｏｍ．ｃｎ收稿日期：　２００３－０３－０８ 接受日期：　２００３－０４－１６Study on definition of pre-pre-S region in hepatitis B virus genomeJing Dong, Jun ChengJing Dong, Jun Cheng, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China Supported by the National Natural Science Foundation of China, No.C03011402, No. C30070690; and the Key Science and Technology Brainstorm Project of PLA during the 9th five year plan period, No.98D063; the Start-up Funds for Returned Overseas Students of PLA, No.98H038; and the Science and Technology Brainstorm Funds for Young Scholars of PLA during 10th five year plan period, No. 01Q138; and the Research and Technology Foundation of PLA during 10th five year plan period, No.01MB135.Correspondence to: Dr. Jun Cheng, Gene Therapy Research Center,Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA, Beijing 100039,************************.cnReceived: 2003-03-08 Accepted: 2003-04-16AbstractAIM: To investigate the new open reading frame (ORF) in hepatitis B virus (HBV) genome.METHODS: The whole HBV genome was amplified by long-distance and accurate polymerase chain reaction (LA-PCR)method from the serum of 2 patients with chronic HBV infection, and then the PCR products were ligased into pGEM Teasy vectors. Five clones of HBV genome were sequenced.Sequences of our finding were compared with other HBV genome sequence deposited in GenBank.RESULTS: A new ORF was found in HBV genome, just before Pre-S1 region. It was defined as pre-pre-S region. The pre-pre-S ORF was deduced to be translated with Pre-S1,Pre-S2 and S gene in frame. Its amino acids sequence was as the following: MQLIITSKLGIIYILCGRLVFYIREKLHAV PHFVGHHILGNKSYS. There was a TA-rich region before the ATG of pre-pre-S ORF , indicating a possible promoter for its transcription.CONCLUSION: There is a new ORF pre-pre-S located up-stream to pre-S1 region.Dong J, Cheng J. Study on definition of pre-pre-S region in hepatitis B virus genome. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2003;11(8):1091-1096摘要目的：　乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）基因组内部结构基因与编码基因之间相互重叠本研究通过对于中国ＨＢＶ感染者的流行病毒株的基因序列进行分析比较我们采用的技术是长距离且精确ＰＣＲ（ＬＡ－ＰＣＲ）技术自慢性ＨＢＶ感染患者外周血血清中扩增ＨＢＶ基因组序列与其他ＨＢＶ基因组序列进行比较．结果：　测序结果５株ＨＢＶ全基因组核苷酸序列存在一新的ＯＲＦ并发现该区之前存在一ＴＡ富集区与前－Ｓ１命名为前－前－Ｓ区．董菁，　成军．　乙型肝炎病毒基因组中前－前－Ｓ区编码基因的界定．　世界华人消化杂志 ２００３；１１（８）：１０９１－１０９６/1009-3079/11/1091.asp０ 引言乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）基因组全长３　２００个核苷酸（ｎｔ）左右长度为３　１８２　ｎｔ并在ＨＢＶ基因组中界定了４个开放读码框架（ＯＲＦ）Ｐ并储存于ＧｅｎＢａｎｋ中其生物学功能也不相同［９］前－Ｓ２和Ｓ三个区1092 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 ２００３年８月１５日 第１１卷 第８期一开放读码顺序（ｉｎ　ｆｒａｍｅ）进行翻译的．　我们应用长距离并且精确ＰＣＲ技术（ｌｏｎｇ　ａｎｄ　ａｃｃｕｒａｔｅ　ＰＣＲ寻找新的ＯＲＦ存在的证据ｐＧＥＭ　Ｔｅａｓｙ载体细菌ＪＭ１０９为本室保存酚Ｘ－ｇａｌ等均为国产试剂．１．２　方法１．２．１　血清来源和ＤＮＡ分离 血清来源：　临床诊断为病毒性肝炎编码号分别为Ｇ６８３和Ｇ３７６病毒性肝炎防治方案１）抽提法提取２００　µＬ血清中的ＨＢＶ　ＤＮＡ保存备用．１．２．２　多聚酶链反应（ＰＣＲ）扩增目的片段 参考文献［１１设计引物为Ｐ１：５Ｐ２：　５．ＬＡ－ＰＣＲ参数如下：　９４　５５　共３５个循环再延长１０　ｍｉｎ．１．２．３　克隆目的片段 将ＰＣＲ产物在１０　ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶中电泳玻璃奶法回收ＰＣＲ产物氨苄青霉素和Ｘ－ｇａｌ蓝白斑法筛选阳性菌落由上海博亚公司完成．　测序引物为ｐＧＥＭ　Ｔｅａｓｙ载体自有的Ｔ７测序引物包括：　Ｐ１：　５－ＡＣＧ　ＧＧＡ　ＣＧＴ　ＡＧＡ　ＣＡＡ　ＡＧＧ　ＡＣ－３；　Ｐ４：　５－ＡＡＣ　ＴＡＣ　ＡＣＧ　ＣＡＧ　ＴＧＣ　ＣＴＣＡＴ－３并将推断的ＯＲＦ翻译为氨基酸序列血清型包括：　ａｄｒ［５，８］ａｄｗ４和ａｙｗ［１］．２ 结果２．１　ＨＢＶ基因组核苷酸序列的测定 以２例乙型肝炎患者血清中抽提的ＨＢＶ基因组为模板将患者体内存在的ＨＢＶ基因组克隆到测序载体中．经验证后Ｇ６８３－Ａ２获得的ＨＢＶ基因组核苷酸长度分别为３　２１５３　２１５和３　１２５　ｎｔ．　测序结果存入美国国立卫生院的ＧｅｎＢａｎｋ中ＡＦ３６３９６３Ｇ３７６的２株克隆之间的同源性为９６．６　％界定了４个主要ＯＲＦ的长度包括前－Ｓ１发现在前－Ｓ１区的上游有一未定义的ＯＲＦ前－Ｓ２和Ｓ基因按照同一开放读码顺序（ｉｎ　ｆｒａｍｅ）进行翻译在ＧｅｎＢａｎｋ中选择不同血清型的全基因序列进行比较．选择的ＧｅｎＢａｎｋ序列号为：　Ｄ１２９８０　（ａｄｒ　［５］　）：　３　２１５　ｂｐ；　Ｇ３２９６１６　（ａｄｒ　［８］）：　３　２２１　ｂｐ；Ｘ０４６１５　（ａｙｒ［４］）：　３　２１５　ｂｐ；　Ｘ０２７６３　（ａｄｗ２［３］　）：　３　２２１　ｂｐ；　Ｚ３５７１７（ａｄｗ４）：　３　２２１　ｂｐ和Ｇ３２９６４０　（ａｙｗ［１］　）：　３　１８２　ｂｐ．　结果发现克隆株Ｇ３２９６１６而克隆Ｇ３２９６４０为ＡＴＣ由于点替换突变导致表达终止． 对前－前－Ｓ区上游核苷酸序列分析在前－前－Ｓ区起始密码子ＡＴＧ上游有３段ＴＡ富基序列分别为：　ＡＴＧ上游－８－２２：　ＡＴＴＡＡＡ；　－３９编码４５个氨基酸残基（ａａ）Ｇ６８３的３个克隆在第２０和第３０位均编码缬氨酸（Ｖ）Ｍｕｋａｉｄｅ　ｅｔ　ａｌ　［５］该多肽Ｍｒ　５２００左右５个强碱性ａａ董菁，　等．　乙型肝炎病毒基因组中前－前－Ｓ区编码基因的界定 1093 在美国国立卫生院（ＮＩＨ）的门户网站发现存储的５个克隆有前－前－Ｓ区多肽序列ＣＡＡ２５７４７９３　％（４２／４５）Ｇｅｌｉｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ　［１，２］首次报告了ＨＢＶ基因组的全序列之后进行测序的方法获得的全序列．　我国学者［７，８］于１９８４年报道了大陆ＨＢＶ株（ａｄｒ）的序列．　而后的学者多利用重叠引物ＰＣＲ法扩增ＨＢＶ基因血清型之间的区别．目前在美国国立卫生院的ＧｅｎＢａｎｋ中但之后的学者对４个ＯＲＦ分区的界定并无异议． １９９５年之后以ＴＡ克隆法将患者体内的ＨＢＶ基因组克隆到质粒载体中－５又展示了模板多样性易于操作．本研究展示了同一患者来源的ＨＢＶ基因组不同克隆之间的变异程度９７．５　％５株之间的同源性为９３．６　％符合准种表现．　本研究其他报道［１３－２２］以及其他学者近期的研究结果［２３－２６］证实了１９９０年代初病毒学家［２７，２８］提出的ＨＢＶ准种假说． 本研究在分析所获得的５个克隆的过程中长度１３５　ｂｐ其中３个克隆具有前－前－Ｓ区ＯＲＦ前－Ｓ１前－前－Ｓ区较以往认为的大蛋白多出一个小的疏水区．　如果前－前－Ｓ区被证明是真实存在的可能与蛋白的空间折叠或表面蛋白合成后分泌有关．前－前－Ｓ多肽推断氨基酸序列中含有６个亮氨酸（Ｌ）１５３９位尚需要进一步证实． 我们应用了２种方法来证实前－前－Ｓ区的真实存在．　方法一是在ＧｅｎＢａｎｋ中选择不同血清型的ＨＢＶ基因组全序列结果发现甘人宝ｅｔ　ａｌ　［８］Ｏｋａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ　［４］克隆的ＨＢＶ基因组序列中均存在前－前－Ｓ区ＯＲＦ．　方法二是利用ＮＩＨ网站的ＢＬＡＳＴ软件结果发现已经存入ＧｅｎＢａｎｋ中的序列中分别为：ＢＡＡ３２８４９［２９］　（１９９８年）ＣＡＡ２５７４７［３１］（１９８３年）１９９８年）９３　％可以肯定前－前－Ｓ区是实际存在的作者认为存在一身份不明的ＯＲＦ（ｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ　（ｓ　ｇｅｎｅ））；而Ｍｉｍｍｓ　ｅｔ　ａｌ　［３２］将克隆Ｓ４３４９２进行再分析后他们认为的前－Ｓ１长度为１６４　ａａ以往的研究认为该区的编码并不是一种普遍现象其他学者多认同这一观点欧美学者在最初的研究中获得的样本存在一定的偏差由于目前仍缺乏对ＨＢＶ的大规模分子流行病学资料而不认为这是一种主流现象应当认为前－前－Ｓ区的存在不是一种个别现象而且截短型表面抗原中蛋白［３６，３７］和大蛋白［３８］具有反式激活作用我们的早期研究已经证明了ＨＢＶ截短型表面抗原中蛋白和Ｘ蛋白［４０－４２］具有强大的反式激活作用而Ｇ３７６的２株克隆和甘人宝ｅｔ　ａｌ　［８］Ｏｋａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ　［４］发表的克隆株在这２个位点编码为疏水氨基酸ＡＯＲＦ之前应当存在启动子区域无真核基因所特有的ＴＡＴＡ－ｂｏｘ结构ＡＴＧ上游－８上游－１７上游－３９在距前－前－Ｓ区ＡＴＧ上游－７９为ＡＴＴＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴＡＴ．　这段上游序列中是否具有启动子功能存在前－Ｓ区启动子１（ＳＰ　Ｉ）［４６］存在ＳＰ　ＩＩ［４７］．　ＳＰ　Ｉ和ＳＰ　ＩＩ分别调控既往定义的大蛋白和中／主蛋白的表达［４８－５０］．我们的初步分析认为前－前－Ｓ区之前可能存在一启动子区进一步的工作将验证ＳＰ　ＩＩＩ的存在． 总之我们将其命名为前－前－Ｓ区．　前－前－Ｓ区之前可能有一新的启动子区域（ＳＰ　ＩＩＩ）．如前－前－Ｓ多肽的表达得到进一步证实ＨＢＶ进入肝细胞机制（受体学说）ＨＣＣ产生机制研究均产生重大影响．４ 参考文献1Galibert F, Mandart E, Fitoussi F, Tiollais P, Charnay P. Nucle-otide sequence of the hepatitis B virus genome (subtype ayw)cloned in E. coli . Nature 1979;281:646-6502Charnay P, Mandart E, Hampe A, Fitoussi F, Tiollais P, Galibert F. Localization on the viral genome and nucleotide sequence of the gene coding for the two major polypeptides of the hepatitis B surface antigen (HBsAg). Nucleic Acids Res 1979;7:335-3463Valenzuela P, Quiroga M, Zalvidar J, Gray P, Rutter WJ. The董菁，　等．　乙型肝炎病毒基因组中前－前－Ｓ区编码基因的界定 1095nucleotide sequence of the hepatitis B viral genome and the iden-tification of the major viral genes. In:Fields BN Eds ANIMAL VIRUS GENETICS. New York, Academic Press, 1980:57-70 4Okamoto H, Imai M, Shimozaki M, Hoshi Y, Iizuka H, Gotanda T, Tsuda F, Miyakawa Y, Mayumi M. Nucleotide sequence of a cloned hepatitis B virus genome, subtype ayr:comparison with genomes of the other three subtypes. 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乙型肝炎病毒基因分型技术的研究综述乙型肝炎病毒（HBV）是一种常见的病毒性肝病，全球范围内影响着数百万人的健康。

HBV感染可引起急性和慢性肝炎，甚至导致肝硬化和肝癌等严重疾病。

在全球范围内，人们已经进行了大量关于HBV病毒基因分型的研究，希望通过对不同基因分型的深入了解，揭示其在流行病学、治疗和预防上的重要作用。

本文将就乙型肝炎病毒基因分型技术的研究进行综述，为当前研究进展提供一定的参考和指导。

一、乙型肝炎病毒基因分型的概念及研究意义乙型肝炎病毒由一条双链DNA组成，其基因组长度约为3.2kb。

在HBV基因组中，C基因编码HBcAg，S基因编码HBsAg，P基因编码polymerase，X基因编码HBxAg，其中S基因在HBV病毒分型中扮演着重要的作用。

乙型肝炎病毒基因分型是指根据不同基因序列的变异情况，将HBV分为不同的亚型。

不同的HBV基因分型在地理分布、临床表现、治疗反应和病毒传播方式等方面存在差异，因此对HBV基因分型的研究有着重要的意义。

通过对不同地域、不同族群中的HBV分离毒株进行分析，可以发现不同变异型HBV间的差异性。

HBV基因分型的研究有助于揭示不同感染毒株的临床病理学、免疫学、流行病学以及其在疫苗接种和治疗中的重要性。

对不同分型的深入了解，有助于研究HBV的传播途径和动态，可以为控制及预防HBV的传播提供重要的参考依据。

二、乙型肝炎病毒基因分型技术的方法1.序列分析法序列分析法是HBV基因分型研究中最为常用的技术手段。

它是通过测序技术对多样本中的基因序列进行比对和分析，从而确定不同基因分型的差异。

近年来，随着高通量测序技术的发展，序列分析法在HBV基因分型研究中发挥着越来越大的作用。

2.引物PCR法引物PCR法是一种快速、简便的HBV基因分型技术。

通过设计特异性引物，可以使不同基因型的HBV在PCR扩增中产生不同的条带，从而实现基因分型的目的。

引物PCR法具有操作简便、成本低廉等优点，因此在HBV基因分型研究中得到了广泛应用。