分子生物学本病毒基因组特点及功能

河南农业大学考研专业课《现代分子生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、分析题（5分，每题5分）1. 写出原核表达实验步骤。

答案：原核表达实验步骤概述：（1）按上述步骤提取该组织的RNA，反转录为cDNA。

（2）以cDNA为模板，用上述引物扩增出带酶切位点的A基因片段。

（3）用BamHI和EcoRI分别接合目的片段和载体，连接酶将A 基因和载体连接起来构成重组质粒。

（4）将重组质粒转入感受态的大肠杆菌BL21中，涂布，根据载体所携带的抗性标记筛选出稳定遗传重组表现形式质粒的单克隆。

（5）摇菌、扩大培养，待菌液生存到对数生长期，收集菌体，裂解、收集蛋白质。

（6）将总蛋白制取成溶液通过镍柱，由于A蛋白携带有His标签，可以被吸附在镍柱上，然后加缓冲液将吸附在包覆镍柱上的A蛋白洗脱下来，即可得到A蛋白溶液。

解析：2、判断题（55分，每题5分）1. 当大肠杆菌培养基中的葡萄糖浓度较低时，在培养基中加入乳糖，可以诱导相应的乳糖操纵子启动表达。

（）答案：错误解析：当大肠杆菌培养基的葡萄糖浓度较低时，在培养皿中加入乳糖，不会诱导相应的乳糖不必操纵子启动表达，只有当葡萄糖消耗事实上，才会诱导相应的乳糖操纵子启动表达。

（）2. DNA复制时，前导链上DNA沿5′→3′方向合成，在滞后链上则沿3′→5′方向合成。

（）答案：错误解析：DNA复制以后在前导链上和滞后前导链上DNA均沿5′→3′方向合成。

3. 分子伴侣的功能是帮助蛋白质的降解。

（）[扬州大学2019研]答案：错误解析：4. 运用噬菌体或动物病毒作为载体转化细胞的过程称为转移。

（）答案：错误解析：运用噬菌体或动物病毒作为载体转化细胞的过程称为转染。

5. 乳糖操纵子存在负控诱导系统和正控诱导系统的调控机制。

分子生物学笔记第一章基因的结构第一节基因和基因组一、基因(gene)是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列.一个典型的真核基因包括①编码序列—外显子(exon)②插入外显子之间的非编码序列—内合子(intron)③5'-端和3'-端非翻译区(UTR) ④调控序列(可位于上述三种序列中) 绝大多数真核基因是断裂基因(split-gene) ，外显子不连续。

二、基因组(genome) 一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和，基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。

人基因组3X1 09(30亿bp)，共编码约10万个基因。

每种真核生物的单倍体基因组中的全部DNA量称为C值，与进化的复杂性并不一致(C-value Paradox)。

人类基因组计划( human genome project, HGP )基因组学( genomics ),结构基因组学( structural genomics )和功能基因组学( functional genomics )。

蛋白质组( proteome )和蛋白质组学( proteomics )第二节真核生物基因组一、真核生物基因组的特点：，①真核基因组DNA在细胞核内处于以核小体为基本单位的染色体结构中.②真核基因组中，编码序列只占整个基因组的很小部分(2 —>% ),三、基因家族(gene family) 一组功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因. 可能由某一共同祖先基因(ancestral gene) 经重复(duplication) 和突变产生。

基因家族的特点：①基因家族的成员可以串联排列在一起，形成基因簇(gene cluster)或串联重复基因(tandemly repeated genes)，如rRNA、tRNA和组蛋白的基因；②有些基因家族的成员也可位于不同的染色体上，如珠蛋白基因；③有些成员不产生有功能的基因产物，这种基因称为假基因(Pseudogene) . ¥ a1表示与a1相似的假基因.四、超基因家族(Supergene family ，Superfamily) 由基因家族和单基因组成的大基因家族，结构上有程度不等的同源性，但功能不同．第四节细菌和病毒基因组一、细菌基因组的特点。

泛基因阶段孟德尔的遗传因子阶段摩尔根的基因阶段顺反子阶段操纵子阶段现代基因阶段DNA分子中含有特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。

合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核酸序列（通常是DNA序列）。

一个基因应包含不仅是编码蛋白质肽链或RNA的核酸序列，还包括为保证转录所必需的调控序列、5′非翻译序列、内含子以及3′非翻译序列等所有的核酸序列（蛋白质基因和RNA基因）。

根据其是否具有转录和翻译功能可以把基因分为三类第一类是编码蛋白质的基因，它具有转录和翻译功能，包括编码酶和结构蛋白的结构基因以及编码阻遏蛋白的调节基因第二类是只有转录功能而没有翻译功能的基因，包括tRNA基因和rRNA基因第三类是不转录的基因，它对基因表达起调节控制作用，包括启动基因和操纵基因。

原核生物基因组：染色体基因组（chromosomal genome）染色体外基因组（extrachromosomal genome ）真核生物基因组：染色体基因组（chromosomal genome）染色体外基因组（extrachromosomal genome ）生物体的进化程度与基因组大小之间不完全成比例的现象称为 C value paradox，又称C值悖论）病毒基因组很小，且大小相差较大病毒基因组可以由DNA组成，或由RNA组成多数RNA病毒的基因组是由连续的RNA链组成基因重叠基因组的大部分可编码蛋白质，只有非常小的一部份不编码蛋白质形成多顺反子结构病毒基因组都是单倍体（逆转录病毒除外）噬菌体（细菌病毒）的基因是连续的，而真核细胞病毒的基因是不连续的1981年，美国首先发现获得性免疫缺陷征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS），其病原体是一种能破坏人免疫系统的逆转录病毒1986年，命名为：人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）HIV特异性地侵犯并损耗T细胞而造成机体免疫缺陷HIV如何感染免疫细胞并复制捆绑――当HIV病毒的gp120蛋白捆绑到T-helper细胞的CD4蛋白时，HIV病毒附着到机体的免疫细胞上。

问答题：1 衰老与基因的结构与功能的变化有关,涉及到：1生长停滞；2端粒缩短现象；3DNA损伤的累积与修复能力减退；4基因调控能力减退.2 超螺旋的生物学意义：1超螺旋的DNA比松驰型DNA更紧密,使DNA分子体积变得更小,对其在细胞的包装过程更为有利；2超螺旋能影响双螺旋的解链程序,因而影响DNA分子与其它分子如酶、蛋白质之间的相互作用.3 原核与真核生物学mRNA的区别：原核：1往往是多顺反子的,即每分子mRNA带有几种蛋白质的遗传信息来自几个结构基因.25端无帽子结构,3端一般无多聚A尾巴.3一般没有修饰碱基,即这类mRNA分子链完全不被修饰.真核：15端有帽子结构23端绝大多数均带有多聚腺苷酸尾巴,其长度为20-200个腺苷酸.3分子中可能有修饰碱基,主要有甲基化,4分子中有编码区与非编码区.4 tRNA的共同特征：单链小分子,含73-93个核苷酸.2含有很多稀有碱基或修饰碱基.35端总是磷酸化,5末端核苷酸往往是pG.43端是CPCPAOH序列.5分子中约半数的碱基通过链内碱基配对互相结合,开成双螺旋,从而构成其二级结构,开头类似三叶草.6三级结构是倒L型.5 核酶分类：1异体催化的剪切型,如RNaseP；2自体催化的剪切型,如植物类病毒等；3内含子的自我剪接型,如四膜虫大核26SrRNA前体.6 hnRNA变成有活性的成熟的mRNA的加工过程：15端加帽；23端加尾3内含子的切除和外显子的拼接；4分子内部的甲基化修饰作用,5核苷酸序列的编辑作用.7 反义RNA及其功能：碱基序列正好与有意义mRNA互补的RNA称为反意义或反义RNA,又称调节RNA,这类RNA是单链RNA,可与mRNA配对结合形成双链,最终抑制mRNA作为模板进行翻译.这是其主要调控功能,还可作为DNA复制的抑制因子,与引物RNA互补结合抑制DNA的复制,以及在转录水平上与mRNA5末端互补,阻止RNA合成转录.8 病毒基因组分型：1双链DNA2单链正股DNA3双链RNA4单链负股RNA5单链正股RNA9 病毒基因组结构与功能的特点：1不同病毒基因组大小相差较大；2不同病毒的基因组可以是不同结构的核酸.3病毒基因组有连续的也有不连续的；4病毒基因组的编码序列大于90%；5单倍体基因组,6基因有连续的和间断的,7相关基因丛集；8基因重叠9病毒基因组含有不规则结构基因,主要类型有：a几个结构基因的编码区无间隔；bmRNA没有5端的帽结构；c结构基因本身没有翻译起始序列.10 原核生物基因组的结构的功能特点：1基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成.2基因组中只有1个复制起点.3具有操纵子结构.4编码顺序一般不会重叠.5基因是连续的,无内含子,因此转录后不需要剪切.6编码区在基因组中所占的比例约占50%远远大于真核基因组,但又远远小于病毒基因组.7基因组中重复序列很少8具有编码同工酶的基因.9细菌基因组中存在着可移动的DNA序列,包括插入序列和转座子.10在DNA分子中具有多种功能的识别区域.11真核生物基因组结构与功能的特点：1每一种真核生物都有一定的染色体数目,除了配子为单倍体外,体细胞一般为双倍体.2真核基因组远远大于原核生物的基因组,结构复杂,基因数庞大.3都由一个结构基因与相关的调控区组成,转录产物为单顺反子.4含有大量重复顺序.5基因组内非编码的顺序占90%以上.6真核基因是断裂基因,7功能相关的基因构成各种基因家族,它们可串联在一起,亦可相距很远,但即使串联在一起的成簇的基因也是分别转录的.8真核生物基因组中也存在一些可移动的遗传因素,这些DNA顺序并无明显生物学功能,似乎为自己的目的而组织,故有自私DNA之称.12 根据同源性程度,主要分五种类型：1核酸序列相同,实际上是多拷贝基因；2核酸序列高度同源,如人类生长激素基因家族；3编码产物具有同源功能区；4编码产物具有小段保守基序；5基因超家族.13 DNA复制的基本过程：1DNA双链解开；2RNA引物的合成；3DNA链的延长；4切除引物、填补缺口、连接相邻DNA片段；5切除和修复错配碱基.14 DＮＡ的损伤方式：１转换：由一种嘧啶变成另一种嘧啶,或种嘌呤变成另一种嘌呤；２颠换：嘧呤与嘌呤互换.转换和颠换只引起ＤＮＡ局部的改变,而ＤＮＡ其它部分的结构不受影响,故称为点突变.３丢失或插入一个或一段核苷酸,可能使下游ＤＮＡ的编码发生改变,此称为移码突变４链内或链间发生共价连结.１５ＤＮＡ损伤的修复：１光修复２切除修复３重组修复４ＳＯＳ修复１６切除修复的机制：通过一种特殊的内切核酸酶将ＤＮＡ分子中的损伤部分切除,同时以另一条完整的ＤＮＡ链为模板,由ＤＮＡ聚合酶Ｉ催化填补被切除部分的空隙,再由ＤＮＡ连接酶封口,使ＤＮＡ恢复正常的结构.１７大肠杆菌的一种需糖基化酶的切除修复过程：１ＤＮＡ糖基化酶识别受损的或错误的碱基,水解糖苷键,释出游离碱基,在ＤＮＡ单链上形成无嘌呤或嘧啶的空位,称为ＡＰ部位；２特异的ＡＰ内切核酸酶在ＡＰ部位切开磷酸二酯键,再由外切核酸酶切下ＡＰ部位的核苷酸；３ＤＮＡ聚合酶Ｉ修补缺口；４ＤＮＡ连接酶封口,完成修复过程.１８逆转录酶功能：１具有ＲＮＡ指导的ＤＮＡ聚合酶活性,能和其它ＤＮＡ聚合酶一样沿５－３方向合成ＤＮＡ,并需要引物提供３－ＯＨ；２具有ＲＮＡ酶Ｈ活性,能特异性水解ＲＮＡ－ＤＮＡ杂交体上的ＲＮＡ；３具有ＤＮＡ指导的ＤＮＡ聚合酶活性,以逆转录合成的单链ＤＮＡ为模板合成互补ＤＮＡ链.１９遗传密码的特点：１起始密码子和终止密码子；２方向性：５－３；３连续性４简并性；５通用性６摆动性.２０常见的摆动现象１反密码子的第一位常出现稀有碱基次黄嘌呤,它可以与密码子的第三位的Ａ、Ｃ或Ｕ配对；２反密码子中的Ｕ可以与密码子中的Ａ或Ｇ配对；３反密码子中的Ｃ可以与密码子中的C、G或U配对.21 核糖体在蛋白质生物合成中的作用：1容纳mRNA的通道,2能够结合起始因子,延长因子及终止因子等参与蛋白质生物合成的因子；3具有结合氨酰-tRNA的部位A位或P位；4具有转达肽酶活性,催化肽键形成；5大亚基上具有延长因子依赖的GTP酶活性,它可能为肽提供能量.22 严谨反应机制：在氨基酸缺乏时,游离核糖体与空载的tRNA增加,在ATP 存在下,产生pppGpp鸟苷-5-磷酸和ppGpp鸟苷-4-磷酸.后者与RNA聚合酶形成ppGpp-RNA聚合酶复合物,进而使RNA聚合酶构象改变,活性降低,rRNA和rRNA合成减少或停止.22 葡萄糖效应及机制：细菌通常优先以葡萄糖作为能源,当培养环境中有葡萄糖时,即使加入乳糖、阿拉伯糖等其它糖,细菌也不利用这些糖,不产生代谢这些糖的酶,直到葡萄糖消耗完毕,代谢其它糖的酶才会根据相应的糖是否存在而被诱导产生,这种现象称为——这是由于葡萄糖代谢产物能抑制细胞腺苷酸环化酶和激活磷酸二酯酶的活性,结果使细胞人cAMP水平降低.当葡萄糖耗尽时,细胞内cAMP水平升高,即可通过CAP调控其它操纵子的表达.23真核生物基因表达在DNA水平的调控方式：1染色质丢失2基因扩增3基因重排4DNA甲基化5染色质结构对基因表达的调控作用.24 反式因子的主要特点：1一般具有三个功能结构域：DNA识别结合域、转录活性域、结合其它蛋白的结合域.这些功能区含有几十到几百个氨基酸残基2能识别并结合上游调控区中的顺式作用元件.3对基因表达有正性和负性调控作用,即渡海和阻遏基因的表达.25反式作用因子的激活方式及作用方式：激活方式1表达式调节；2共价修饰；3配体结合4蛋白质与蛋白质相互作用.作用方式1成环2扭曲3滑动4Oozing.26 mRNA的选择剪接方式：1外显子选择2内含子选择3互斥外显子4内部剪接位点.27 细胞通讯方式：1细胞间隙连接2膜表面分子接触通讯3化学信号通讯.28 受体发挥其识别和信号转换作用时特点：1高度特异性2高亲和力3可饱合性4可逆性.29MAPK作为细胞内的的关键信号转导分子,如何发挥作用：MAPK由其上游分子MAPKK和MAPKKK通过逐级磷酸化反应而激活.细胞受到生长因子或其它因素刺激后,MAPKK可将AMPK的一个Thr磷酸化,从而使MAPK转变为有活性状态.具体表现为各自的逐级磷酸化,MAPK被激活以后,可转移至细胞核内.在核内,它可使一些转录因子发生磷酸化,从而改变细胞内基因表达的状态.另外,它也可以使一些其它的酶发生磷酸化使之活性发生改变.30 细胞转导信号的基本路线和方式可以表示为：小分子信使浓度或分布变化外源信号—受体—大分子信使化学修饰效应分子构象变化—细胞应答反应蛋白质相互作用31G蛋白偶联受体的信号传递的基本过程包括：1配体与受体结合；2受体激活G蛋白3G蛋白激活或抑抑细胞中的效应分子；4效应分子改变细胞内小分子信使的含量与分布；5细胞内小分子信使作用于相应的靶分子,使之构象改变,从而改变细胞的代谢过程及基因表达等功能.32 G蛋白的循环或活化过程：当物理或化学信号刺激受体时,受体活化,与G蛋白结合并使之发生构象改变.A亚基与GDP的亲和力下降,结合的GDP为GTP所取代.A亚基结合了GTP 后即与BR亚基发生解离,成为活化状态的A亚基.活化了的A亚基此时可以作用于下游的各种效应分子.这种活化状态将一直持续到GTP被A亚基自身具有的GTP酶水解为GDP.33 小分子细胞内信使一般具有的三个特点：1不位于能量代谢途径的中心；2在细胞中的浓度或分布可以迅速地改变；3作为变构效应剂作用于相应的靶分子,已知的靶分子主要为各种蛋白激酶.34 表皮生长因子受体EGFR介导的信号转导途径EGFR——Ras——MAPK1受体二聚体的形成及其磷酸化；2募集接头蛋白Grb2：3调控分子SOS 的活化4低分子量G蛋白Ras的活化；5MAPK的级联激活；6转录因子的磷酸化及其转录调控作用.35 r——干扰素受体介导的细胞转导途径：r-干扰素与受体结合以后.也可以导致受体二聚体化,二聚体化的体可以激活JAL-STAT系统,后者将干扰素刺激信号传入核内.JAK为一种存在于胞浆中的蛋白酪氨酸激酶,它活化后可使干扰素受体磷酸化.STAT可以通过其SH2结构域识别磷酸化的受体并与之结合,然后STAT分子亦发生酪氨酸的磷酸化,酪氨酸磷酸化的STAT形成二聚体并进入胞核.二聚体STAT分子作为有活性的转录因子,影响相关基因的表达,进而改变靶细胞的增殖与分化.36 Klenow片段的用途：1补齐双链DNA的3末端；2通过补齐3端使3末端标记；3在cDNA克隆中,第二股链的合成.4DNA序列分析.37 几种常见修饰酶：1DNA聚合酶I：这个酶除有聚合酶活性外,尚有3-5及5-3核酸外切酶活性.由于它具有5-3核酸外切酶活性,当用缺口平移法标记DNA探针时,常用DNA聚合酶I.2逆转录酶：逆转录酶以RNA为模板合成DAN,合成时需要4种脱氧核苷酸及引物,合成方向为5-3延伸,无3-5外切酶活性.广泛用于mRNA为模板合成cDNA,构建cDNA文库.3T4DNA连接酶：催化双链DNA一端3-OH与另一双链DNA的5端磷酸根形成3、5-磷酸二酯键,使具有相同粘性末端或平端的DNA末端连接起来.4碱性磷酸酶：去除DNA或RNA 5 端的磷酸根,制备载体时,用碱性磷酸酶处理后,可防止载体自身连接,提高重组效率.5末端脱氧核苷酰转移酶：TdT：将脱氧核苷酸加到DNA的3-OH上,主要用于探针标记；或者在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾,以便于进行连接.6TaqDNA聚合酶和其它耐热DNA聚合酶.38 作为克隆载体的质粒具备以下特点：1分子量相对较小,能在细菌内稳定存在,有较高的拷贝数.2具有一个以上的遗传标志,便于对宿主细胞进行选择,3具有多个限制酶的单一切点,称为多克隆位点MCS.39 粘性质粒的特点：1含有质粒的抗药性标记2带有入噬菌体的粘性末端cos区；3具有一个或多个限制酶的酶切位点；4其本身分子量小,容纳40kb 左右的DNA片段；5由于非重组粘性质粒很小,不能在体外包装,因而体外包装的主要是重组体,有利于以后的筛选.40 M31噬菌体的优点：1噬菌体颗粒中所含有的是单链DNA,该单链DNA可作为模板用于DNA序列分析；2利用单链M13克隆可制备成单链DNA探针用于杂交分析,检测DNA或RNA,或者作为基因定点诱变的载体.41大肠杆菌与哺乳动物表达载体的不同：大肠杆菌：含有复制位点、抗性基因、克隆位点,可导入大肠杆菌,与克隆载体一样,表达载体中含有表达系统元件,即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号.哺乳动物：真核表达载体中含有一套真核表达元件：；启动子/增强子-克隆位点-终止信号和加polyA信号.42 重组DNA的目的和基本过程：目的：1克隆某个特定的基因；2建立基因组文库、cDNA文库,3将特定的基因片段进行亚克隆以进行DNA序列测定；4构建表达载体以便在特定的宿主细胞中表达某个基因.过程：1制备目的基因和相关载体2将目的基因和有关载体进行连接3将重组的DNA导入受体细胞4DNA重组体的筛选和鉴定5DNA重组体的扩增、表达和其它研究.43 cＤＮＡ的合成过程：先从细胞中提取高质量的mＲＮＡ.因mＲＮA有polyA尾巴,可用12~18寡聚dT片段作为引物,加入4种dNTP,AMV或MMLV逆转录酶催化第一股链的合成.然后用RNaseH去掉mRNA,剩下的单链DNA的3端往往有自发回折原因不明形成的发夹结构,正好可以作为合成第二条DNA链的引物；由T4DNA 聚合酶催化第二股链的合成,即得到双链cDNA的混合体,采用S1核酸酶处理,可得到平端的双链cDNA.44 目的基因的筛选与鉴定：首先筛选出转化菌；然后筛选出带有重组体的克隆；最后是对DNA重组体进行鉴定.方法：遗传学方法插入灭活法、a-互补；免疫学方法；核酸杂交法；PCR技术；酶切鉴定.45 真核细胞转染的基本方法：1磷酸钙共沉淀法2电穿孔法3DEAE-葡萄糖法4脂质体介导基因导入5显微注射法46 在大肠杆菌中表达外源基因,主要考虑以下基本要素：1目的基因如果来自真核细胞必须是cDNA,因为大肠杆菌没有剪切内含子的功能.2从真核基因转录的mRNA缺乏结合细菌核糖体的SD序列,因此,cDNA的起始密码子ATG上游部分5端非编码区是无用的,必须除去.3所用表达载体必须是大肠杆菌表达载体.含有大肠杆菌RNA聚合酶所能识别的启动子和SD序列.47 寡核苷酸介导的诱变技术步骤：1将目的DNA片段插入M13噬菌体载体；2以重组噬菌体制备单链DNA；3设计并合成诱变寡核苷酸引物；4诱变寡核苷酸引物与靶单链DNA杂交；5利用Klenow片段在杂交的寡核苷酸上延伸；6用T4DNA 连接酶将新合成的杂合双链DNA连接成双链闭环DNA分子；7转化宿主细菌；8筛选含有诱变DNA片段的重组噬菌体；9以含有诱变DNA的重组噬菌体制备单链DNA；10测序证实M13噬菌体DNA带有目标诱变而无其它诱变.最后从重组M13噬菌体RF型DNA中回收诱变的DNA片段,克隆到其它适当的载体中,对诱变DNA片段进行进一步研究.48 双脱氧链终止法基本原理：和模板互补结合的引物在DNA聚合酶作用下发生互补链的延伸反应,反应体系中的2,3-双脱氧核苷三磷酸ddNTP与底物脱氧核苷三磷酸竞争结合于延伸互补链末端,造成延伸终止.由于产生一系列分别终止于A、G、C、T位置的不同大小的DNA片段,应用高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳可分辨仅相差一个核苷酸的20-500碱基的DNA片段,结合放射自显影技术,便能直接读出模板DNA的待测序列.双脱氧终止法测定DNA序列的片段通常克隆于M13或质粒pUC载体,利用多克隆位点两侧的通用引物进行测序反应.较长链的待测DNA片段可采用随机法、嵌套缺失法和引物延伸法进行序列测定.Maxam-Gilbert法基本原理：采用化学试剂处理末端放射标记的DNＡ单链片段,造成碱基特异性切割,由此产生一组具不同长度的ＤＮＡ链的反应混合物,经凝胶电泳按分子大小分离和放射自显影,直接读出待测ＤＮＡ的核苷酸顺序.激光测序技术：应用荧光基团标记引物或４种ddＮＴＰ,采用双脱氧链终止法原理进行测序反应,双脱氧核苷酸终止产物经荧光激发产生信号,通过计算机自动读出被测序列.４９温度对ＤＮＡ复性杂交的影响：温度过高不利于核酸复性,而温度过低,少数碱基配对形成的局部双链不易解离,适宜的复性温度是较Ｔm值低２５℃.在０度时杂交进行非常缓慢,随着温度的升高,杂交率也明显增加,当温度比Ｔm值低２０－２５度时,ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交达到最高杂交率.但在更高温度情况下,双链分子逐渐趋向解链,当温度达到Ｔm－５度时杂交率即非常低.１错配率第增加１％,Ｔm值应相应下降１０－１５度；２ＲＮＡ／ＤＮＡ杂交体的稳定性较ＤＮＡ／ＤＮＡ的稳定性高,Ｔm值应相应增加１０－１５度；３ＲＮＡ／ＲＮＡ杂交体的Ｔm值应相应增加２０－２５度,因此,采用ＲＮＡ探针时,加入适量的甲酰胺以降低Ｔm值是必需的；４寡核苷酸探针的碱基数很少,可以采用下式计算寡核苷酸探针Ｔm值：Ｔm=4G+C+2A+T；寡核苷酸探针杂交反应一般在低于Ｔm值５度下进行.５０常用的Ｓouthern转膜方法：１毛细管虹吸印迹法：２电转印法３真空转移法５１Ｓouthern\Northern印迹法区别：１靶核酸：Ｎ所检测的靶核酸是ＲＮＡ,Ｓ是ＤＮＡ２ＲＮＡ电泳：ＲＮＡ样品依其分子量大小在变性胶中进行分离,凝胶中需加入变性剂,防止ＲＮＡ分子形成二级结构,维持其单链线性状态.３转膜：电泳结束后,不需要再进行变性和中和,直接采用毛细管虹吸法将胶中的ＲＮＡ转移到膜上,也可采用电转移或真空转移法.５２核酸原位杂交步骤：１组织或细胞的固定２组织细胞杂交前的预处理３探针的选择和标记４杂交５杂交结果检测.５３ＲＮＡ酶保护分析法ＲＰＡ基本程序步骤：１制备待测ＲＮＡ２ＲＮＡ探针的标记３杂交４除去单链ＲＮＡ５电泳分析５４探针及标记物的种类：探针１cＤＮＡ探针２基因组ＤＮＡ探针３寡核苷酸探针４ＲＮＡ探针. 标记物：１核素标记物２非核素标记物：半抗原、配体、荧光素、化学发光探针.５５核酸体外标记法分为化学法和酶法：１化学法：利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团如磷酸基团发生的化学反应将标记物直接结合到探针分子上.２酶法酶促标记法：将标记物预先标记在核酸苷酸ＮＴＰ或dＮＴＰ分子上,然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子掺入到探针分子中去,或将核苷酸分子上的标记基团交换到探针分子上.５６酶促标记法：１缺口平移法；２随机引物法３ＰＣＲ标记法４末端标记法５７缺口平移法原理：利用适当浓度的ＤＮaseＩ在ＤＮＡ双链上随机切割单链,造成单链切口.切口处产生一个５末端和一个３末端,３末端即可作为引物,在大肠杆菌ＤＮＡ聚合酶Ｉ的５－３ＤＮＡ聚合酶活性的催化下,以互补的ＤＮＡ单链为模板,依次将dNTP连接到切口的３端羟基上,合成新的ＤＮＡ单链；同时ＤＮＡ聚合酶Ｉ的５－３核酸外切酶活性在切口处将旧链人５末端逐步切除,新合成链不断延伸,从而使原ＤＮＡ分子上的部分核苷酸残基被标记的核苷酸所取代.５８ＰＣＲ基本过程：１变性：通过加热至９５度左右,使ＤＮＡ双螺旋的氢键断裂,形成单链ＤＮＡ,作为反应的模板.２退火：将温度降至引物的Ｔm值左右或以下,引物与ＤＮＡ模板互补区域结合,形成杂交链.３延伸：当反应体系温度升至７０度左右时,ＴaqDNA聚合酶催化以引物为起始点的５－３ＤＮＡ链延伸反应,形成新生ＤＮＡ链.５９ＰＣＲ引物设计的基本要求：１引物长度一般为１５－３０个核苷酸.２引物中的碱基组成尽可能随机分布,避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象.３引物自身不应存在互补序列,尤其应避免折叠成发夹结构.４两个引物之间不应存在互补序列,尤其应避免３端的互补重叠.５引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过７０％,引物３末端连续８个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列,否则易导致非特异性扩增６引物３端碱基是引发延伸的起点,因此一定要与模板ＤＮＡ配对７引物与模板结合时,引物的５端最多可以游离十几个碱基而不影响ＰＣＲ反应的进行.６０ＰＣＲ技术的要类型：１筑巢ＰＣＲ２共享引物ＰＣＲ３多重ＰＣＲ４不对称ＰＣＲ５锚定ＰＣＲ６反向ＰＣＲ７彩色ＰＣＲ８原位ＰＣＲ９定量ＰＣＲ１０差异显示ＰＣＲ１１重组ＰＣＲ.６１ＰＣＲ反应体系包括：核酸模板、引物、ＴaqＤＮＡ聚合酶、缓冲液、Ｍg2+、dＮＴＰs、反应温度与循环次数.６２转基因动物及基本原理：转基因动物是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内,并能稳定传代的一类动物.基本原理：将目的基因或基因组片段用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中,使目的基因整合到基因组中,然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动物园的输卵管或子宫中,使其发育成携带有外源基因的转基因动物.导入基因的方法有显微注射法、胚胎干细胞法、逆转录病毒感染法、精子载体法.转基因动物中外源ＤＮＡ的检测：１染色体及基因水平的检测：斑点杂交、Ｓouthern杂交和ＰＣＲ分析、原位杂交等；２转录水平的检测：利用Northern杂交、RNase保护分析及ＲＴ－ＰＣＲ方法检测转基因mRNA的存在及表达水平.３蛋白质水平检测,采用Western印迹分析法.６３转基因动物的应用：１对基因组织或阶段特异表达的研究２通过研究转入外源基因后的新表型,可以发现基因的新功能；３导入外源基因后,由于基因的随机插入,可能会导致内源基因的突变,对这些突变表型进行分析,可以发现新的基因４可用于只在胚胎期才表达的基因的结构和功能的研究５建立研究外源基因表达、调控的动物模型６对遗传性疾病的研究７建立人类疾病的动物模型,８动物新品种的培育９基因产品的制备１０在免疫学中,可用于对免疫机制、免疫相关疾病的研究及建立免疫性疾病动物模型等.６４转基因植物技术路线：１选择及获得外源目的基因,２受体细胞培养,３选用适当的转基因方法将目的基因导入受体细胞４将转化细胞进行适当培养５筛选阳性转化细胞６培植阳性转化植株７转基因植株的鉴定.６５转基因植物在医学上的应用：１可成为新的疫苗来源,植物病毒也成为人类疫苗的可能来源２因为植物病毒对动物不致病,因此可利用植物病毒表达抗原蛋白的片段,以诱导哺乳动物免疫系统发生反应.３还可产生单抗,作为化疗药物的靶向载体.６６基因打靶的必备条件：１胚胎干细胞：ＥＳ细胞的特点：能在体外培养,并保留发育的全能性.体外培养要维持细胞的分裂增殖与正常的核型,同时抑制细胞的分化.２打靶载体：a、neo阳性筛选标志：b、ＨＳＶ－tk阴性筛选标志：６７构建打靶载体的基本过程：１获得目的基因待敲除基因的同源片段,将此ＤＮＡ片段克隆到一般的质粒载体中；２从重组质粒中切除目的基因的大部分同源ＤＮＡ序列,只留部分序列在线性质粒载体的两端；３将neo基因克隆到带有目的基因同源顺序的线性质粒中,使之位于残留目的基因同源顺序的中间；４在目的基因同源顺序的外侧线性化重组质粒载体,将ＨＳＶ－tk基因克隆到此线性载体中.６８ＤＮＡ芯片技术的应用：１ＤＮＡ序列测定２基因表达分析３基因组研究４基因诊断５药物研究与开发药物筛选、新药发现、合理用药、中草药鉴定和真假药辨别６９引起ＤＮＡ一级结构变异的诱变剂的作用机制：１碱基类似物诱发突变２改变ＤＮＡ的化学结构３结合到ＤＮＡ分子上诱发移码突变４紫外线及其其它射线引起的ＤＮＡ分子变化.７０突变类型：点突变转换和颠换、缺失一个。

分子生物学第一章绪论•1定义•广义概念研究核酸与蛋白质等生物大分子的结构与功能，同时从分子水平上阐明生命现象和生物学规律。

•狭义概念研究基因的结构与功能、DNA的复制、转录、表达和调控等过程。

2分子生物学的研究内容•基因与基因组的结构与功能•DNA的复制、转录和翻译•基因表达调控•DNA重组技术•结构分子生物学基因与基因组的结构与功能•20世纪50年代前➟染色体遗传学阶段•20世纪50年代后➟基因的分子生物学阶段•近30年➟反向生物学阶段D N A的复制、转录和翻译•自我复制、转录和翻译•mRNA分子的剪接、加工、编辑及新生肽链折叠成功能性结构基因表达调控•表达的实质是遗传信息的转录与翻译:时序调节表达与环境调控表达•调控阶段:原核生物与真核生物的异同D N A重组技术•应用该技术将不同的片段进行定向的连接，并在特定的受体细胞与载体中同时复制与表达•生产大量在正常细胞代谢中产量低的生物活性物质•定向改造某些生物的基因组结构结构分子生物学•生物大分子发挥功能需具备的条件1. 有特定的空间结构2. 结构与构象的变化•研究内容1. 结构的测定2. 结构运动变化规律的探索3. 结构与功能的相互关系3分子生物学的发展历程•(1944~1966)人类对DNA和遗传信息传递的认识阶段(DNA是遗传物质）•(1967~1978)重组DNA技术的建立和发展阶段（DNA双螺旋结构，中心法则）•1979年至今，重组DNA技术的应用和分子生物学迅速发展阶段（基因工程技术）孟德尔Gregor Mendel (1822-1884),奥地利科学家，经典遗传学的奠基人•连锁互换规律•画出了果蝇的4对染色体上的基因所排列的位置图。

基因学说,染色体就是基因的载体•摩尔根荣获了1933年诺贝尔生理学及医学奖。

霍普金斯大学•当时未知基因的化学本质，遗传学是依靠逻辑分析的推理性科学1957年，H e i n z F r a e n k e l-C o n r a t和B.S i n g r e的杂合病毒实验：1953年，美国科学家Watson 和英国科学家Crick提出DNA Double Helix model1958年Crick提出中心法则。

病毒的结构和分子生物学病毒是一种微生物，它可以感染人体细胞并导致疾病。

病毒的结构与其他微生物有很大不同，它不具备细胞结构，无法自行繁殖和生长，需要寄生在宿主细胞内完成其生命周期。

病毒研究的分子生物学让我们更好地了解病毒的结构和工作机制，有助于预防和治疗病毒感染。

病毒的结构病毒主要由三个部分组成：遗传物质、蛋白质衣壳和部分病毒还有宿主细胞膜的包装。

病毒的遗传物质是其最重要的组成部分，它包括病毒基因组或RNA（核糖核酸）。

病毒的基因组是具有脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）的遗传物质，它存储病毒的遗传信息。

病毒基因组的大小和形状都不同，它可以是单链或双链DNA或RNA，也可以是环状或线性形态。

蛋白质衣壳也是病毒的重要组成部分，它由多种不同的蛋白质组成，与遗传物质包裹在一起。

这些蛋白质衣壳具有传染性，可以保护病毒在宿主体内存活，并让病毒侵入宿主细胞。

一些病毒还有宿主细胞膜的包装，它会影响宿主细胞对病毒的感染和内禀免疫回应。

病毒的分子生物学病毒的分子生物学主要研究病毒的遗传物质和蛋白质的组成和功能，以及病毒与宿主细胞的相互作用。

这些研究不只可以帮助人类更好地理解病毒的生命周期，更可以提高我们对病毒的防范和治疗能力。

病毒基因组和RNA的研究是病毒分子生物学的重要部分，它可以告诉我们关于病毒遗传特征的信息。

这些信息被用于开发治疗和疫苗，使得我们更好地和病毒斗争。

相比之下，病毒的蛋白质组成更容易分离和检测。

研究人员可以通过这些蛋白质的结构和功能来推导出病毒的作用机制，并利用这些信息来设计更好的药物和疫苗。

宿主细胞的相互作用对于病毒的研究也非常重要。

病毒依赖于宿主细胞的进入、生长和繁殖，因此研究病毒的感染过程与宿主细胞之间的相互作用可以帮助我们更好地了解病毒与宿主细胞之间的交互，并为研究新的治疗手段和疫苗提供基础。

结论病毒的分子生物学研究帮助我们更好地了解病毒的结构和其在人类细胞中的分子生物学机制。

病毒的分子生物学包括病毒基因组、蛋白质组成和宿主细胞的相互作用，这些都为我们开发新的治疗手段和疫苗提供了信息。

病毒的分子生物学特征病毒是一类非常小的微生物，其大小只有细菌的几分之一甚至更小。

不同于细菌和真菌等自主生长繁殖的微生物，病毒不能独立存在，必须寄生于宿主细胞内才能生存。

这种非常独特的特性，决定了病毒在其生理、生态和流行病学特征中都具有相应的特殊性。

本文将着重探讨病毒的分子生物学特征。

1. 病毒的组成结构病毒的组成结构相对简单，一般可以分为两个基本部分：核酸和外壳。

核酸是病毒遗传物质的主要组成部分，可以是DNA或RNA，大小在数千到数百万个核苷酸之间不等。

外壳由外膜和壳蛋白构成，可保护病毒的核酸不受环境影响，并在宿主细胞上特异性结合到受体蛋白上，进而释放出核酸，完成病毒寄生的生命周期。

2. 病毒的复制过程病毒的复制过程可以分为两个基本环节：感染和复制。

病毒依靠其外壳上的结构蛋白和其他因素，特异性地结合到宿主细胞表面受体上，然后进入细胞内，释放出核酸。

核酸会在宿主细胞内复制、转录、翻译，生成新的病毒核酸和外壳蛋白，再经过自组装等机制，形成新的病毒颗粒，最终释放出来，再重复感染新细胞，完成病毒生命周期。

3. 病毒的基因组组成病毒的基因组组成既简单又复杂。

一方面，其基因组体积相对较小，且没有细胞具有的许多生物合成、代谢等功能基因。

另一方面，病毒基因组具有相当的遗传信息、高度致病性和易突变性，这使其能够在病毒和宿主之间的共进化过程中适应和演化，不断产生新的病原体种类和变种。

4. 病毒的变异与进化机制病毒的变异主要源于其高度易突变的基因组，以及在复制过程中的随机失误和复合错误等原因。

由于病毒的短生命周期和大量繁殖，使得其遗传多样性远高于其他生物，这也为病毒变异和进化开辟了更多的途径。

一些病毒的变异可以导致其致病性和传播能力的改变，从而对公共卫生和人类健康带来新的威胁。

5. 病毒的检测方法病毒的检测手段因其非常微小和非细胞性质而与其他微生物不同。

其中，最常用的方法是分子生物学技术，主要包括核酸杂交、聚合酶链反应（PCR）、逆转录-PCR等。

第一章基因与基因组一、基因与基因组特点(重点)1.Gene：a gene includes the entire nucleic acid sequence necessary for the expression of its product (peptide or RNA).2.Genome(基因组):细胞内所携带的全部遗传信息DNA的总和。

3.C值(C-value): 单倍体DNA所包含的全部DNA量。

4.C值矛盾(C-value Paradox)：物种的C值和它进化复杂性之间没有严格的对应关系。

5.真核生物基因组的特点：（1）基因组较大（2）往往有很多染色体，多复制起始位点(ori)（3）DNA与蛋白质结合，形成核小体(nucleosome) ，再缠绕成染色质chromatin （染色体chromosome ）（4）转录和翻译在时间和空间上是分隔的。

（5）转录产物为单顺反子（mono-cistron）（6）有可移动的DNA序列（7）有大量的重复序列、基因家族(gene family)、不连续基因(discontinuous gene) （真核生物基因组三大特点）6.真核生物基因组的序列类型:高度重复序列、中度重复序列、单拷贝序列。

7.基因家族（gene family）：基因组中来源相同、结构相似、功能相关的一组基因。

产生机理（理解）：不对等交换、几种基因家族：Alu基因家族、rRNA基因家族、组蛋白基因家族、珠蛋白基因家族疾病：Thalassemia(地中海贫血)8.珠蛋白基因家族α2β2，α型亚基基因在16号染色体上，β型亚基基因在11号染色体上，珠蛋白基因以基因家族的形式排列。

9.基因簇（gene cluster）：同一家族中的成员有时紧密地排列在一起，成为一个基因簇。

10.假基因(pseudogene)：具有与功能基因相似的序列, 却不具正常功能的基因。

11.不连续基因(discontinuous gene) 或断裂基因（split gene）:基因的编码序列在DNA分子上是不连续的,为不编码的序列所隔开。

第 一 章核酸 、 基因 和 基因组引言● 生命是物质进化的产物 ● 生命所具有的特征 ● 生命的分子逻辑4.5×109 ∣4×109 ∣3×109 ∣2×109 ∣1×109年 ∣现在 ∣---------------------------------------------------------→ ↑ 地球诞生 ↑ 最古的化石化学进化 ---------------------………… 生物进化 ………----------------------------------------------1引言特性原核生物和真核生物细胞学的比较 原核生物 通常很小（1-10um） 真核生物● 生命是物质进化的产物 ● 生命所具有的特征 ● 生命的分子逻辑尺度 基因组通常较大（10100um ） DNA与非组蛋白结 DNA 与 组 蛋 白 及 非 组 合，基因组存在于 蛋白结合，存在于染 类核体中，无膜包 色体中，染色体存在 围 于具核膜的细胞核中 二分裂 有丝分裂，含有纺锤 体或中心体细胞分 裂原核生物和真核生物细胞学的比较 特性 膜包围 的细胞 器 营养 能量代 谢 原核生物 无 真核生物 线粒体、叶绿体（植 物中）、内质网、高 尔基体、溶酶体等 特性 细胞骨 架 胞内运 动原核生物和真核生物细胞学的比较原核生物 无真核生物 复杂，有微丝（肌动 蛋白）、微管及中间 丝 胞质流动、内吞作用、 胞饮作用、有丝分裂、 突触运输等吸收，有些进行光合 吸收或进行光合作用 作用（光合细菌） （绿色植物） 无线粒体，氧化酶类 氧化酶类包装在线粒 与质膜结合，多条代 体中，氧化途径较单 谢途径 一无2E.coli 2.4X109Da, 4639Kb(1300微米),闭合 环状，也编码4,288个基因。

类核（nucleoid） 支架（scafford） 100个DNA环组成，每个环 长40Kb，13微米。