核酸探针标记

探针标记方法大全1、DNA的缺口平移法缺口平移是一种快速、简便、成本相对较低以及生产高比活性均一标记DNA的方法。

该技术可以制备序列特异的探针。

当使用重组质粒探针时，虽然任何形式的双链DNA都可以进行缺口平移标记。

但通常使用限制性核酸内切酶将插入片段进行酶切和凝胶电泳纯化后再进行缺口平移标记。

此外，用这种探针进行杂交可产生较低的背景信号。

2、DNA的随机引物法这种方法是使用寡核苷酸引物和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段来标记DNA片段。

这种方法可代替缺口平移产生均一的标记探针外，还在许多方面优于缺口平移法，比如标记核苷酸在DNA探针中的掺入率可达50％以上。

由于在反应过程中加入的DNA片段不被降解，故在随机引物反应中加入的DNA可少于200 ng，甚至10 ng也能有效地标记。

DNA片段的大小不影响标记的结果。

标记物沿所加入的全长DNA被均等地掺入。

标记的探针可以直接使用而不需要去除未掺入的核苷酸；单链双链DNA都可作为随机引物标记的模版。

随机引物可用于较小的DNA片段（100~500 bp），而缺口平移法对大DNA片段（>1000 bp）效果最好。

随机引物法的主要缺点是产生的标记探针量比缺口平移的要少些，此外环状DNA不能有效地标记，必须先用限制性内切核酸酶线形化或用碱法或DNA酶Ⅰ产生缺口。

3、RNA的体外转录法体外转录法标记RNA探针可用于商品化转录质粒来制备。

这些质粒中应该包括SP6、T3、或T7 RNA聚合酶的RNA启动位点和，而这些启动位点则与多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）相邻。

4、RNA的寡脱氧核苷酸法克隆质粒pSP64、pGEM-3、pGEM-4等含邻近MCS的SP6RNA启动子，可作为从DNA寡核苷酸模版产生RNA探针的基础。

这两种标记方法产生探针量大，而且产生的探针不受载体序列的影响，所需要的线性化的质粒DNA大约1 ug，但需要高纯度的模板。

常用核酸探针标记方法1、切口平移法（nick translation）原理：先用适量的DNase I 在Mg2+存在下，在双链DNA 上打开若干个单链缺口。

利用E. coli DNA 聚合酶I 的5'- 3' 核酸外切酶活性在切处将旧链从5’-末端逐步切除。

同时DNA 聚合酶I的5'- 3'聚合酶活性的作用下，顺序将dNTP连接到切口的3’-末端-OH上，以互补的DNA 单链为模板合成新的DNA单链。

图1 切口平移法原理示意图特点：1）各种螺旋状态（超螺旋、闭环及开环）及线性的双链DNA均可作为缺口平移法的标记底物。

但单链DNA和RNA不能采用此方法进标记。

双链DNA小片段（>100-200bp）也不是此法标记的理想底物。

2）DNA多聚酶必须是E·Coli DNA多聚酶的全酶。

3）DNA模板要用纯化过DNA2、随机引物法（random priming）原理：将待标记的DNA探针片段变性后与随机引物一起杂交，然后以此杂交的寡核苷酸为引物，大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（E·Coli DNA polymerase I Klenow Fragment）的催化下，合成与探针DNA互补的DNA链。

当反应液中含有标记的dNTP时，即形成标记的探针。

图2 随机引物标记法原理示意图特点：1）除了能进行双链DNA标记外，也可用于单链DNA和RNA探针的标记。

2）所得到的标记产物是新合成的DNA单链，而所加入的DNA片段本身并不能被标记。

3）新形成的标记DNA单链的长度与加入寡核苷酸引物的量成反比，因为加入的寡核苷酸数量越多，合成起点也越多，得到的片段的长度也越短。

按标准方法得到的标记产物长度一般为200-400bp。

3、末端标记与切口平移法和随机引物法不同，DNA末端标记法并不将DNA片段的全长进行标记，而是只将其一端（5’或3’端）进行部分标记。

其特点是可得到全长DNA片段，DNA片段并非均匀标记，标记活性不高。

核酸探针的原理及应用1. 导言核酸探针是一种用于检测和鉴定核酸分子的分子探针。

它通过特异性识别目标核酸序列，可广泛应用于基因组学、生物医学研究、临床诊断等领域。

本文将介绍核酸探针的原理和应用。

2. 核酸探针的原理2.1 核酸杂交原理核酸探针的原理基于核酸的互补配对特性。

当目标核酸序列与探针的互补序列相遇时，它们之间会发生杂交反应。

杂交后，探针会与目标核酸形成稳定的双链结构，从而实现对目标核酸的特异性识别和检测。

2.2 核酸标记技术核酸探针通常需要标记以便于检测。

常用的核酸标记技术包括荧光标记、放射性标记和酶标记等。

这些标记可以通过特定的检测方法，如荧光显微镜、放射性测量和酶反应等，来检测探针与目标核酸之间的杂交情况。

2.3 核酸探针的设计核酸探针的设计需要考虑多个因素，包括目标序列的长度、杂交条件、标记方式等。

探针的长度应足够长以确保与目标序列的特异性结合，同时要避免与非目标序列的杂交。

此外，探针和目标序列的杂交温度、盐浓度等条件也需要进行优化。

3. 核酸探针的应用3.1 基因组学研究核酸探针在基因组学研究中扮演着重要角色。

通过使用特异性的核酸探针，可以对基因组进行定位、定序和变异等研究。

同时，核酸探针也可用于基因表达分析和基因功能研究，例如通过反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术检测目标基因的表达水平。

3.2 生物医学研究核酸探针可用于生物医学研究中的疾病诊断和治疗。

例如，在肿瘤学研究中，核酸探针可以用于检测肿瘤相关基因的异常改变，从而实现早期诊断和治疗监测。

此外，核酸探针还可用于检测病毒和细菌感染，诊断遗传性疾病等。

3.3 临床诊断核酸探针在临床诊断中有着广泛应用。

通过对特定的核酸序列进行检测，可以实现对疾病的早期筛查和诊断。

常见的应用包括艾滋病病毒检测、乙肝病毒检测、人类乳头瘤病毒（HPV）检测等。

核酸探针的应用具有高度特异性和灵敏性，可以提供准确的诊断结果。

4. 总结核酸探针作为一种重要的生物技术工具，具有广泛的应用前景。

地高辛标记核酸探针的标记方法Last revision on 21 December 2020地高辛标记核酸探针的标记方法核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。

最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。

而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。

近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。

另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。

在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。

由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。

与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。

地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。

其化学结构如图1 所示。

采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR法将其掺入到DNA探针中。

RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。

寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3'末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。

对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。

核酸探针的名词解释
嘿，咱今天就来聊聊核酸探针这玩意儿！你知道吗，核酸探针就像
是一个超级侦探，专门去寻找特定的核酸序列。

比如说吧，就好像你
在一个超级大的图书馆里找一本特定的书，核酸探针就是那个能精准
找到那本书的小能手！
它是一小段经过标记的核酸分子，这个标记就像是给它装上了一个
闪闪发光的信号灯。

然后呢，它就可以和目标核酸序列特异性地结合。

这就好比是一把钥匙开一把锁，可准了呢！
咱举个例子啊，想象一下，细胞里面的核酸就像是一群人，而核酸
探针就是那个能准确找到特定那个人的高手。

它能一下子就抓住目标，然后通过那个标记，让我们知道它找到了。

核酸探针的作用可大了去了！它可以用来检测病毒、细菌，还能在
基因诊断中发挥重要作用。

比如说，当我们怀疑身体里有某种病毒的
时候，核酸探针就能快速地找到它，告诉我们是不是真的有。

这多厉
害啊！
在科学研究中，核酸探针也是不可或缺的。

研究人员用它来探索基
因的功能，就像探险家在未知的领域寻找宝藏一样。

你说，核酸探针是不是超级神奇？它就像是一个默默无闻却又超级
厉害的小英雄，在我们看不见的地方发挥着巨大的作用。

总之，核酸探针就是那个能在核酸世界里精准定位、发挥关键作用的神奇存在！它是现代生物学和医学的重要工具，为我们解开生命的奥秘提供了有力的支持。

没有它，很多事情我们可都没法做呢！。

标记探针制备
标记探针制备方法是一种用于生物学和医学研究的重要技术，它使用标记探针（例如核酸、碳水化合物或蛋白质）来克隆、检测和定位特定的DNA序列或蛋白质。

该技术在遗传学、分子生物学、转基因研究、微生物学和药物发现等领域有着广泛的应用。

标记探针制备的过程主要包括几个步骤：
1. 选择目标序列：首先，研究者需要选择他们想要克隆或检测的特定DNA序列或蛋白质序列作为标记探针的目标序列。

这可以通过搜索数据库或通过任何其他方法实现。

2. 合成标记探针：接下来，研究者可以使用任何一种合成技术（例如PCR、合成DNA或全基因组合成）来合成标记探针，以实现对特定序列的克隆和检测。

3. 加入标记物：研究者可以使用任何一种方法将标记物（如核酸、荧光素或放射性同位素）加入到已经合成的标记探针中，以便将其与特定序列区分开来。

4. 纯化探针：最后，研究者可以使用纯化技术将标记探针从其他成分中纯化出来，以便用于实验。

标记探针制备技术的使用有助于研究者更好地深入理解和研究人类基因组的结构和功能，也有助于研究者更
快、更准确地确定他们感兴趣的物种的基因组结构，从而为药物发现和基因治疗等应用提供更多有用的信息。

地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。

地高辛标记的探针是一种非放射性探针。

1设计 Digoxigenin 标记探针的引物。

每种血清型在保守区域设计一对通用引物。

2 标记探针合成(引物来源上述）
（1）各血清型阳性质粒模板的扩增。

（2）利用引物，通过PCR《参照罗氏公司 PCR DIG Probe Synthesis Kit说明书》，合成标记探针。

（3）电泳、回收、纯化和定量
3 核酸斑点杂交检测
（1）其他病毒核酸作对照，12种血清型PCR扩增产物。

（2）将12种探针和探针PM（混合探针）与同一血清型不同含量的核酸用常规方法进行核酸杂交。

4.显色。

核酸探针技术的原理和应用引言核酸探针技术是一种重要的分子生物学工具，通过利用特异性的核酸序列与待测样品中的目标序列进行特异性配对，从而实现对目标序列的检测和定量分析。

本文将介绍核酸探针技术的原理以及其在生物学研究、医学诊断和药物开发等领域的应用。

一、核酸探针技术的原理核酸探针技术利用两条互补的核酸分子之间的碱基配对原理，通过标记的核酸序列与待测样品中的特定目标序列进行靶向配对。

该技术的原理主要包括以下几个方面：1.互补配对：核酸分子由四种碱基（腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤和胞嘧啶）组成，它们之间可以通过碱基配对形成双链结构。

腺嘌呤与胸腺嘧啶之间形成两个氢键，鸟嘌呤与胞嘧啶之间形成三个氢键。

根据这种碱基配对原理，核酸探针可以与目标序列中的特定碱基序列进行互补配对。

2.标记物：核酸探针常常需要进行标记以便于检测。

常用的标记物包括荧光染料、放射性同位素、酶和磁珠等。

标记物的选择取决于具体的实验需求和检测方法。

3.检测方法：核酸探针技术可以通过不同的检测方法进行信号的读取和分析。

常见的检测方法包括荧光检测、放射性测量、酶促反应和磁性检测等。

这些方法可以实现对标记物信号的定量分析和可视化显示。

二、核酸探针技术的应用核酸探针技术具有高灵敏度、高特异性和高选择性的优势，被广泛应用于各个领域。

以下是核酸探针技术在生物学研究、医学诊断和药物开发等领域的应用：1.基因表达分析：核酸探针技术可用于研究基因的表达模式、调控机制和功能。

通过对目标基因的探针设计和合成，可以检测该基因在不同组织、细胞或条件下的表达水平。

2.病毒检测：核酸探针技术在病毒检测中具有重要意义。

例如，针对新型冠状病毒（COVID-19）的核酸探针被广泛应用于病毒的快速检测和筛查。

3.癌症诊断：核酸探针技术可用于癌症诊断和预后评估。

通过检测肿瘤标志物的核酸序列，可以快速、准确地判断患者是否患有癌症，以及癌症的类型和分级。

4.药物研发：核酸探针技术在新药研发中发挥重要作用。

核酸探针技术及应用基因检测技术的发展，使对某些疾病的诊断达到了特异性强、敏感性高及简便快速的目的。

近年来各种血清学方法发展很快，但血清学方法主要是测抗体，是间接的证据随着分子生物学的发展，应用DNA—DNA杂交建立了核酸探针(Probe)技术，该技术是目前基因检测最常用的方法，目前已成为诊断各种感染性疾病，恶性肿瘤，遗传病，检测抗生紊的耐药性，法医学鉴定及从分子水平上研究发病机制与流行病学规律等方面的一种重要手段。

本文主要介绍了核酸探针技术的原理，核酸分子杂交方法及核酸探针的应用等方面。

一、核酸探针技术的原理DNA 或RNA 片段能识别特定序列基因的DNA 片段，能与互补的核苷酸序列特异结合，这种用同位素非同位素标记的单链DNA片段即为核酸探针。

核酸探针技术是将双链DNA 经加热或硷处理，使硷基对间的氢链被破坏而变性，解开成两条互补的单链。

它们在一定温度和中性盐溶液条件下，又可按A—T，G—C碱基配对的原则重新组合成双链为复性。

这种重组合只是在两股DNA是互补(同源)或部分互补(部分同源)的条件下才能实现。

正是由于双链DNA的这种可解离与重组合的性质，才可用一条已知的单链DNA，用放射性同位素或其他方法标记后制备成核酸探针，与另一条固定在硝酸纤维素滤膜上的变性单链DNA进行杂交，(另一条DNA链与核酸探针是配对碱基，称为靶)再用放射自显影或其他显色技术检测，以确定有无与探针DNA (或RNA)同源或部分同源的DNA(或RNA)存在。

因为探针只与靶病原体的DNA或RNA杂交，而不与标本中存在的其他DNA 或RNA 杂交。

二、核酸探针技术的基本方法被检标本用去污剂和酶分解以去除非DNA成分或直接提取DNA，用各种方法处理DNA使其变性，把DNA双螺旋的两条链分开，单链DNA结合于固态基质上，(如滤膜)使其固定。

再加上已制备好的探针进行杂交，探针便可找出已固定的DNA中的互补序列，与之配对结合，然后洗掉未结合部分，由于探针已将放射性同位素掺入，再用x射线敏感的胶片自显影，见黑色影印者即为阳性。