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一、实验目的1. 了解脾脏在免疫系统中的作用。
2. 掌握脾切除手术的操作步骤及注意事项。
3. 观察脾切除后动物生理变化，分析脾脏对机体的影响。
二、实验原理脾脏是人体最大的淋巴器官，具有过滤血液、清除病原体、产生抗体和调节免疫反应等作用。
脾切除实验可以模拟脾脏缺失的状态，研究脾脏在免疫系统中的作用。
三、实验材料与仪器1. 实验动物：小白鼠2. 仪器：手术刀、手术剪、手术钳、镊子、剪刀、注射器、生理盐水、消毒液等3. 药品：肝素、抗生素等四、实验步骤1. 动物麻醉：使用肝素进行动物麻醉，确保实验过程安全。
2. 脾脏暴露：沿腹中线切开皮肤，暴露腹壁肌肉，分离肌肉组织，暴露腹腔。
3. 脾脏游离：用手术剪和手术钳分离脾脏周围组织，使脾脏与周围器官分离。
4. 脾脏切除：用手术剪将脾脏与脾蒂分离，用手术钳夹住脾蒂，切断脾蒂，取出脾脏。
5. 缝合创口：用生理盐水清洗创面，用消毒液消毒，用可吸收线缝合腹壁肌肉和皮肤。
6. 抗生素预防感染：术后给予抗生素预防感染。
五、实验观察与结果1. 术后观察：观察动物的精神状态、活动能力、饮食、呼吸等生理指标。
2. 实验结果分析：（1）术后初期，动物出现食欲不振、精神萎靡、活动能力下降等症状。
（2）术后第3天，动物开始恢复食欲，精神状态好转，活动能力逐渐恢复。
（3）实验过程中，未发现动物出现严重并发症。
六、实验讨论1. 脾脏在免疫系统中的作用：脾脏是人体最大的淋巴器官，具有过滤血液、清除病原体、产生抗体和调节免疫反应等作用。
脾切除实验表明，脾脏在机体免疫系统中具有重要作用。
2. 脾切除后的生理变化：脾切除后，动物出现食欲不振、精神萎靡、活动能力下降等症状。
这是因为脾脏在免疫系统中的作用减弱，导致机体免疫力下降。
3. 脾切除手术的注意事项：在进行脾切除手术时，应确保动物麻醉充分，避免手术过程中动物挣扎，造成手术风险。
同时，手术过程中应严格无菌操作，预防术后感染。
七、结论脾脏在人体免疫系统中具有重要作用。
实验二小鼠脾细胞提取及计数一、介绍本次实验整体情况（8：00－8：05，5分钟）：本次实验的操作包括三部分：包被和封闭ELISA板、眼球取血、脾细胞的提取及计数。
其中包被和封闭ELISA板以及眼球取血是为实验三ELISA实验做准备。
ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）酶联免疫吸附试验具体原理下次课讲解。
二、包被和封闭ELISA板：备注：提前10分钟到实验室发放包被和封闭ELISA板所用试剂1. 讲解内容(8：05－8：15，10分钟)包被和封闭ELISA板是为下一次实验酶联免疫吸附试验（ELISA）做准备。
包被就是将已知抗原或抗体吸附于固相载体表面并保持其免疫原性。
在ELISA 板上加上抗原以后，因为电荷数与板不同，所以抗原吸附板上，但是吸附后固相载体表面尚有未被占据的空隙；封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而防止在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。
下面介绍如何包被ELISA反应板及微量加样器使用注意事项。
（1）包被ELISA板：1) 试剂和器材（老师已经在ELISA板上统一标记好）a. pH9.6的碳酸盐缓冲液 ;b. 绵羊红细胞抗原－SRBC;（a和b为包被液，实验室老师已经配好）c.聚乙烯塑料板，微量加样器2) 操作方法a. 包被液：碳酸盐缓冲液1：200 稀释抗原SRBC；b. 聚乙烯塑料板：8孔/2人，每孔加100ul包被液，37度恒温2小时。
（2）微量加样器使用方法及注意事项(让学生自己操作一下，老师教学生看量程):1) 量取样品时选择适当量程的加样器，（P20： 0.5～20.0µl；P200： 20～200 µl； P1000：200～1000 µl）。
老师结合不同型号的微量加样器，指导如何读数，白色由左至右读数，黑/蓝色由上至下读数。
2)转动旋钮，调整量取体积。
顺时针旋转增加体积，逆时针减少体积。
小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离
“小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离”实验过程
1. 培养皿加入纱布，在纱布上滴2ml淋巴细胞分离液。
2. 脱颈处死小鼠，在75%酒精中浸泡30s(示意消毒小鼠)。
3. 无菌条件下将腹部剪开，脱皮。
(2min)
4. 选取小鼠腹部左侧，剪开腹膜，深红色细长组织即脾脏（淋巴细胞组织）
5. 用镊子从下方夹取脾脏，，剔除结缔组织和脂肪后，将组织置于滴有小鼠淋巴细胞分离液的纱布上。
6. 脾脏用弯头镊子在纱布上研磨至无血色组织后，纱布上加入1ml淋巴细胞分离液，再用移液器吸取研磨的液体，移至1.5ml离心管内。
(3min)
7. 离心（1500rpm,3min）留上清，移入新的15ml 离心管中，去除红细胞，此时可以取胸腺。
(可以做到这里停止，示意淋巴细胞和免疫器官胸腺)
8. 在装有上清的离心管中加入3ml 1640培养基，离心1500rpm，3min，取沉淀，弃上清，重复清洗2次。
（6min）
9. 在显微镜下将细胞浓度调为5×106个/ml备用。
从小鼠脾脏平分别淋巴细胞
１小鼠断颈处逝世,酒精浸泡５分钟,超净台内打开左侧腹部皮肤,当心分别皮下组织和腹部肌肉吐露出脾脏,提起,剪去四周结缔组织,放入有PBS的小瓶中.无菌镊子夹碎,挤压脾脏,将获得的细胞悬液移入无菌试管中.２另取无菌试管,先参加淋巴细胞分别液,然后将试管竖直,略放平,汲取方才制备的细胞悬液迟缓的参加试管中,一般分别液和细胞悬液的体积比为１：２,要轻要慢,不冲要破了淋巴细胞分别液和细胞悬液的界面.选用合适本身分别目标细胞的离心力和时光进行离心.小我用1500转/分钟,20分钟.３离心后掏出试管,可以看到不合的分层,一般上面长短细胞成分和细胞碎片,接下来是单个核细胞,再往下是红细胞等.吸走上层非细胞层弃之,吸出单个核层在别的无菌试管中,因为淋巴细胞分别液对细胞有毒性感化,参加PBS 离心洗两遍（PBS1000转/分钟,10分钟）.４,洗好的细胞参加１６４０造就液和２０％的血清中重悬,迟缓参加已经制备好的尼龙毛柱子中,封好,放３７度孵育一小时.一小时后掏出,超净台内将柱子立起,针头下面放无菌试管（我们的柱子是用大号打针器做的）,以HANKS液和血清先后迟缓冲洗,巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来,B细胞也相对吸附冲洗下来的不久不多,所以冲洗来的大多是T细胞,纯度可打到８０％到９０％,再次冲洗并且用力挤压,如许得到的就是B细胞.得到的细胞可以以１６４０加血清配制的造就液进一步造就或做它用.但是淋巴细胞分别液得到的细胞只能算是粗分,假如试验请求高最好选用磁珠或
流式分别.。
尼龙膜分离脾脏，5mlPBS重悬脾脏单个细胞+5ml淋巴细胞分离液，玻璃管中2000rpm 水平离心20min。
（其间只要接触到脾脏细胞的大枪头都不要换，可准备一个一次性手套，再利用的枪头可以打在里面）。
吸取中间细胞层于新玻璃管中，PBS洗2遍，1500rpm，5min。
用500ul 8%1640重悬细胞，进行细胞计数，调整细胞数为相同浓度（5*106个/ml，即5*105 个/孔。
不得少于2-3*105 个/孔）铺96孔板。
每只老鼠的脾脏做3个孔重复，若做MTT，可加阴性对照，同样三个孔重复。
加入猪瘟病毒抗原（细胞毒或血毒都可）刺激，2ul血毒/孔，培养72h后吸取上清检测IL-4 和IFN-γ含量。
下层细胞可做MTT。
剩余的细胞，水平离心，弃去营养液，用PBS重悬后，加入三色抗体，孵育30Min 后，离心洗1-2次（看细胞数决定），底部细胞用1%胎牛血清的PBS重悬可以保存一夜。
解刨小鼠提取脾细胞实验报告
解刨小鼠提取脾细胞实验报告
一、实验目的
本实验旨在通过解刨小鼠，提取脾细胞，以便进行后续的免疫学研究。
二、实验材料和仪器
1. 实验材料：小白鼠、生理盐水、70%乙醇、福尔马林、石蜡等。
2. 实验仪器：手术刀、注射器、组织培养皿、显微镜等。
三、实验步骤
1. 解剖小白鼠：将小白鼠放入无菌条件下，用70%乙醇消毒表面。
然后用手术刀在胸部进行切口，打开胸腔，找到心脏，将心脏割断。
接
着将小白鼠向上抬起头部，用手术刀在颈部进行切口，打开颈部皮肤
和肌肉层，在颈动脉两侧夹住气管和食管，并清除周围组织。
最后将
气管和食管割断，并将颈动脉及其分支全部割断。
2. 取出脾脏：用注射器注入生理盐水，将脾脏从周围组织中分离出来，然后将脾脏放入组织培养皿中加入生理盐水洗涤。
3. 细胞处理：将清洗干净的脾脏放入福尔马林中固定30分钟，再用酒精和石蜡等物质进行包埋。
最后用显微镜观察并提取细胞。
四、实验结果
通过本实验，成功地解剖出小白鼠，并提取了脾细胞。
经过显微镜观察，我们可以看到细胞形态正常，并且数量充足。
五、实验注意事项
1. 实验操作要求严格无菌。
2. 解剖小白鼠时要保持手术刀的锋利度。
3. 在取出脾脏时要注意不要损伤其结构。
4. 细胞处理过程中要避免污染。
六、实验结论
通过本实验，我们成功地解剖了小白鼠并提取了脾细胞。
这为后续的免疫学研究奠定了基础。
同时，在操作过程中也需要注意无菌和仪器使用等方面的细节。
流式细胞分析和混合淋巴细胞反应实验中
小鼠脾脏的摘取
最近老婆要提取脾脏细胞做流式，我就做个简单的解说，也顺便传到网上供菜鸟理解，如果有大神看到这篇文章，也欢迎指导。
大家一起讨论，把实验做得更好。
无论是做混合淋巴细胞反应或者流式细胞分析都要用到脾脏。
小鼠的脾脏摘取颇为简单，但有很多同学是第一次接触，所以在此做一个简单的图文讲解。
在此讲解不甚详细，具体步骤请同学参照网上已有各种protocol,本文重点在于图文解说，让大家对照图片和其他protocol更好的理解脾脏的摘取。
一，小鼠处死后泡酒精2-3分钟，泡久了细胞会缩水，泡的时间短了起不到消毒杀菌的作用
二，摆好小鼠体位，取右侧卧位。
三，沿着小鼠左侧肋骨走行方向做切口。
准备眼科镊和眼科剪若干（文中笔者使用眼科直镊3把，眼科剪2把）
四，向小鼠左后背方探查，在皮下很浅的地方可见深红色脾脏。
脾脏走行向与肋骨方向近似平行
五，用镊子轻轻提起脾脏。
脾脏下会连着许多结缔组织，轻轻把它们撕掉。
六，完整摘下脾脏，放于培养皿中【事先在培养皿中放入PBS （混淋）或红裂（流式）和200目的铁丝网】如下右图所示，银色的为本步骤中使用的铁丝网，白色的为后面要用到的过滤膜
七，一把新的眼科剪和一把新的眼科镊（新消毒过的。
本文所用的为新高压的），把脾脏在培养皿里剪成小块。
然后用2.5ml或5ml注射器柄，把脾脏研磨成细胞。
研磨过程要轻柔，否则会损伤脾脏中的细胞。
八，研磨至培养皿中不见整块脾脏，只剩一些不能磨碎的结缔组织为止。
九，再加入4ml红细胞裂解液，冲洗铁丝网，注射器内芯，并用枪头吹打混匀，裂解5min 十，将液体一并转入15ml离心管中，400g,5min,离心
十一，弃去上清，加入5ml含10%FBS的1640 ,重悬, 用装有200目的尼龙滤膜过滤(可过滤两次); 尼龙滤膜就是第六步中右图的白色滤膜。
十二，滤液离心400g,5min,弃上清，加入1ml含10%FBS的1640,重悬混匀，稀释50(20+980)倍计数，；
至此，脾脏细胞就算提取完成了。
后面几步没有上图，但做过实验的同学很容易就能理解是怎么回事啦。
