建立急性肝损伤模型

第20卷第1期北华大学学报(自然科学版)Vol.20No.12019年1月JOURNAL OF BEIHUA UNIVERSITY(Natural Science)Jan.2019文章编号:1009-4822(2019)01-0055-04DOI :10.11713/j.issn.1009-4822.2019.01.011Con A 建立小鼠急性免疫性肝损伤模型研究单莹莹,王佳烨,王晓丽,于佳卉,王春梅,李㊀贺,孙红霞,张成义,陈建光,孙靖辉(北华大学药学院,吉林吉林㊀132013)摘要:目的㊀探讨刀豆蛋白A(Con A)诱导急性免疫性肝损伤小鼠模型的最适剂量及最佳给药途径.方法㊀选用雄性ICR 小鼠180只,分为尾静脉注射与腹腔注射两种给药途径,每个给药途径分为6组,对照组㊁Con A 10,20,30,40和50mg /kg 剂量组,Con A 各剂量组注射相应剂量的Con A,对照组注射生理盐水,在注射8h 后,检测各组血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的水平,采用苏木素-伊红(HE)染色法观察肝组织病理变化.结果㊀与对照组比较,腹腔注射Con A 各剂量组的ALT 和AST 水平无明显变化;尾静脉注射Con A 40mg /kg 剂量组的ALT 和AST 水平明显升高(P <0.05);组织学病理显示:肝损伤明显,Con A 10,20,30mg /kg 剂量组ALT 和AST 水平变化不明显,50mg /kg 剂量组死亡率较高.结论㊀小鼠尾静脉注射40mg /kg 的Con A 可成功诱导ICR 小鼠的急性肝损伤.关键词:刀豆蛋白A;免疫性肝损伤;小鼠中图分类号:R364.5文献标志码:A收稿日期:2018-05-13基金项目:吉林省科技计划项目(20170307016YY);吉林省教育科学技术研究项目(JJKH20180373KJ).作者简介:单莹莹(1994-),女,硕士研究生,主要从事抗炎免疫药理学研究,E-mail:a186********@;通信作者:孙靖辉(1979-),男,博士,副教授,主要从事抗炎免疫药理学研究,E-mail:sunjinghui2008@.Con A on Establishing Acute ImmunologicalLiver Injury Model in MiceShan Yingying,Wang Jiaye,Wang Xiaoli,Yu Jiahui,Wang Chunmei,Li He,Sun Hongxia,Zhang Chengyi,Chen Jianguang,Sun Jinghui(College of Pharmacy ,Beihua University ,Jilin 132013,China )Abstract :Objective To investigate the optimal dose and route of Con A administration on acute immunological liver injury in mice.Method 180ICR mice were divided into intraperitoneal and intravenous injection of two routes of administration.Each route was divided into control group,Con A 10,20,30,40,50mg /kg dose groups.The mice in Con A group were injected with Con A and those in control group were intraperitoneally injected with normal saline.After the administration for 8h,the levels of Aspartate aminotransferase (AST)and Alanine aminotransferase (ALT)were measured,the histomorphological liver were observed by hematoxylin and eosin (HE)stain.Results Compared with the control group,there were not significantly changed in the levels of AST and ALT by intraperitoneal injection.While in intravenous injection group,the levels of AST and ALT of mice in Con A 40mg /kg group were increased obviously and the histomorphological examination of liver indicated that there was an obvious injury,and those in Con A 10,20,30mg /kg groups were not significantly changed.The mortality rate was higher in 50mg /kg dose group.Conclusion Intravenous injection of 40mg /kg Con A can induce acute liver injury in ICR mice.Key words :Con A;immunological liver injury;mice㊀㊀肝脏疾病严重影响人类健康,目前进行肝脏疾病的治疗仍然是世界性的问题,建立与人类肝脏疾病病理机制相似的实验性肝损伤动物模型,有助于肝脏疾病发病机制的研究,因此,成功建立科学性㊁实用性㊁重现性良好的实验性肝损伤动物模型是研究肝病发生机制㊁筛选保肝药物㊁探索保肝作用的重要工具[1].近年来,国内外常用Con A建立急性免疫性肝损伤动物模型,而Con A的剂量并没有统一标准,干预时间也不一致,这对实验操作造成了一定的困难[2].为此,本研究以ICR小鼠为研究对象,观察尾静脉注射Con A建立急性肝损伤模型的适用剂量,为急性肝损伤模型建立时所用Con A的剂量选择提供参考.1㊀材料与方法1.1㊀实验动物雄性SPF级ICR小鼠(长春市亿斯实验动物技术有限公司,合格证号:SCXK(吉)2016-0003),体质量(22ʃ2)g.1.2㊀试剂与仪器刀豆蛋白A(Con A)Ⅳ型(美国Sigma公司);血清ALT,AST试剂盒(南京建成生物工程研究所);酶标仪(瑞士Tecan公司);荧光倒置显微镜(日本OLYMPUS公司).2㊀实验方法2.1㊀动物分组及给药雄性ICR小鼠180只,分为尾静脉注射与腹腔注射两种给药途径,每个给药途径分为6组:对照组㊁Con A10,20,30,40,50mg/kg剂量组,每组15只.将Con A各剂量组注射相应剂量的Con A,对照组注射同等体积的生理盐水,给药后小鼠禁食不禁水8h,取血和肝脏待测.2.2㊀血清ALT,AST的测定将血液3000r/min㊁离心10min以获得血清,按试剂盒说明书进行AST和ALT检测,运用酶标仪于520nm处测定吸光度值.2.3㊀肝组织病理切片的制备将肝组织放置在配好的福尔马林溶液中固定,石蜡包埋,切片,苏木素-伊红(H&E)染色,于显微镜下观察肝组织病理改变.2.4㊀统计学分析应用SPSS19.0软件进行统计分析,所有值均以平均值ʃ标准差(ʏxʃs)表示,以P<0.05为差异具有统计学意义,从P<0.01为差异具有显著统计学意义.3㊀结㊀㊀果3.1㊀Con A注射后各组小鼠死亡数量尾静脉注射Con A10,20,30,40mg/kg剂量组在8h内小鼠死亡0只,50mg/kg剂量组8h内小鼠死亡8只,腹腔注射Con A剂量组8h内小鼠未见死亡.3.2㊀Con A对各组小鼠血清ALT,AST含量的影响与对照组比较,在尾静脉注射Con A剂量为10,20,30mg/kg时,血清中AST与ALT的水平无明显差异,Con A剂量为40和50mg/kg时,血清中AST与ALT的水平明显升高(P<0.01).见表1.与对照组比较,腹腔注射Con A各剂量组血清中ALT 与AST水平未见明显变化.见表2.表1㊀尾静脉注射不同剂量Con A对小鼠血清中AST 及ALT含量的影响Tab.1㊀Effect of different dosages of Con A on AST and ALT levels in miceλ/(U㊃L-1)组别n AST ALT对照组1552.63ʃ12.5235.23ʃ3.41 Con A10mg/kg1558.74ʃ0.7538.15ʃ7.38 Con A20mg/kg1563.96ʃ10.7143.09ʃ10.33 Con A30mg/kg1567.22ʃ10.8945.94ʃ12.80 Con A40mg/kg15164.79ʃ18.09∗∗140.27ʃ19.35∗∗Con A50mg/kg15214.69ʃ38.39∗∗233.25ʃ30.65∗∗㊀注:与对照组比较,∗:P<0.05;∗∗:P<0.01表2㊀腹腔注射不同剂量Con A对小鼠血清中AST 及ALT含量的影响Tab.2㊀Effect of different dosages of Con A on AST and ALT levels in miceλ/(U㊃L-1)组别n AST ALT对照组1547.57ʃ8.9330.30ʃ8.71 Con A10mg/kg1551.71ʃ14.3634.31ʃ15.29 Con A20mg/kg1544.76ʃ23.0633.46ʃ16.27 Con A30mg/kg1548.32ʃ18.4335.38ʃ24.87 Con A40mg/kg1548.97ʃ27.3640.71ʃ22.70 Con A50mg/kg1552.93ʃ29.3637.96ʃ15.93㊀注:与对照组比较,∗:P<0.05;∗∗:P<0.013.3㊀Con A对各组小鼠肝脏病理组织学的影响在200倍光镜下,对照组肝组织形态大小正常,肝小叶结构清晰.与对照组比较,尾静脉注射Con A10,20,30mg/kg剂量组未见明显异常,40和50mg/kg剂量组出现大量淋巴细胞浸润,中央静脉充血,且可见大量肝细胞核破裂和凋亡小体,65北华大学学报(自然科学版)第20卷并可见片状坏死,肝小叶失去正常结构,肝索排列紊乱[3].见图1.腹腔注射Con A 50mg /kg 剂量组出现少量淋巴细胞浸润,中央静脉少量充血并可见少量肝细胞坏死,而其他各剂量组均未见异常.见图2.A:Control;B:Con A 10mg /kg;C:Con A 20mg /kg;D:Con A 30mg /kg;E:Con A 40mg /kg;F:Con A 50mg /kg;a:中央静脉;b:淋巴细胞图1尾静脉注射不同剂量Con A 对小鼠肝组织形态学的影响Fig.1Effect of different doses of Con A on morphology of liver tissue inmiceA:Control;B:Con A 10mg /kg;C:Con A 20mg /kg;D:Con A 30mg /kg;E:Con A 40mg /kg;F:Con A 50mg /kg图2腹腔注射不同剂量Con A 对小鼠肝组织形态学的影响Fig.2Effect of different doses of Con A on morphology of liver tissue in mice4㊀讨㊀㊀论Con A 作为一种植物凝集素,具有促进有丝分裂的作用,可以激活T 淋巴细胞,引起T 细胞介导的肝损伤,其损伤具有特异性和剂量依赖性[4].利用Con A 诱导小鼠特异性肝损伤模型是最近几年来新发展起来的,它的建立和应用为深入研究肝损伤发病机制以及对治疗药物筛选提供了非常方便和理想的试验动物模型[5].ALT 与AST 对肝脏疾病的检测有重要意义,ALT 存在于肝细胞胞质,AST 存在干细胞胞质与线粒体[6].当干细胞受损时,大量AST 与ALT 被释放入血,血清中的ALT 与AST 可以间接地反映肝脏受损程度,是最为经典的肝损伤检测指标[7].近年来,大量研究报道了Con A 诱导免疫性肝损伤动物模型的建立,但给药途径和注射剂量有很大差异,张炜等[8]研究发现:小鼠腹腔注射20mg /kg 的剂量能够成功建立急性肝损伤模型,马静[9]的研究结果表明:BALB /C 小鼠尾静脉注射11mg /kg 的Con A 可成功诱导肝损伤,刘悦晖等[10]研究结75第1期单莹莹,等:Con A 建立小鼠急性免疫性肝损伤模型研究果表明:尾静脉注射Con A20mg/kg能够成功诱导BALB/C小鼠的肝脏损伤.在本研究中,通过腹腔注射和静脉注射两种给药途径,结果显示:小鼠尾静脉注射40mg/kg的Con A后可见大量肝细胞凋亡坏死和明显的淋巴细胞浸润现象,并且血清中AST和ALT转氨酶水平明显升高,虽然50mg/kg的Con A也可引起明显的肝脏损伤,但死亡率较高.腹腔注射Con A的各个剂量组血清中AST和ALT水平均未出现明显变化,且组间数据离散程度较大,表明腹腔注射给药途径存在不稳定因素,不适宜进行进一步推广.于慧杰等[2]研究也证明了这一结果.因此,ICR小鼠尾静脉注射Con A40mg/kg建立急性免疫性肝损伤实验模型,具有稳定性高㊁死亡率低㊁损伤明显等特点,能够为今后急性免疫性肝损伤模型的建立提供参考.参考文献:[1]李红,于慧杰,盛国光.刀豆蛋白A诱导的C57BL/6J小鼠急性免疫性肝损伤模型的研究[J].中西医结合肝病杂志,2016,26(2):93-95,131.[2]于慧杰,李红,郭明星,等.ConA不同给药途径所致C57小鼠急㊁慢性肝损伤模型的建立与比较[J].湖北中医药大学学报,2014,16(4):5-7.[3]周琼,刘芳萍,刘颖姝,等.四氯化碳致小鼠急性肝损伤动物模型建立方法的研究[J].东北农业大学学报, 2012,43(6):77-81.[4]Kaneko Y,Harada M,Kawano T,et al.Augmentation of Vα14NKT cell mediated cytotoxicity by interleukin4in an autocrine mechanism resulting in the development of concanavalin A induced hepatits[J].J Exp Med,2000, 191(1):105-114.[5]Tiegs G,Hentschel J,Wendel A.A T cell-dependent experimental liver injury in mice inducible by concan-avalin A[J].Journal of Clinical Investigation,1992, 90(1):196-203.[6]张雯,黄磊,陈叶香,等.复方龙垂草水煎剂对CCl4致小鼠急性肝损伤的保护作用[J].中药新药与临床药理,2015,26(3):280-284.[7]刘慧敏,韩延忠,郭玉明,等.六味五灵片对刀豆蛋白A诱导的小鼠急性免疫性肝损伤的保护作用研究[J].中国药理学通报,2017,33(1):133-140. [8]张炜,陈明,傅涓涓.不同剂量刀豆蛋白A诱导Balb/c小鼠肝纤维化的量效关系[J].徐州医学院学报, 2007,27(6):375-378.[9]马静.刀豆蛋白A致肝损伤模型条件优化及痰热清注射液对其保护作用研究[A].中国毒理学会中药与天然药物毒理专业委员会.中国毒理学会中药与天然药物毒理专业委员会第一次(2016年)学术交流大会论文集[C].中国毒理学会中药与天然药物毒理专业委员会,2016:2.[10]刘悦晖,范学工,李宁,等.刀豆球蛋白A所致实验性肝损伤模型的构建[J].中国感染控制杂志,2008,7(5):297-301.ʌ责任编辑:陈丽华ɔ85北华大学学报(自然科学版)第20卷。

10种细胞损伤模型建立方法转载请注明来自丁香园发布日期：2012-10-09 14:36 文章来源：丁香园分享到：收藏夹新浪微博腾讯微博开心网豆瓣社区人人网关键词：细胞细胞培养技术专题义翘神州丁香园丁香通点击次数：997现在很多实验都涉及到细胞损伤模型的建立和运用，如CCl4诱导肝细胞损伤模型（体内、体外）、PC12细胞的NO和淀粉样蛋白(Aβ)损伤模型、神经元缺血再灌注损伤模型，以及脉络宁对骨骼肌缺血再灌注损伤保护作用等。

一、体外肝细胞损伤模型建立（CCl4和H2O2）1大鼠肝细胞的分离和培养大鼠4％戊巴比妥麻醉，门静脉插管，先以无钙灌流液灌流，继以37℃通入O2的Ⅳ型胶原酶灌流液继续循环灌流15 min。

将肝脏移至一平皿内，轻轻撕去肝包膜后，加入含5％小牛血清的清洗液，用吸管吹打成单个肝细胞悬液，200目尼龙网过滤，低速离心（500 r·min-1，1 min，4℃）弃上清，同法用清洗液反复洗3次。

然后用完全1640培养液（内含10％小牛血清，105U·L-1青霉素，100 mg·L-1链霉素和10 mg·L-1胰岛素）制成1×109个·L-1肝细胞悬液。

分离的肝细胞经0.6％台盼蓝拒染法测得细胞活力大于90％，高碘酸雪夫反应显示糖原法鉴定99％为肝实质细胞。

将上述肝细胞悬液分别加入24孔（每孔1 ml）和96孔（每孔0.1 ml）培养板中，置37℃，5％CO2培养箱中培养。

12～16 h后可见肝细胞贴壁于培养板孔底上生长。

2CCl4诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立肝细胞培养12 h后，吸弃上清，更换培养液并加入不同浓度的CCl4〔（1～16mmol·L-1），以少量的二甲亚砜助溶，二甲亚砜终浓度为0.1％（体积分数）〕，作用不同时间（1～12 h）后，收集24孔板中培养上清检测AST，以及肝细胞的MDA含量和GSHpx 活性；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反应。

一、实验目的1. 了解急性肝损伤的实验方法及原理。

2. 掌握急性肝损伤动物模型的建立方法。

3. 学习观察肝损伤指标的变化，评估肝损伤程度。

4. 探讨不同药物对急性肝损伤的保护作用。

二、实验原理急性肝损伤是指由多种因素导致的肝脏急性损伤，如药物、毒素、酒精等。

本实验采用CCl4诱导的小鼠急性肝损伤模型，通过观察肝功能指标的变化，评估肝损伤程度，并探讨不同药物对急性肝损伤的保护作用。

三、实验材料1. 实验动物：ICR小鼠，体重18-22g，雌雄不限。

2. 试剂与仪器：CCl4、橄榄油、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）试剂盒、酶标仪、离心机等。

四、实验方法1. 实验分组：将60只ICR小鼠随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组、模型组、阳性对照组、药物高剂量组、药物中剂量组和药物低剂量组。

2. 建立急性肝损伤模型：除正常对照组外，其余各组小鼠按20mg/kg剂量腹腔注射CCl4橄榄油溶液，正常对照组注射等体积的橄榄油。

3. 给药：阳性对照组给予联苯双酯（200mg/kg），药物高、中、低剂量组分别给予不同剂量的药物，正常对照组和模型组给予等体积的生理盐水。

4. 样本采集：给药后24小时，各组小鼠眼球取血，分离血清，测定ALT、AST和TBIL。

5. 数据处理：采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，组间比较采用单因素方差分析。

五、实验结果1. 各组小鼠ALT、AST和TBIL水平比较：与正常对照组相比，模型组ALT、AST和TBIL水平显著升高（P<0.01）；与模型组相比，阳性对照组和药物高、中、低剂量组ALT、AST和TBIL水平均显著降低（P<0.01）。

2. 药物对急性肝损伤的保护作用：与模型组相比，药物高、中、低剂量组ALT、AST和TBIL水平均显著降低，且呈剂量依赖性。

六、实验结论1. 本实验成功建立了CCl4诱导的小鼠急性肝损伤模型。

急性肝衰竭实验报告急性肝衰竭是指由于各种原因导致肝脏功能严重受损或完全丧失的一种疾病。

本实验旨在通过模拟急性肝衰竭的实验条件，探究其病理生理特点及可能的治疗方法。

实验材料和方法：1. 动物模型：使用小鼠作为实验对象，分为实验组和对照组。

2. 建立急性肝衰竭模型：实验组小鼠通过给予高剂量的丙种粗毛颗粒，引发急性肝损伤和衰竭；对照组小鼠接受生理盐水。

3. 观察指标：实验组和对照组小鼠的肝脏生理指标（如肝功能指标、肝组织病理变化等）的比较。

4. 治疗方法：实验组小鼠给予可能的治疗方法，如肝细胞移植、抗氧化剂等，观察其疗效。

实验结果：1. 急性肝衰竭模型的建立成功，实验组小鼠在丙种粗毛颗粒的作用下出现明显的肝功能损害，并伴有肝组织病理学特征的改变，如坏死、纤维化等。

2. 与对照组相比，实验组小鼠的肝功能指标显著升高，如肝酶（ALT、AST）水平的显著增高，胆红素水平的升高等，证实了急性肝衰竭的发生。

3. 实验组小鼠的肝组织切片观察发现，肝细胞形态的改变、坏死和纤维化的显著增加，伴有炎症细胞浸润等典型的病理学改变。

实验讨论：1. 急性肝衰竭的发生可能与丙种粗毛颗粒的毒性作用有关，该物质可能导致肝细胞的坏死和纤维化，从而导致肝脏功能衰竭。

2. 实验结果进一步印证了肝酶和胆红素等肝功能指标在判断急性肝衰竭中的重要性，这些指标可作为诊断和监测急性肝衰竭的重要参考依据。

3. 肝组织的病理变化揭示了急性肝衰竭的发生机制，包括细胞坏死、纤维化和炎症反应等。

这些变化提示了治疗的可能方向。

4. 在治疗方面，肝细胞移植和抗氧化剂等可能具有一定的疗效，然而还需要进一步研究和实验来验证其疗效。

结论：通过本实验，成功模拟了急性肝衰竭的动物模型，并观察到了该疾病的病理生理特点。

进一步的实验发现，肝酶和胆红素等肝功能指标对急性肝衰竭的诊断具有重要意义。

此外，肝细胞移植和抗氧化剂等治疗方法可能对急性肝衰竭有一定的疗效。

然而，还需要更多的实验研究来验证和完善这些治疗方法。

专利名称：内质网应激诱导小鼠急性肝损伤模型的建立方法专利类型：发明专利
发明人：刘浩,储菲,李晓明,董清清,蒋玉敏
申请号：CN201410019071.6
申请日：20140115
公开号：CN103735561A
公开日：
20140423
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明给出了一种内质网应激诱导小鼠急性肝损伤模型的建立方法，依次包括以下步骤：使用内质网应激诱导剂给小鼠灌胃，每只小鼠使用内质网应激诱导剂的用量为0.2ml/10g，给药后8～48小时，完成小鼠急性肝损伤模型的建立；所述的内质网应激诱导剂采用以下方法配制：取（0.5～4）mg衣霉素溶于100μl二甲基亚砜配成储存液；取100μl储存液加19.9ml双蒸水至20ml，完成内质网应激诱导剂的配制。

通过诱导内质网应激效应建立导致急性肝损伤的小鼠模型，对内质网应激作用机制的研究，既可以进一步了解细胞在应激状态下的自我调控能力，还可以进一步了解肝病的发生机制，从而对肝病采取一些新的干预、治疗措施，达到预防和治疗疾病的目的。

申请人：蚌埠医学院
地址：233030 安徽省蚌埠市东海大道2600号
国籍：CN
代理机构：蚌埠鼎力专利商标事务所有限公司
代理人：王琪
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肝损伤动物模型的造模方法
1. 化学物质诱导，这是最常用的方法之一，可以使用一些化学
物质如四氯化碳（CCl4）、醋酸乙酯（TAA）、二甲基硫醚（DME）
等来诱导肝损伤。

这些化学物质可以通过不同的途径进入动物体内，导致肝细胞损伤和肝功能异常。

2. 手术诱导，通过手术方法，可以直接对动物的肝脏进行切割、缺血再灌注等操作，从而引起肝损伤。

这种方法可以控制损伤的程
度和范围，适用于研究特定类型的肝损伤模型。

3. 遗传工程模型，利用转基因技术或基因编辑技术，可以构建
特定基因缺陷的动物模型，如肝细胞特异性基因敲除或过表达，从
而模拟特定的肝损伤情况。

4. 营养学诱导，通过控制动物的饮食，可以诱导脂肪肝、酒精
性肝病等肝损伤模型。

例如，高脂饮食可以导致脂肪肝，酒精饮食
可以导致酒精性肝病。

5. 辐射诱导，辐射也可以用来诱导肝损伤，如通过X射线或其
他辐射源对动物的肝脏进行照射，引起肝细胞的损伤和炎症反应。

总的来说，选择合适的肝损伤模型方法需要考虑研究的具体目的、动物种类、研究经费和实验条件等因素，并且在进行实验时需要严格控制实验条件，确保模型的可靠性和稳定性。

同时，也要遵守动物实验伦理规范，保障动物的福利和权益。

肝损伤模型的建立：1. 四氯化碳体外损伤肝细胞模型原代培养的正常大鼠肝细胞培养24h（贴壁良好）后，置培养皿于一密闭的塑料盒，内置四氯化碳0.4M容积，37度90min，造成肝细胞损伤的模型，后转入正常培养，进行下一步实验。

(即熏蒸法)肝细胞培养12h后，吸弃上清，更换培养液并加入CCL4 8mM（事先用DMSO溶解，DMSO终浓度1％），作用6h后收集24孔板中培养上清检测AST以及肝细胞MDA含量盒GSHpx活性，评价损伤程度。

（常用方法）2.醋氨酚体外损伤肝细胞模型肝细胞培养24h后，用清洗液洗2次，培养液洗1次，然后换以20mM醋氨酚的培养液，继续培养12h，取培养液，进行下一步实验。

3.过氧化氢体外损伤肝细胞模型肝细胞培养24h后，吸弃上清液，更换培养液并加入H2O2 0.6mM，作用1h后，收集24孔板中的培养上清液检测AST活性和MDA含量。

4.氰化钾缺氧肝细胞损伤模型肝细胞培养24h后，贴壁生长良好的肝细胞中加入氰化钾2.5mM，继续培养2h，定量检测培养液上清中LDH活性，以及酶的活性反应肝细胞损伤程度。

本模型可以更好的模拟缺氧损伤。

5.硫代乙酰胺（TTA）体外肝细胞损伤模型肝细胞预培养24h后，贴壁生长良好的肝细胞中加入TTA0.18mM，继续培养48h，肝细胞大量损伤和坏死，上清液中乳酸脱氢酶（LDH）活性升高，造成体外损伤肝细胞模型。

6.内毒素体外损伤肝细胞模型贴壁生长良好的肝细胞中加入内毒素70uL/mL，置37度，5％CO2培养此时上清LDH 活性升高造成肝细胞损伤模型，造成体外肝细胞损伤模型。

7.半乳糖胺（GalN）体外损伤模型分离肝细胞，预培养12-24h后，待细胞贴壁生长均匀后，加入5mMGalN的肝细胞培养液，继续培养1.5h，测定培养上清液中ALT，ALT显著升高时，肝细胞造模成功。

2.体外肝细胞损伤模型建立（CCl4和H2O2）1大鼠肝细胞的分离和培养大鼠4％戊巴比妥麻醉，门静脉插管，先以无钙灌流液灌流，继以37℃通入O2的Ⅳ型胶原酶灌流液继续循环灌流15 min。

急性肝损伤对药物作用的影响【目的】1、学习制作CCl4肝损伤模型。

2、观察肝损伤时对地西泮药效的影响。

3、观察肝损伤时肝脏大体病理形态的改变。

4、检测肝损伤时肝脏谷丙转氨酶（ALT）的活性。

【器材】紫外可见光分光光度计1台，恒温振荡水浴器1台，台式高速离心机1台，小鼠笼及饮水瓶2套，组织剪1把， 1ml注射器3只，250ml烧杯1只，一次性试管（5ml）6支，试管架4个，1.5mlEP管8个，苦味酸1瓶，冰块1盆，鼠料1包，垫料1包。

【药品】20% CCl4溶液，地西泮注射液，ALT（谷丙转氨酶）检测试剂盒，生理盐水200ml，蒸馏水100ml。

【动物】雄性昆明小鼠8只，体重25~30克。

【方法】每组4只小白鼠，饲养于同一鼠笼中。

2只作为对照；2只作为CCL4肝损伤模型动物，以苦味酸号标记。

1、CCl4肝损伤动物模型的制作：模型组小白鼠腹腔注射0.1ml/10g 的20%CCl4溶液，对照组小白鼠腹腔注射0.1ml/10g的生理盐水。

饲养过夜。

2、CCl4肝损伤对地西泮催眠作用的影响：24h后，取对照组和模型组小白鼠各1只，分别腹腔注射5mg/ml地西泮50mg/kg。

观察并记录其入睡时间（翻正反射消失时间）。

3、肝脏大体病理形态观察：入睡小鼠颈椎脱臼处死，取肝脏，观察大体病理形态（颜色、结构等变化）。

4、血清制备：取对照组和模型组小白鼠各2只，断头取血，收集到EP管中，静置10分钟，4000rpm离心10分钟，取上清50ul，稀释10倍为待测样品。

5、血清ALT测定：ALT活性计算公式：C样=（A样/A标）× C标C：浓度（活性单位U/L），A：吸光度值， C标为100 U/L【结果】1、CCl4肝损伤对地西泮催眠作用的影响（数据以x±s表示，做组间t检验）实验组别地西泮入睡时间（S）生理盐水组215.40±70.47CCl4肝损伤组59.35±14.89t检验过程:（1）建立检验假设，确定检验标准H0：μ1=μ2,两组不同处理实验小鼠注地西泮后入睡时间的总体均数相同H1：μ1≠μ2,两组不同处理实验小鼠注地西泮后入睡时间的总体均数不相同ɑ=0.05（2）计算检验统计量由原始数据计算得：n1=20,∑X1=4308 ∑X²1=1027254 ¯X1=215.4n2=20,∑X2=1187 ∑X²274885 ¯X2=59.35运用统计学公式计算得：S²c=(n1-1)S²2+(n2-1)S²2/（n1+n2-2）=2730.19S¯x1-¯x2=16.5233算得t=|¯X1-¯X2|/S¯x1-¯x2=9.444(3)确定P值，作出推断结论V=n1+n2-2=38；查t界值表得，t0.05/2,38=2.024,t0.01/2,38=2.712,本例t> t0.01/2,38,P<0.01，差异有统计学意义,拒绝H0，接受H1，故可认为CCl4肝损伤对地西泮催眠作用有影响。