四氯化碳致小鼠急性肝损伤模型建立与考察

肝损伤动物模型研究进展内容摘要：肝疾病；毒物，四氯化碳；醋氨酚；疾病模型，动物肝损伤是各种肝脏疾病的病变结果，对肝损伤的防治目前仍是一个严峻的课题。

通过建立实验性肝损伤动物模型，研究肝病的发生机制，筛选保肝药物，探索保肝作用原理，具有重要的现实意义。

现将近年来国内外对实验性肝损伤动物模型分类、作用原理、造模方法及其优缺点等研究进展作综述和探讨。

1化学性肝损伤动物模型1.1四氯化碳（carbontetrachloride,CCl4）CCl4导致肝损伤的主要机制目前认为与其自身和自由基代谢产物有关。

CCl4代谢产生的自由基进入机体后，在肝脏经细胞色素P450激活，生成三氯甲基自由基和三氯甲基过氧自由基，攻击肝脏细胞膜上的磷脂分子，使得细胞膜、内质网膜发生氯烷化和脂质过氧化，损伤细胞膜、细胞器；还能与膜脂质和蛋白质大分子进行共价结合，影响蛋白质代谢，并且破坏膜结构和功能的完整性，钙离子内流增加，影响细胞正常生理功能，最终导致肝细胞胞质中的可溶性酶渗出，细胞死亡[1]。

CCl4所致肝损伤可分为急性和慢性。

急性肝损伤：赖力英等应用4mL/kgCCl4剂量灌胃可诱发SD大鼠急性肝功能衰竭，死亡率达85%[2]。

慢性肝损伤：Zhang等采用2mL/kgCCl4腹膜内注射SD大鼠，每周2次，持续9周可伴有肝细胞坏死和明显炎症的肝硬化[3]。

CCl4导致肝损伤是经典模型之一，能准确反应肝细胞功能、代谢及形态学变化，重复性好且经济。

但CCl4同时还损伤动物的心、脾、肺、肾、脑等器官，另外，蒸汽和液体可由呼吸道、皮肤吸收，对人体也有一定毒性，操作时应注意。

1.2α萘基异硫氰酸酯(αNaphthylisothiocyanate,ANIT)ANIT是一种间接肝毒剂，其主要损害是通过膜脂质过氧化反应，致使肝细胞变性、坏死、胞内血清谷丙转氨酶(ALT）大量溢入血流，同时还导致胆管上皮细胞肿胀坏死，引起毛细胆管增生及小叶间胆管周围产生炎症，从而造成胆管阻塞，形成明显的胆汁淤积，并伴随以点状坏死为主的肝实质细胞损害，产生梗阻性黄疸，出现高胆红素血症和胆汁分泌减少。

一、四氯化碳急性肝损伤模型[造模原理]四氯化碳(CCl4 )是无色透明液体,不溶于水.CCl4的毒性主要与其活性代谢产物有关.在肝内CCl4惊NADPH和肝微粒体细胞色素P450混合功能氧化酶的作用,生成活泼的三氯甲基自由基和氯自由基.这些自由基能与细胞内和细胞膜上大分子发生共价结合,引起富含不饱和脂肪酸的生物膜发生脂质过氧化,导致膜结构和功能完整性的破坏,肝细胞损伤坏死.三氯甲基自由基还能抑制细胞膜和微粒体膜上该泵的活性,食Ca2+内流增加,从而引起细胞中毒死亡;三氯甲基自由基能与蛋白质形成共价键,损害线粒体,使还原型辅酶Ⅰ(NADH)及ATP在肝内生成减少,脂肪酸氧化抑制,影响肝脏能量生成障碍,并使三酰甘油和脂肪酸在肝细胞内蓄积.[实验动物]体重18-22g的小鼠、体重150-180的大鼠或体重4-45kg的家兔.[操作方法]用CCl4 在不同动物可以多种方法引起急性肝损伤.一般用花生油将CCl4 稀释为所需浓度. CCl4 致急性肝损伤所需剂量和用法见表8-1[模型评价与注意事项]1.( CCl4肝损伤模型是最常用的急性肝损伤模型,造模方法简单,成功率高,重复性好，价格低廉。

2．CCl4剂量不宜过大，以免造成动物中毒死亡。

3：CCl4是无色澄清的有毒液体，有特殊气味，难溶于水。

CCl4 一般用花生油、橄榄油、豆油等植物油混合成所需浓度，有时也可与矿物油(如液体石蜡)混合。

以植物油为例，10％CCl4的配制方法是：取5ml植物油和5g阿拉伯胶，置于乳钵中研匀，再加lOml纯CCl4。

研匀，然后加蒸馏水lO~15ml调成乳状，最后加蒸馏水至lOOml，用前摇匀。

4．用CCl4复制肝损伤模型的主要缺点是,不同动物个体肝损伤的程度差异较大. 还有研究表明，小鼠接受CCl4后肝脏病理学改变与血清ALT等生化指标改变的相关性不如大鼠好。

5 CCl4 液体和蒸气可以从呼吸道、皮肤吸收,对人体有一定毒性，操作时应注意防护.二、D-半乳糖胺急性肝损伤模型[造模原理]D-半乳糖胺(D-galactosamine)引起急性肝损伤的机制尚不完全清楚。

急性肝损伤对药物作用的影响【目的】1、学习制作CCl4肝损伤模型。

2、观察肝损伤时对地西泮药效的影响。

3、观察肝损伤时肝脏大体病理形态的改变。

4、检测肝损伤时肝脏谷丙转氨酶（ALT）的活性。

【器材】紫外可见光分光光度计1台，恒温振荡水浴器1台，台式高速离心机1台，小鼠笼及饮水瓶2套，组织剪1把， 1ml注射器3只，250ml烧杯1只，一次性试管（5ml）6支，试管架4个，1.5mlEP管8个，苦味酸1瓶，冰块1盆，鼠料1包，垫料1包。

【药品】20% CCl4溶液，地西泮注射液，ALT（谷丙转氨酶）检测试剂盒，生理盐水200ml，蒸馏水100ml。

【动物】雄性昆明小鼠8只，体重25~30克。

【方法】每组4只小白鼠，饲养于同一鼠笼中。

2只作为对照；2只作为CCL4肝损伤模型动物，以苦味酸号标记。

1、CCl4肝损伤动物模型的制作：模型组小白鼠腹腔注射0.1ml/10g 的20%CCl4溶液，对照组小白鼠腹腔注射0.1ml/10g的生理盐水。

饲养过夜。

2、CCl4肝损伤对地西泮催眠作用的影响：24h后，取对照组和模型组小白鼠各1只，分别腹腔注射5mg/ml地西泮50mg/kg。

观察并记录其入睡时间（翻正反射消失时间）。

3、肝脏大体病理形态观察：入睡小鼠颈椎脱臼处死，取肝脏，观察大体病理形态（颜色、结构等变化）。

4、血清制备：取对照组和模型组小白鼠各2只，断头取血，收集到EP管中，静置10分钟，4000rpm离心10分钟，取上清50ul，稀释10倍为待测样品。

5、血清ALT测定：ALT活性计算公式：C样=（A样/A标）× C标C：浓度（活性单位U/L），A：吸光度值， C标为100 U/L【结果】1、CCl4肝损伤对地西泮催眠作用的影响（数据以x±s表示，做组间t检验）实验组别地西泮入睡时间（S）生理盐水组215.40±70.47CCl4肝损伤组59.35±14.89t检验过程:（1）建立检验假设，确定检验标准H0：μ1=μ2,两组不同处理实验小鼠注地西泮后入睡时间的总体均数相同H1：μ1≠μ2,两组不同处理实验小鼠注地西泮后入睡时间的总体均数不相同ɑ=0.05（2）计算检验统计量由原始数据计算得：n1=20,∑X1=4308 ∑X²1=1027254 ¯X1=215.4n2=20,∑X2=1187 ∑X²274885 ¯X2=59.35运用统计学公式计算得：S²c=(n1-1)S²2+(n2-1)S²2/（n1+n2-2）=2730.19S¯x1-¯x2=16.5233算得t=|¯X1-¯X2|/S¯x1-¯x2=9.444(3)确定P值，作出推断结论V=n1+n2-2=38；查t界值表得，t0.05/2,38=2.024,t0.01/2,38=2.712,本例t> t0.01/2,38,P<0.01，差异有统计学意义,拒绝H0，接受H1，故可认为CCl4肝损伤对地西泮催眠作用有影响。

一、实验目的1. 了解急性肝损伤的实验方法及原理。

2. 掌握急性肝损伤动物模型的建立方法。

3. 学习观察肝损伤指标的变化，评估肝损伤程度。

4. 探讨不同药物对急性肝损伤的保护作用。

二、实验原理急性肝损伤是指由多种因素导致的肝脏急性损伤，如药物、毒素、酒精等。

本实验采用CCl4诱导的小鼠急性肝损伤模型，通过观察肝功能指标的变化，评估肝损伤程度，并探讨不同药物对急性肝损伤的保护作用。

三、实验材料1. 实验动物：ICR小鼠，体重18-22g，雌雄不限。

2. 试剂与仪器：CCl4、橄榄油、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）试剂盒、酶标仪、离心机等。

四、实验方法1. 实验分组：将60只ICR小鼠随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组、模型组、阳性对照组、药物高剂量组、药物中剂量组和药物低剂量组。

2. 建立急性肝损伤模型：除正常对照组外，其余各组小鼠按20mg/kg剂量腹腔注射CCl4橄榄油溶液，正常对照组注射等体积的橄榄油。

3. 给药：阳性对照组给予联苯双酯（200mg/kg），药物高、中、低剂量组分别给予不同剂量的药物，正常对照组和模型组给予等体积的生理盐水。

4. 样本采集：给药后24小时，各组小鼠眼球取血，分离血清，测定ALT、AST和TBIL。

5. 数据处理：采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，组间比较采用单因素方差分析。

五、实验结果1. 各组小鼠ALT、AST和TBIL水平比较：与正常对照组相比，模型组ALT、AST和TBIL水平显著升高（P<0.01）；与模型组相比，阳性对照组和药物高、中、低剂量组ALT、AST和TBIL水平均显著降低（P<0.01）。

2. 药物对急性肝损伤的保护作用：与模型组相比，药物高、中、低剂量组ALT、AST和TBIL水平均显著降低，且呈剂量依赖性。

六、实验结论1. 本实验成功建立了CCl4诱导的小鼠急性肝损伤模型。

笔筒草对四氯化碳所致急性肝损伤小鼠保肝作用研究[摘要]目的探讨壮药笔筒草醇提物对ccl4所致小鼠急性肝损伤的作用。

方法采用ccl4腹腔注射造成急性肝损伤模型，将小鼠随机分成6组（空白对照组、模型组、联苯双酯阳性药组和笔筒草高、中、低剂量组），观察各剂量组对小鼠血清谷丙转氨酶（gpt）及谷草转氨酶（got）的影响。

结果与模型相比，给药组能降低gpt、got活性，联苯双酯模型组及笔筒草醇提取高、中、低剂量组均有显著性差异。

结论笔筒草对于ccl4所致小鼠急性肝损伤具有一定的保肝降酶作用。

[关键词]急性肝损伤；笔筒草；四氯化碳[中图分类号] r285.5 [文献标识码] a [文章编号] 2095-0616（2013）02-28-02笔筒草，又称节节草（equisetum ramosissimum），为木贼科木贼属植物，全草入药。

主要分布于东北、云南、贵州、陕西、甘肃等地，也分布于世界热带、亚热带地区[1]。

笔筒草主要成分为黄酮等[2]，中药学记载木贼有利尿作用，之前有文献报道过木贼草合剂治疗急性黄疸型肝炎有较好效果[3]。

近年来，药理实验表明本科植物具有抗心肌缺血、降血压、调血脂、降血糖的作用。

本实验通过研究笔筒草醇提物对于ccl4所致的急性肝损伤降酶保肝作用，为进一步研究保肝壮药，筛选其合理的组方提供科学实验依据。

1 材料与方法1.1 实验动物昆明小鼠（spf级），雌雄兼用，体重18～22 g，2月龄，共90只，购自广西医科大学实验动物中心，动物证号（scxk桂2009—0002）。

研究所用笔筒草采自广西南宁市老虎岭水库，经过广西中医药大学壮医药学院韦松基教授鉴定为木贼科木贼属植物笔筒草equisetum ramosissimum全草。

采集回来经打粉机打碎后过40目筛，其有效成分采用渗漉法提取，溶剂为95%乙醇。

1.2 药物及试剂ccl4（成都市科龙化工试剂厂，批号：20110222）；花生油（鲁花一级压榨花生油）；氯化钠注射液（贵州科伦药业有限公司，批号：8110101g）；got试剂（南京建成生物工程研究所批号：20110616）；gpt试剂（南京建成生物工程研究所，批号：20110616）；联苯双酯滴丸（浙江万邦药业有限公司，批号：101207）。

蚯蚓活性组分对四氯化碳诱导小鼠内质网应激所致急性肝损伤的保护作用該研究旨在探讨蚯蚓活性组分（EWAs）对四氯化碳（CCl4）诱导小鼠内质网应激（ERS）所致急性肝损伤的保护作用。

腹腔注射10%CCl4制备内质网应激所致急性肝损伤模型；血清生化指标检测ALT，AST，SOD，GSHPX酶活性及MDA含量变化；计算肝、脾指数；HE染色观察肝脏病理学变化；TUNEL法检测肝组织细胞凋亡情况；免疫组织化学法检测ERS标志性蛋白GRP78和CHOP 表达情况；Western blot法检测ERS相关蛋白的表达水平。

结果显示，与模型组小鼠相比，EWAs的高、中、低剂量组血清学各项指标均有显著改善（P＜005或P＜001），肝脏病变范围减小，且损伤程度明显减轻，小鼠肝脏指数和脾脏指数均有明显变化（P＜005或P＜001）；各剂量给药组的肝组织细胞凋亡指数明显下降（P＜005或P＜001）；肝组织中ERS相关蛋白GRP78和CHOP表达水平显著降低（P＜005或P＜001），各剂量给药组均能显著下调GRP78和CHOP以及CHOP上游信号通路PERKeIF2αATF4的蛋白表达（P＜005或P＜001）。

综上，EWAs对ERS所致的小鼠急性肝损伤具有显著保护作用，其机制可能通过抑制氧化应激和ERS，从而减轻肝脏损伤，并可下调ERS标志性凋亡蛋白CHOP表达，抑制细胞凋亡实现的。

标签：蚯蚓活性组分；内质网应激；肝损伤；GRP78；CHOP[Abstract]To study the protective effect of earthworm active ingredients（EWAs）against endoplasmic reticulum stress（ERS）induced acute liver injury in mice. The model of liver injury was induced through intraperitoneal injection of 10%CCl4. Serum glutamicpyruvic transaminase（ALT），glutamicoxaloacetic transaminase （AST），superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GSHPX）activity and malondialdehyde（MDA）concentration were detected by colorimetric method. Histological examination was performed through hematoxylineosin staining and light microscopy，and apoptosis was detected using terminal transferase dUTP nick end labeling. The expressions of ERS related proteins，including glucose regulated protein 78（GRP78），protein kinase Rlike ER kinase（PERK），eukaryotic transcription initiation factor 2α（eIF2α），active transcription factor4（ATF4）and CCAAT/enhancer binding homologous protein（CHOP），were measured by immunohistochemistry and Western blot. According to the results，compared with the model group，serological indexes in the high，middle and low doses of EWAs were significantly improved （P＜0.05 or P＜0.01），the extent of liver lesion was decreased and the degree of injury was significantly reduced，and that the liver index and the spleen index of mice were significantly changed（P＜0.05 or P＜0.01）. In liver tissue，the expressions of GRP78 and CHOP were significantly decreased（P ＜0.05 or P＜0.01）. The protein expressions of GRP78，CHOP and its upstream signaling pathway PERKeIF2ATF4 were significantly decreased in each dose group （P＜0.05 or P＜0.01）. In summary，EWAs has a significant protective effect onERSinduced acute liver injury，and its mechanism may be correlated with the inhibition of oxidative stress and ERS，and downregulation of ERS marker protein CHOP expression，andinhibition of apoptosis.[Key words]EWAs；ERS；liver injury；GRP78；CHOP肝脏疾病是影响人类健康最为常见的疾病之一，从传统中药或食物中寻找有效部位或有效成分治疗肝脏疾病已成为目前研究的热点[1]。

热带医学杂志2010年6月第10卷第6期·实验研究论著·[文章编号]1672-3619（2010）06-0657-03基金项目：广东省科技厅科研项目（No．2008A060202003）；广东省食品药品监督管理局资助项目（No．ZA20081206）。

作者简介：黎旸（1969－），男，主管药师，主要从事药品安全性评价工作。

*通讯作者：李瑾翡（1966－），女，主任药师，主要从事药品安全性评价工作。

肝损伤是导致药物从市场撤除的最常见的单个原因［1］，药物造成的肝损害是药物安全监管的一个重点。

在药物质量事件应急检验中，为了快速有效的评价目标药物是否导致急性肝损伤，需要使用急性肝损伤动物模型。

药物诱导的急性肝损伤有多种类型和原因，其中CCl 4肝损伤模型是一种经典的实验研究模型［2］，一般认为这种方法重复性好，但研究发现，在相同条件下，造模效果有很大的差别，本实验旨在探讨动物性别、给药剂量、测定方法、动物质量因素对CCl 4造成肝损伤模型效果的影响，为药品肝毒性应急检验做好方法学研究。

1材料与方法1．1药品和试剂CCl 4为广州化学试剂厂生产，AR 级，批号为20030601；花生油，市售，批号为20090827；机测ALT 、AST试剂盒为中生北控生物科技有限公司产品，批号分别为GBA09134、GTM09161；手测ALT 、AST 试剂盒为上海复星长征医学科学有限公司产品，批号分别为P081213、P080663。

1．2动物SPF 级NIH 种小鼠，体重为25～30g ，动物合格证号为2007A004，购于广东省医学实验动物中心，实验动物生产许可证号为SCXK （粤）2008－0002，实验动物使用许可证号为SYXK （粤）2004－0050。

1．3仪器日立7020型全自动生化测定仪；美国PERKINELMER 紫外分光光度计，型号为LAMBDA25。

1．4方法CCl 4致小鼠急性肝损伤模型的研究黎旸，李瑾翡，蒋忠军，许姿敏，阮浩澜（广东省药品检验所，广州510180）【摘要】目的建立稳定的CCl 4小鼠急性肝损伤动物模型。

四氯化碳致急性肝损伤的原理及模型建立一些肝毒索已经成功地应用于肝衰竭的诱导。

目前常用的肝毒素主要有D．Gal、醋氨酚、CCl4等。

D．Gal肝损伤模型的病理改变与人类病毒性肝炎的病理改变较为接近，肝外毒性不明显，剂量范围易控制，但有潜在的不可逆性，同时因为D．Gal价格昂贵，大型动物猪或犬建立模型时所用剂量较大，重复率并不十分理想，也无临床相关的药物中毒，所以限制了它在大型动物造模方面的应用。

CCl4是一种对肝细胞有严重毒性作用的化学物质。

目前认为其导致肝损伤的主要机制与四氯化碳自身和其自由基代谢产物有关，、CCl4在肝内经细胞色素P450 2El代谢产生毒性代谢产物。

CCl4自身的溶酶作用可导致肝细胞损伤，但这仅限于高浓度的CCl4。

CCl4的自由基导致肝损害的过程被认为是主要的机制。

榍文海等报道用杂种犬，将cache与等量花生油混合溶液，以0．9ml／kg一次腹腔注射建立犬暴发性肝功能衰竭模型。

结果，注射CCl4后犬里进行性肝功能衰竭表现，第72 h血丙氨酸转氨酶、总胆红素、血氨明显升高，凝血酶原时间延长，血糖降低，(均P<0．01)；脑电图检查出现异常波型。

第7d病理检查显示：肝细胞大片溶解坏死，网状支架大部分存在，肝细胞轻度增生。

暴发性肝功能衰竭形成率为93．0％。

动物48～96h死亡率73．O％，14d内肝损害明显恢复。

动物一般表现，实验室及组织学检查表明，整个动物染毒过程，近似于人类的急性暴发性肝功能衰竭过程。

本模型具有以下特点：①动物受损后，经充分的时间，可以恢复到用药前水平，模型具有可逆性；②受损动物以72h为死亡高峰，第5d开始恢复，终点十分明确；③实验动物肝功能衰竭时间与死亡时间有一定间隔，具有适用性和可控制性；④CCl4经济可行，注意保护，对实验人员毒性不大，较为安全。

亚急性和慢性毒性：动物吸入400ppm，7小时/天，5天/周，173天，部分动物127天后勤部死亡，肝肾肿大，肝脂肪变性，肝硬化，肾小管上皮退行性病变。

竹节参总皂苷对四氯化碳诱导小鼠肝损伤的影响目的探讨竹节参总皂苷对四氯化碳（CCl4）诱导小鼠肝损伤的保护作用。

方法体外实验采用HepG2细胞株建立CCl4诱导肝细胞损伤模型。

体内实验采用1%CCl4油剂处理Balb/c小鼠造成急性肝损伤模型，随机分为正常组、模型组、药物组，药物组灌胃20 mL/kg竹节参总皂苷，正常组和模型组灌胃等量无菌生理盐水，连续8 d。

MTT法观察肝细胞存活状况，HE染色观察肝组织形态，RT-PCR 检测转化生长因子-β（TGF-β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和Toll样受体4（TLR4）mRNA表达。

结果与正常组比较，模型组存活细胞明显减少（P＜0.01）；与模型组比较，药物组存活细胞明显增多（P＜0.01）。

HE染色镜下观察，药物组小鼠肝组织损伤较模型组明显改善。

RT-PCR检测结果显示，与正常组比较，模型组TGF-β、TNF-α和TLR4 mRNA表达水平明显升高；与模型组比较，药物组TGF-β、TLR4、TNF-α mRNA水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。

结论竹节参总皂苷对CCl4诱导小鼠肝损伤具有保护作用。

Abstract：Objective To discuss the protection mechanism of total saponins from Panax japonicus on acute hepatic injury induced by carbon tetrachloride. Methods HepG2 cells were used to establish CCl4-induced liver cell injury model in vitro experiments. Mouse model of acute liver injury was caused by 1% CCl4 oil on Balb/c. Mice were randomly divided into normal group，model group and medicine group. Mice in the medicine group were given a gavage with 20 mL/kg total saponins from Panax japonicus，while mice in the other two groups were given a gavage with the same amount of stroke-physiological saline solution. MTT method was used to detect the activity of hepatic cells. The pathological changes of mouse liver were examined by HE staining. RT-PCR was used to detect changes in the expression of transforming growth TGF-β，TNF-α，and TLR4 mRNA. Results Compared with normal group，less hepatic cells survived in model group （P＜0.01）；compared with model group，more hepatic cells survived in medicine group （P＜0.01）. HE staining showed that damages in liver tissues of medicine group significantly improved than those in model group. RT-PCR results showed that the levels of TGF-β，TNF-α，and expression of TLR4 mRNA increased more significantly than those in model group；the expression of TGF-β，TNF-α，and TLR4 mRNA in medicine group decreased more significantly than those in model group，with statistical significance （P＜0.01）. Conclusion The total saponins from Panax japonicus has a protective effect on liver injury induced by carbon tetrachloride.Key words：acute hepatic injury；total saponins from Panax japonicus；HepG2 cell；mice竹节参为五加科植物竹节参Panax japonicus C. A.Mey.的干燥根茎，味甘、微苦，性温，归肝、脾、肺经，具有滋补强壮、散瘀止痛、止血祛痰功效，用于病后虚弱、劳咳咯血、咳嗽痰多、跌打损伤等。