Sanger法测定季节性H3N2亚型流感病毒全基因组序列重点

湖北省2007~2012年 H3N2流感病毒 HA基因及抗原性分析梁杨;霍细香;方斌;刘琳琳;陈盛杰;刘准;陈丹【期刊名称】《华中科技大学学报（医学版）》【年(卷),期】2016(45)3【摘要】目的：研究湖北省2007~2012年 H3N2流感病毒 HA 基因变异及抗原性变化情况。

方法选取2007~2012年分离的湖北省各地区 H3N2流感病毒39株,提取病毒 RNA,运用 RT-PCR技术扩增 HA基因并测定序列,软件导出其核苷酸、氨基酸序列,采用MEGA5.2构建进化树,用红细胞凝集抑制实验检测病毒的抗原性。

结果14株毒株红细胞凝集抑制结果显示效价与参照抗原有4倍以上的差异,提示H3N2流感病毒存在抗原性变异；核苷酸有较高的同源性,为97%~99%；HA1区共有50个氨基酸发生改变,其中37个在抗原位点,受体结合位点有2个(194、225位),抗原决定簇 A区4个,B区6个,C区2个,D、E区各1个；糖基化位点有明显的地域差异,不同地区糖基化位点的数量和位置均不相同。

结论湖北省2007~2012年间 H3N2流感病毒抗原性和 HA基因存在变异。

%Objective To investigate the variation of HA gene and antigenicity of influenza H3N2 viruses in Hubei province during 2007-2012.Methods RNA was extracted from 39 strains of influenza H3N2 viruses obtained from different areas in Hubei province during 2007-2012.The HA gene was amplified with RT-PCR and sequenced.The amino acid and nucleotide sequences were obtained by using the software.Then the evolutionary tree was constructed via MEGA 5.2.The antigenicity of the strains was determined by hemagglutinationinhibition(HI)test.Results HI test results showed that there was a difference of more than 4 times in the antibody titer between the samples and the standard antigen,suggesting the antigenic variation of H3N2 flu viruses.The nucleotide homology was high,and reached 97%-99%.Fifty amino acids changed in the HA1 segment, including 37 in antigen sites,2 in receptor binding sites(194,225),4 in the antigenic determinant area A,6 in area B,2 in area C and 1 in area D and E each.There were significant differences in the number and position of glycosylation sites between different regions.Conclusion There were variations in HA gene and antigenicity in H3N2 virus in Hubei province during 2007-2012.【总页数】6页(P292-297)【作者】梁杨;霍细香;方斌;刘琳琳;陈盛杰;刘准;陈丹【作者单位】武汉科技大学医学院公共卫生学院，武汉 430065; 湖北省疾病预防控制中心，武汉 430079;湖北省疾病预防控制中心，武汉 430079;湖北省疾病预防控制中心，武汉 430079;湖北省疾病预防控制中心，武汉 430079;武汉科技大学医学院公共卫生学院，武汉 430065;武汉科技大学医学院公共卫生学院，武汉430065;武汉科技大学医学院公共卫生学院，武汉 430065【正文语种】中文【中图分类】R181.36【相关文献】1.H3N2亚型猪流感病毒HA基因序列测定及抗原性分析 [J], 刘大飞;杨涛;刘明;刘春国;桑学波;刘大程2.一株野鸟源H3N2亚型禽流感病毒HA基因序列分析 [J], 李知新;吴润;马龙;赵燕;李杰;宋权儒3.2007-2017年中国甲型H3N2流感病毒HA基因特征分析 [J], 徐姿;柯美霞;崔大伟;王胜军4.2019-2020年山东省H3N2流感病毒抗原性及血凝素基因特征分析 [J], 吴巨龙;吕健;寇增强;宋绍霞;孙林;何玉洁;刘倜5.2007～2008年流感监测季北京地区H3N2亚型流感病毒抗原性与HA1基因特性分析 [J], 石伟先;王晓梅;梁慧洁;吕燕宁;彭晓旻;丁立新;段玮;杨鹏;张家淮;黄芳;王全意;庞星火因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

H3N2亚型猪流感病毒实时荧光定量PCR快速检测方法的建立陈艳;张春明;乔传玲;杨焕良;张飞;吴运谱;辛晓光;陈化兰【期刊名称】《中国兽医科学》【年(卷),期】2009(39)10【摘要】根据H3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因保守序列,分别设计并合成了特异性引物和TaqMan MGB探针,利用实时荧光定量PCR技术检测SIV。

使用含有选定检测序列的重组质粒pMD18-H3HA、pMD18-N2NA标准品绘制标准曲线,其相关系数分别为0.99015(H3HA)和0.99947(N2NA)。

检测结果显示,该方法的敏感性可达100 copies/μL,除H3N2亚型SIV外,对H1亚型、H9亚型SIV以及猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒和猪2型圆环病毒的检测均为阴性,应用该方法对实验室感染样品进行检测,其结果与病毒分离结果的符合率为95.83%。

表明,该方法特异性强、重复性好,有望成为H3N2亚型SIV的一种特异、敏感、快速的定量检测方法。

【总页数】6页(P894-899)【关键词】猪流感病毒;H3N2亚型;Taq;Man;MGB探针;实时荧光定量PCR【作者】陈艳;张春明;乔传玲;杨焕良;张飞;吴运谱;辛晓光;陈化兰【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室【正文语种】中文【中图分类】S852.659.5【相关文献】1.H3N2亚型禽流感病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 [J], 刘婷婷;谢芝勋;宋德贵;谢志勤;邓显文;谢丽基;黄莉;罗思思;黄娇玲2.分子信标荧光定量PCR检测H3N2亚型猪流感病毒方法的建立 [J], 禹思宇;周宇;唐连飞;孟芳;袁晓芬;梁斌3.H1、H3亚型猪流感病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 [J], 王博;王慧煜;赵宝华;罗静;王承民;何宏轩;韩雪清4.H1亚型猪流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 [J], 刘好朋;胡京京;唐续;裴仉福;李冰;李琳;陈瑞爱;贺东生5.H3亚型猪流感病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立 [J], 郭泗虎;王文华;张亮权;齐海涛;曹楠;闫明菲;黄昌力;张超轶;张桂红因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

人源H3N2亚型猪流感重组病毒的分离鉴定及全基因序列分析周伦江;王隆柏;俞玉鸿;魏宏;车勇良;陈如敬;吴学敏;邵良平;庄向生【摘要】A virus was isolated from the pig tissue sample of swine influenza-like case and identified as a H3N2 swine influenza virus (SIV) by HA and HI test, designated A/Swine/Fujian/F2/07(H3N2). The virus titers were 10-4.8 ELD50, and 10-6.17 EID50 in inoculated chicken embryos. The results of sequence analysis indicated that the virus nucleotide sequences shared 84.7% to 98.1%, 94.4% to 99.5%, 88.6% to 97.6% with HA, NS, NA gene of human influenza virus (HIV) reference strains, respectively, and 87.7% to 98.5%, 82.5% to 99.9%, 87.6% to 98.4% with SIV reference strains, respectively. Homology of M gene was less than 90.1% with SIV H3N2 strains and HIV strains, but shared more than 97.6% with SIV H1N1 strains. These results indicated that the PB2, PB1, PA, HA, NP, NA and NS gene of A/Swine/Fujian/F2/07(H3N2) isolate might originate from the H3N2 subtype HFVs which were isolated from 1975 to 1982, and M gene might originate from the H1N1 subtype SIV, indicating that the isolate was a human-swine influenza reassortant virus with the RNA segments from human H3N2 influenza virus and classicalH1N1 SIV.%本研究由疑似猪流感病料样品中分离一株病毒,通过HA、HI、电镜观察、生物学特性测定及全基因序列测定表明,分离病毒株为H3N2亚型人流感病毒和H1N1亚型古典猪流感病毒(SIV)的重组体,命名为A/Swine/Fujian/F2/07(H3N2).该分离株含有8个基因片段,共13 442 bp,与GenBank中登录的H3N2亚型人流感病毒、H1N1亚型古典SIV和H3N2亚型SIV进行比较分析显示:分离株的HA、NS、NA基因与H3N2亚型人流感病毒株的同源性分别为84.7 ％～98.1％、94.4 ％～99.5％和88.6 ％～97.6％；与H3N2亚型SIV的核苷酸同源性分别为87.7％～98.5％、82.5 ％～99.9％和87.6 ％～98.4％；M基因与H3N2亚型人流感病毒和SIV的同源性均在90.1％以下,而与H1N1亚型古典SIV的同源性在97.6％以上.基因型分析表明分离株的PB2、PBI、PA、HA、NP、NA和NS基因片段来源于1975年～1982年的人流感病毒,而M基因来源于H1N1亚型古典SIV,充分证明猪作为流感病毒“混合器”的作用.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2011(033)009【总页数】6页(P675-680)【关键词】两源重组H3N2亚型;分离;序列分析【作者】周伦江;王隆柏;俞玉鸿;魏宏;车勇良;陈如敬;吴学敏;邵良平;庄向生【作者单位】福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治T程技术研究中心,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治T程技术研究中心,福建福州350013;福建农林大学动物科学学院,福建福州350002;福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治T程技术研究中心,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治T程技术研究中心,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治T程技术研究中心,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治T程技术研究中心,福建福州350013;福建农林大学动物科学学院,福建福州350002;福建农林大学动物科学学院,福建福州350002【正文语种】中文【中图分类】S852.65猪流感病毒(Swine influenza virus，SIV)属正粘病毒科，A型流感病毒属，基因组约为13.6 kb，由8个独立节段组成，编码至少10个基因产物，其中节段1～3分别编码PB2、PB1和PB3聚合酶，节段4和节段6分别编码血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，节段5编码核蛋白(NP)，节段7编码病毒基质蛋白Ml和离子通道蛋白M2，节段8编码非结构蛋白NSl和NS2[1]。

猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型多重RT-PCR诊断方法的建立杨焕良;乔传玲;陈艳;辛晓光;李一经;陈化兰【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2007(029)009【摘要】对我国分离到的猪流感病毒和GenBank数据库中已有的猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型毒株的HA、NA基因核苷酸序列进行分析,分别选出各个病毒亚型HA和NA基因中高度保守且特异的核苷酸区域,设计扩增猪流感病毒H1和H3、N1和N2亚型的2套多重PCR特异性引物,建立了猪流感H1N1、H1N2和H3N2亚型病毒多重RT-PCR诊断方法.采用该方法对H1N1、H1N2、H3N2亚型猪流感病毒标准参考株进行RT-PCR检测,结果均呈阳性,对扩增得到的片段进行序列测定和BLAST比较,表明为目的基因片段.其它几种常见猪病病毒和其它亚型猪流感病毒的RT-PCR扩增结果都呈阴性.对107 EID50/0.1 mL病毒进行稀释,提取RNA进行敏感性试验,RT-PCR最少可检测到102 EID50的病毒量核酸.对40份阳性临床样品的检测结果是H1N1、H1N2和H3N2亚型分别为16份、1份和20份,其它3份样品同时含有H1N1和H3N2亚型猪流感病毒,和鸡胚分离病毒结果100%一致.试验证明建立的猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型多重RT-PCR诊断方法是一种特异敏感的诊断方法,可用于临床样品的早期快速诊断和分型.【总页数】5页(P714-718)【作者】杨焕良;乔传玲;陈艳;辛晓光;李一经;陈化兰【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;东北农业大学,动物医学院,黑龙江,哈尔滨,150030;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001【正文语种】中文【中图分类】S852.659.5;S854.44【相关文献】1.猪流感病毒HA和NA亚型多重RT-PCR鉴别诊断方法的建立 [J], 袁万哲;孙明谭;孙继国2.西班牙养猪密集地区同时流行A型流感病毒H1N2、H1N1和H3N2亚型的证据 [J], Jaime Maldonado;Kristien Van Reeth;Pere Riera;Marta Sitja;Narcis Saubi;Enric Espuna;Carlos Artigas;罗天海3.H1N1亚型三个谱系猪流感病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立 [J], 兰德松4.H3N2亚型猪流感病毒重组HA1蛋白间接ELISA诊断方法的建立 [J], 丁选亚;乔传玲;陈艳;杨焕良;辛晓光;韩庆功;陈化兰5.数字RT-PCR技术检测H3N2亚型猪流感病毒方法的建立 [J], 唐连飞;禹思宇;周宇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

H3N2亚型流感病毒分离株全基因组序列特征分析及其临床意义韦栋;张博;张东华;王铭杰;于德敏;周敏;时国朝;张欣欣【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2015(035)011【摘要】目的分析H3N2亚型流感病毒流行株的全基因组序列及其与临床特征的相关性.方法检测2014年12月-2015年3月收集的呼吸道感染患者鼻拭子样本,对其中H3N2亚型流感病毒株PCR扩增后直接进行全基因组测序,分析其核酸序列特征及氨基酸变异情况.结果与WHO推荐2014-2015流感疫苗株参考病毒株相比,来自不同患者的14个病毒株HA1蛋白抗原决定簇均发生不同程度突变,抗原决定簇结构改变较明显的病毒株其宿主具有更高的体温和更严重的临床表现.全部14个病毒株发生HA1蛋白E190D氨基酸突变.6个病毒株NA蛋白出现1个新增糖基化位点.1个病毒株存在导致金刚烷胺耐药的M2蛋白V27A突变.全部14个病毒株PB1-F2蛋白发生I18T突变.结论 M2蛋白耐药突变的出现和PB1-F2蛋白氨基酸突变提示分离获得的H3N2流感病毒株在进化过程中曾经结合H1N1亚型流感病毒基因片段.HA1蛋白抗原决定簇突变的增加可能引发患者更强的免疫反应.【总页数】9页(P1593-1601)【作者】韦栋;张博;张东华;王铭杰;于德敏;周敏;时国朝;张欣欣【作者单位】上海交通大学医学院附属瑞金医院感染病与呼吸病研究所临床病毒研究室,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院感染病与呼吸病研究所临床病毒研究室,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院感染病与呼吸病研究所临床病毒研究室,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院感染病与呼吸病研究所临床病毒研究室,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院感染病与呼吸病研究所临床病毒研究室,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院呼吸科,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院呼吸科,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院感染病与呼吸病研究所临床病毒研究室,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院北院,上海201801【正文语种】中文【中图分类】R511.7【相关文献】1.一株H3N2亚型猪流感病毒广东分离株的基因组序列分析 [J], 姚艳;张桂红;刘文军;陈铁桥;孙蕾;罗浑金2.猪流感病毒H3N2亚型的分离鉴定与全基因组序列测定 [J], 孙志勇;郭万柱;韩国全;陈进会;王小玉;徐志文3.一株野鸟源H3N8亚型流感病毒分离株的全基因组序列分析 [J], 兰玲;王涛;王晶;程子兵;邓国华;陈化兰4.一株H9N2亚型禽流感病毒分离株的生物学特性研究及其全基因组序列分析 [J], 刘海玲;胡自立;罗开健5.一株鸭源H8N4亚型禽流感病毒分离株的全基因组序列分析及致病性的研究 [J], 王晶;张芳;卢坤鹏;关立峥;肖丽;彭志;邓国华;陈化兰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

流感病毒H_3N_2亚型HA_1基因变异分析黄平;蔡初的;郝瑞丰;陈伟师;沈桂章;谭丽霞;倪汉忠;黄介枚【期刊名称】《中国人兽共患病杂志》【年(卷),期】1996(12)6【摘要】１９９４年流感病毒Ｈ３Ｎ２亚型ＨＡ１基因核苷酸序列分析结果显示，经过２６年进化，共有１１４个核苷酸置换，引起５１个氨基酸变异，变异比例为１５．５％。

自１９６８年＂香港流感＂引起人类暴发流行以来，ＨＡ１基因核苷酸置换率４～６个／每年，氨基酸变异２～３个／每年，核苷酸和氨基酸变异速度减慢。

１９９４年三株病毒中，广东地区毒株比仙台地区和河北地区毒株多变异２～３个氨基酸；这从分子流行病学角度提示，广东地区流行毒株在目前流感病毒Ｈ３Ｎ２亚型的变异和流行中可能具有重要作用。

【总页数】5页(P3-7)【关键词】流感病毒;血凝素基因;序列分析;变异【作者】黄平;蔡初的;郝瑞丰;陈伟师;沈桂章;谭丽霞;倪汉忠;黄介枚【作者单位】广东省卫生防疫站【正文语种】中文【中图分类】R373.13【相关文献】1.河南地区一株鸡源H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及HA基因变异分析 [J], 王丽荣;董永军;杭柏林;刘兴友;王三虎;胡建和2.2015—2017年上海市浦东新区H3N2亚型流感病毒流行特征与基因变异分析[J], 赵冰;叶楚楚;邹文玮;马平;刘青;孙乔;郝莉鹏;朱林英3.H_3N_2亚型人流行性感冒病毒HA_1的蛋白序列同源性比较、变异规律及结构与功能的分析 [J], 王勇;薛颖;陈淑霞;金奇;侯云德4.用PCR-RFLP方法分析流感病毒H_3N_2亚型毒株 [J], 黄平;C.A.Bender;沈桂章;周惠琼;N.J.Cox5.H_3N_2亚型犬流感病毒鼠/犬嵌合抗体scFv-Fc的制备与活性分析 [J], 赵丹;邱冬;韩德敏;刘永杰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

综述甲型H3N2亚型流感病毒血凝素及神经氨酸酶基因变异分析的研究进展【摘要】流感病毒最显著地特点是极易发生变异而引起新的流行。

为了探讨甲型H3N2亚型流感病毒(A/H3N2)血凝素（HA）及神经氨酸酶(NA)基因动态变化情况，本文对近几年各地区对H3N2的HA 及NA基因变异分析进行了归纳总结。

【关键词】流感病毒，H3N2亚型；HA；NA；基因变异甲型H3N2亚型流感病毒(influenza A/H3N2 viruses,A/H3N2)自1968年引起世界大流行以来一直是人群中主要的流感亚型之一，其抗原漂移的动力学、分子特性和基因变异与流感发生和流行的关系是近几年研究的热点[1]。

A/H3N2全基因组共有8个片段，编码10种以上不同的蛋白，其中血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)位于流感病毒球形结构的表面，在病毒的感染、增值及变异中起着重要的作用[2]。

为明确H3N2亚型流行株基因变异趋势，本文从其HA及NA两个基因序列方面，分别阐述了基因特性分析的研究进展。

1.HA基因进化A/H3N2的HA基因变异是最快的。

在病毒的受体识别和复制中起重要作用，包括识别和结合宿主细胞表面的受体，使毒粒囊膜和和宿主细胞膜发生融合并导致溶解，使病毒基因组进入细胞质并开始复制等。

这些活动与抗原决定簇和受体结合位点(RBS)所在的HA重链区（HA1区）关系最密切。

1.1 HA1基因变异与分析从中国H3N2HA1基因进化树可以看到典型的梯形树形，HA1进化树是一个以主干向上发展，以很短的侧枝为特征。

对2007～2010年无锡地区分离的42株H3N2流感病毒的HA基因进行分析,也表明核苷酸序列的进化树呈斜长型,进化的路径表现为一主要的进化主干向上发展[3]。

树的主干很长，基本是按毒株出现的时间先后发展。

进化树侧枝很短提示了新旧毒株的交替速度很快。

而中国1995～2005年H3N2亚型人流感病毒HA1基因序列分析也表明我国1995～2005年流行的H3N2毒株HA1的序列位点不断发生变化。

1株H3N2亚型猪流感病毒的分离鉴定齐海涛;闫军霞;粟硕;黄震;曹楠;谭力凯;孔维立;张桂红【摘要】为了解广东猪流感病毒(SIV)的流行变异情况,2010年11月从广东某规模猪场采集流感症状的猪鼻拭子60份,接种10日龄SPF鸡胚,分离到1株猪流感病毒,通过流感分型RT-PCR和HI试验鉴定为H3N2亚型SIV,命名为A/swine/Guangdong/L22/2010(H3N2),进行全基因序列测定及相似性分析发现,该分离株有低致病性流感分子特征,该毒株的8个基因片段连同最近广东猪群流行的流感毒株与2000年前后H3N2人流感病毒有较高的同源性.系统遗传演化显示,该病毒分离株可能是由1999年人源H3N2流感病毒A/Moscow/10/99(H3N2)进化而来.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2012(048)012【总页数】4页(P24-27)【关键词】H3N2;猪流感病毒;分离鉴定【作者】齐海涛;闫军霞;粟硕;黄震;曹楠;谭力凯;孔维立;张桂红【作者单位】华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642【正文语种】中文【中图分类】S855.3猪流感（SI）是由A型流感病毒引起的猪的一种急性、传染性呼吸道疾病，以发热、流鼻液、咳嗽、食欲减退等症状为特征，病猪可在短期内康复，但会降低饲料报酬，延迟上市时间。

目前猪群中的SIV主要有H1N1、H1N2和H3N2 3种亚型。

我国猪群中普遍存在H3和H1亚型感染。

更为重要的是，猪可以被禽流感病毒和人流感病毒同时感染，猪被认为是流感病毒的“混合器”，在“禽－猪－人”的传播链中具有独特的地位［1－2］，SI具有重要的公共卫生意义。

Sanger测序原理与方法在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。

目前用于DNA测序的技术主要有Frederick Sanger发明的Sanger双脱氧链终止法（Chain Termination Method）。

快速DNA测序方法的出现极大地推动了生物学和医学的研究和发现。

测序原理利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。

每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。

由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。

终止点由反应中相应的双脱氧而定。

每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。

它们具有共同的起始点，终止点由反应中相应的双脱氧而定。

测序方法基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR 产物则是相差1个碱基的3'末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。

由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。

分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。

测序设备DNA测序仪(3730xl DNA Analyzer)，性能特点，自动化程度高，提供连续、无需监控的操作，自动灌胶、上样、电泳分离、检测及数据分析，可连续运行24小时无需人工干预。

H3亚型鸭源流感病毒分离鉴定及HA基因序列分析李岩【摘要】为了研究H3亚型禽流感病毒的分子特征,本研究从鸭的粪便样本中分离到一株禽流感病毒,通过血凝抑制试验证实该分离株为H3亚型流感病毒,命名为A/Duck/Heilongjiang/1/2014(H3N2).对其血凝素基因进行了克隆和序列分析,结果表明分离株与韩国水鸟的H3N2亚型AIV A/aquatic bird/Korea/KN-2/2005的同源性最高,达到94.6％.系统发育树分析进一步证实分离株可能来源于韩国的水鸟.本研究为H3亚型禽流感的流行病学研究补充了新的数据.【期刊名称】《现代畜牧兽医》【年(卷),期】2015(000)005【总页数】5页(P7-11)【关键词】鸭;流感病毒;H3亚型;HA基因;序列分析【作者】李岩【作者单位】黑龙江省绥化市青冈县畜牧兽医局,黑龙江青冈 151600【正文语种】中文【中图分类】S855.3禽流感（Avian inf luenza,AI）是由正黏病毒科A型流感病毒属的禽流感病毒（Avian inf luenza virus,AIV）所引起的禽类传染病。

该病广泛流行于世界各地，给养禽业乃至人类造成了巨大的威胁和经济损失。

根据AIV的血凝素（Hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶可将其分为16个HA亚型和9个NA亚型[1]。

目前，我国禽群中常见的亚型主要有H3、H5、H6、和H9[2-3]，其中H5为高致病性亚型，其他亚型均为低致病性禽流感病毒。

水禽是流感病毒的自然宿主和基因储存库，水禽在流感病毒的进化中发挥重要作用。

H3亚型流感病毒感染的宿主谱比较广泛，包括禽、猪、人、犬马、猫等[4-8]。

1989年，我国马群中暴发禽源H3N亚型流感病毒，造成严重的经济影响。

自2006年以来，韩国和中国等地频繁发生禽源H3N2亚型流感病毒感染犬的事件[8-9]。

这些证据表明，虽然H3亚型AIV在禽中为低致病性的，但跨种传播后感染性增强，危害严重。

流感NA（H3N2）基因真核表达载体构建及序列进化分析
的开题报告
一、研究背景
流感病毒是一种RNA病毒，具有强大的变异和适应性能力，常常引起全球性流行病。

其中，流感病毒NA（神经氨酸酶）基因编码的NA蛋白质与病毒发病、传染性等密切相关。

因此，NA基因的研究对于了解病毒变化规律，发展流感疫苗和药物具有重要意义。

二、研究目的
本研究目的是构建流感病毒NA（H3N2）基因的真核表达载体，并通过序列进化分析，探讨流感病毒NA基因的进化规律。

三、研究方法
1. 提取流感病毒NA（H3N2）基因的RNA
从流感病毒H3N2 株系中提取RNA，利用逆转录、PCR等技术获得NA基因的DNA 片段。

2. 克隆 NA基因片段至真核表达载体
将 NA基因片段亚克隆至真核表达载体中，利用酵母菌等系统进行表达。

3. 获得重组蛋白
利用克隆的真核表达载体中的NA基因片段表达获得相应的重组NA蛋白。

4. 序列进化分析
利用基因组比对、进化树构建等方法，分析流感病毒NA基因在不同时间、地区等条件下的变化规律。

四、研究意义
本研究将有助于：
1. 建立流感NA基因真核表达模型，为了解病毒变异机制提供技术支持；
2. 探究流感病毒NA基因的进化规律，促进对流感病毒的认识与预测；
3. 为流感病毒预防和治疗提供理论基础。

五、研究难点和创新点
本研究的难点在于NA基因的DNA克隆和真核表达、重组蛋白的纯化和质量保证，以及序列进化分析的方法和数据处理。

创新点在于将基因克隆、蛋白表达和序列进化
分析相结合，全面了解流感病毒NA基因的特性。

专利名称：H3N2亚型流感病毒全基因组测序方法专利类型：发明专利
发明人：李晓丹,朱兆奎,赵百慧
申请号：CN201710764255.9
申请日：20170830
公开号：CN107488743A
公开日：
20171219
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种H3N2亚型流感病毒全基因组测序方法，该方法针对季节性H3N2亚型流感病毒PB2,PB1,PA,HA,NP,NA,MP和NS基因保守区域设计了覆盖基因全长(开放读码框)16对共32条寡核苷酸引物序列，如SEQ ID No.1～SEQ ID No.32所示，并在正反向扩增引物的两端增加了M13正反向引物序列，简化了基因扩增后的测序反应步骤。

同时公开了待检样本的处理、RT‑PCR反应体系及反应条件、测序反应体系和反应条件。

本发明可以实现对我国大陆流行的H3N2亚型流感病毒全基因组扩增,从而获得H3N2亚型流感病毒的全基因组序列信息，操作简单、应用方便，为我国流行的季节性H3N2亚型流感病毒病原学研究及分子进化分析提供了可行的技术方法。

申请人：上海伯杰医疗科技有限公司
地址：201321 上海市浦东新区芙蓉花路500弄2号楼1-2层
国籍：CN
代理机构：上海汉声知识产权代理有限公司
代理人：郭国中
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中国病原生物学杂志2021年2月第16卷第2期Journal o f Pathogen Biology Feb. 2021，Vol. 16，No. 2• 193 •DOI：10. 13350/j. cjpb. 210213 •调查研究. 2019年南宁市季节性甲型H3N2流感病毒流行情况及H A和N A遗传特性分析*范云燕，覃健敏…，欧嵩风，汤洪洋，石健(南宁市疾病预防控制中心.广西南宁530023)【摘要】目的分析南宁市2019年H3N2流感病#流行情况及血凝素（H A)基因和神经氨酸酶基W(N A)分子特征，及时掌握本地流感病毒流行动态和进化方向，为流感治疗及疫苗株的筛选提供科学依据。

方法从全球共享禽流感数据倡议组织（G IS A ID)数据库获得2019年南宁市H3N2 H A和N A全长核苷酸序列。

用MEGA V7. 0和Interactive Tree of Life V5 (iT O L V5)软件构建系统发育树.利用NetN G lycl. 0软件预测H A、N A基因搪基化位点，用DNAstar V8. 1. 3软件对流感病毒的H A和N A同源性、氨基酸变异情况进行分析。

结果14株流感病毒的H A和N A基因在系统发育树上均聚成4个类群.进化分类基本一致。

本地毒株H A、N A基因与2019 — 2020年疫苗毒株A/K a n s a s/14/ 2017同源性较低。

与A/K ansas/14/2017相比.14个毒株H A基因449位点发生突变，导致糖基化位点的减少，1个毒株在142位点增加一个糖基化位点,>N A基因无搪基化位点的变化。

相对于A/K a n s a s/14/2017,南宁毒株H A1区蛋白分子上有6(135、137、144、159、160和190)个的氨基酸发生了替换，且涉及到2〜3个抗原决定簇位点；受体结合位点突变主要集中在2个位点；N A基因有1个抗原位点整体发生突变，耐药位点非常保守。

一株H5N2亚型流感病毒的全基因组序列分析及致病性的研究李文辉;关立峥;张芳;王晶;卢昆鹏;施建忠;邓国华;陈化兰【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2014(036)003【摘要】本研究对2012年从我国南方的鸭群环境水样品中分离到的一株低致病性H5N2亚型流感病毒EN/HuN/S3794/2012(H5N2)进行全基因组序列和进化分析、抗原性差异分析及致病性试验.序列分析显示:其HA片段裂解位点无多个连续碱性氨基酸,具有低致病性流感病毒的特征.该病毒基因组序列与A/DK/HuN/S4120/2011 (H5N2)全基因组核苷酸序列高度同源,同源性在97.4 ％～99.3％之间,抗原性分析结果表明,该分离株与H5亚型流感病毒参考株抗原性差异较大.以106 EID50/100 μL剂量鼻腔感染4周龄SPF鸡及SPF鸭,病毒滴定未检测到病毒存在,表明该病毒不能在SPF鸡和SPF鸭体内有效复制;以106 EID50/50 μL剂量鼻腔感染6周龄BALB/c小鼠,脏器滴定结果显示,仅在肺脏中检测到病毒,小鼠体重无明显变化,表明该病毒分离株对小鼠感染能力弱,呈低致病性.【总页数】4页(P178-181)【作者】李文辉;关立峥;张芳;王晶;卢昆鹏;施建忠;邓国华;陈化兰【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室,黑龙江哈尔滨150001【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.一株野鸟源H9N2亚型禽流感病毒的全基因组序列分析及致病性研究 [J], 张芳;王晶;卢昆鹏;肖丽;彭志;崔鹏飞;关立峥;邓国华;陈化兰2.一株鸭源H8N4亚型禽流感病毒分离株的全基因组序列分析及致病性的研究 [J], 王晶;张芳;卢坤鹏;关立峥;肖丽;彭志;邓国华;陈化兰3.一株鸭源H5N2禽流感病毒全基因组序列分析及对鸡的致病性研究 [J], 朱占松;张曦;崔鹏飞;谭丹;关立峥;李文辉;邓国华;陈化兰4.一株鸭源H6N6亚型禽流感病毒的全基因组序列分析及对小鼠的感染性研究 [J], 范威峰; 陈化兰; 崔鹏飞; 崔嘉琦; 谷文丽; 张元成; 邢鑫; 孔兴天; 彭大新; 邓国华5.一株低致病力H5N3亚型禽流感病毒的全基因组序列分析及其对小鼠的感染性研究 [J], 邢鑫;崔鹏飞;崔嘉琦;谷文丽;张元成;范威峰;仲启鑫;邓国华;陈化兰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

2007-2017年中国甲型H3N2流感病毒HA基因特征分析徐姿;柯美霞;崔大伟;王胜军【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2018(36)12【摘要】目的回顾性分析2007-2017年我国人感染季节性甲型H3N2流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)的分子特征,为我国甲型H3N2流感病毒的防控和疫苗的研发提供科学依据.方法从全球共享禽流感数据库(the global initiative on sharing avian influenza data,GISAID)中下载中国2007-2017年人感染季节性甲型流感病毒H3N2亚型毒株HA基因序列,利用MEGA7.0生物学信息软件分析其HA的分子特征.结果 2007-2017年,中国甲型流感病毒H3N2亚型共1 991例,总体上病毒株数呈逐渐递增趋势.HA序列分析表明,甲型H3N2流感病毒的亚型存在多样性且多种亚型共存,3C.2a.1系的病毒株自2010年起逐年增多,2016年起成为最主要的流行优势株.1系、2系、3A系、3B系、3C.1系、3C.2系、3C.2a系、3C.2a.1系、3C.3系、3C.3a系和3C.3b系的同源性分别为94.0％～ 100.0％、96.7％～ 100.0％、94.3％～ 100.0％、94.9％～100.0％、94.6％～100.0％、95.4％～ 100.0％、95.1％～ 100.0％、93.3％～100.0％、97.5％～ 100.0％、95.3％～ 100.0％和94.6％～ 100.0％.HA蛋白关键位点N121K、G/R142K出现变异,268株发生N121K突变且主要来源于2017年的毒株,358株发生G/R142K突变且主要来源于2016年和2017年的毒株.结论甲型H3N2流感病毒的亚型存在多样性,多种亚型共存且不同年份间的优势流行株存在差异,这些将有助于疫苗的研发和疾病的防控.【总页数】5页(P937-941)【作者】徐姿;柯美霞;崔大伟;王胜军【作者单位】江苏大学医学院,江苏镇江212013;江苏大学附属昆山医院检验科,江苏昆山215300;江苏大学医学院,江苏镇江212013;浙江大学医学院附属第一医院输血科,杭州310003;江苏大学医学院,江苏镇江212013【正文语种】中文【中图分类】R446.6【相关文献】1.江西省2009年至2012年甲型H3N2流感病毒耐药性分析 [J], 李健雄;熊英;施勇;龚甜;周珺;徐刚2.重庆市2009～2014年甲型 H1N1流感病毒分离株 HA基因变异分析 [J], 叶盛;喻臻;陈爽;凌华;熊宇;李勤3.湖北省2007~2012年 H3N2流感病毒 HA基因及抗原性分析 [J], 梁杨;霍细香;方斌;刘琳琳;陈盛杰;刘准;陈丹4.辽宁省2016～2017年甲型H3N2亚型流感病毒耐药性分析 [J], 孙海波;刘双;宋亦春;王璐璐;孙佰红;毛玲玲;孙英伟5.吉林省2018-2020年甲型H3N2亚型流感病毒耐药基因分析 [J], 李静;柳鸿敏;侯程程;吴东林;杨显达因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

H3N2亚型犬流感病毒重组HA1蛋白间接ELISA检测方法的建立黄柏槐;张敦伟;远立国;张桂红;李守军【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2012(034)009【摘要】为建立一种H3N2亚型犬流感病-毒(CIV)血清学检测方法,本研究利用CIV重组HA1蛋白作为检测抗原,建立H3N2亚型CIV抗体的间接ELISA检测方法,并优化反应条件.通过检测阴性血清样本30份确定其临界值为0.228.该方法与抗猪流感病毒H1N1、H1N2、H6N6、H9N2的阳性血清和犬瘟热病、犬细小病、犬副流感的阳性血清均无交叉反应.变异系数在1.01％～7.52％之间,具有较好的重复性.通过对150份临床样品进行检测并与血凝抑制试验检测结果比较,总符合率为98.6％.本研究为CIV流行病学调查提供了一种快速、方便、敏感的抗体检测方法.%In this study, an indirect ELISA method for detection of Canine influenza virus (CIV) was developed by using purified recombinant HA1 protein of the virus as coating antigen. It had no cross reaction with positive serum of H1, H6, H9 subtypes of swine influenza virus, and canine distemper virus, canine parvovirus, canine parainfluenza virus. The coefficient variation was between 1.01 and 7.52. A total of 150 clinical samples was detected by the established protocol and compared with hemagglutination inhibition (HI) test. The coincidence rate was 98.6%. The results showed that this indirect ELISA was specific and sensitive for CIVantibody, which would provide a convenient method in studies on the epidemiology and surveillance of canine influenza.【总页数】4页(P711-714)【作者】黄柏槐;张敦伟;远立国;张桂红;李守军【作者单位】华南农业大学兽医学院,广东广州510642;广州医药工业研究院,广东广州510240;华南农业大学兽医学院,广东广州510642;华南农业大学兽医学院,广东广州510642;华南农业大学兽医学院,广东广州510642【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.H3N2亚型猪流感病毒重组HA1蛋白间接ELISA诊断方法的建立 [J], 丁选亚;乔传玲;陈艳;杨焕良;辛晓光;韩庆功;陈化兰2.犬流感病毒重组核蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立 [J], 李陆涛;袁子国;孙凌霜;涂黎晴;闫中山;李秀珍;李守军3.H3N2亚型犬流感病毒HA1基因的原核表达及抗原性分析 [J], 张敦伟;熊永忠;远立国;贾坤;张桂红;李守军4.H3N2亚型犬流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立及应用 [J], 秦海斌;温海;贺星亮;宋珍华;朱骞;包喜军;蒿阳;张艳龙5.H5亚型猪流感病毒HA1重组蛋白的制备及间接ELISA检测方法的建立 [J], 尹可;郭军庆;黄杰;黎满香;周继勇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

1995～2005年中国H3N2亚型人流感病毒血凝素基因变异与流行相关性研究董丽波;张烨;温乐英;赵翔;黄维娟;蓝雨;郭俊峰;李梓;王敏;董婕;郭元吉;舒跃龙【期刊名称】《病毒学报》【年(卷),期】2007(23)5【摘要】为了探讨中国H3N2亚型人流感病毒血凝素基因变异与流行关系，对1995～2005年中国分离的550株H3N2流感病毒的HA1序列进行分析。

HA1基因进化树显示出以很长的主干和很短的侧枝为特征。

HA1的氨基酸位点变异主要位于5个已知的抗原位点及其附近，同时其它位点也有改变。

通过对HA1序列资料分析发现这期间导致H3N2流行的序列改变的三种可能，第一种是同时出现多位点变化，第二种是位点变化逐渐发生累积到多个位点变化，第三种是单个抗原位点和受体结合位点同时改变，均可以引起H3N2流行。

【总页数】6页(P339-344)【关键词】A型流感病毒;血凝素;变异【作者】董丽波;张烨;温乐英;赵翔;黄维娟;蓝雨;郭俊峰;李梓;王敏;董婕;郭元吉;舒跃龙【作者单位】中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心传染病预防控制国家重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R373.2【相关文献】1.2011-2015年广东省H3N2亚型流感病毒血凝素基因变异和进化分析 [J], 梁丽君;倪汉忠;张欣;曾宪鍫;邹丽容;李来庆;宋颖超;黄平;武婕2.无锡地区流感病毒病原学监测及H3亚型血凝素基因变异研究 [J], 尤凤兴;沙丹;吴庆刚;季亚勇;居丽雯;马广源;张敬平;施强;吉杏生;吴家林;凌霞;肖勇3.日照市流感病毒流行及H3N2亚型血凝素和神经氨酸酶变异情况研究 [J], 李超;刘颂;赵真真;王笑峰4.2015—2017年上海市浦东新区H3N2亚型流感病毒流行特征与基因变异分析[J], 赵冰;叶楚楚;邹文玮;马平;刘青;孙乔;郝莉鹏;朱林英5.2014-2015年商洛市流感病毒H3N2亚型血凝素(HA1)基因进化研究 [J], 齐延亮;史伟;段勇波;徐纪茹;戴侃记;张芳芳;余鹏博因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。