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实验十PEG法诱导鸡血细胞融合

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鸡血细胞的体外融合

鸡血细胞的体外融合
鸡血细胞的体外融合
实验目的
实验原理 实验步骤
作
思
业
考
细胞生物学实验
实验原理：

东北师大 生科院
依据融合过程采用的助融剂 的不同，细胞融合可分为： 病毒诱导的细胞融合、化学 因子诱导的细胞融合、电场 作用下诱导的细胞融合。
实验目的
实验原理 实验步骤
作
思
业
考
鸡血细胞的体外融合
实验原理：

细胞生物学实验
业
考
细胞生物学实验
实验原理：

东北师大 生科院
体外细胞融合是细胞工程范畴的 概念，细胞融合(cell fusion)又称 体细胞杂交，是指用人工方法使 两个或两个以上的体细胞融合成 异核体细胞，随后，异核体同步 进入有丝分裂，核膜崩溃，来自 两个亲本细胞的基因组合在一起， 形成只含有一个细胞核的杂种细 胞（hybrid cell）。
1.绘出镜下观察到的细胞融合 情况。 2.计算细胞融合率。
实验目的
实验原理 实验步骤
作
思
业
考
鸡血细胞的体外融合
细胞生物学实验
思 考：
东北师大 生科院
试分析哪些因素可能影响 本实验的细胞融合率？
实验目的
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作
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鸡血细胞的体外融合
业
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鸡血细胞的体外融合
实验目的
实验原理 实验步骤
作
思
业
考
细胞生物学实验
作 业：
东北师大 生科院
（细胞融合率系指在显微镜的视野内， 已发生融合的细胞其细胞核总数与该视 野内所有细胞(包；括已融合的细胞)的 细胞核总数之比，称为融合率，通常以 百分比表示，而且要进行多个视野测定, 再加以平均统计，更为准确。 ）

鸡血细胞融合

鸡血细胞融合

《 PEG介导/鸡血细胞融合》实验报告姓名翟贞文院系生物2012级学号201117140189小组成员于诚慧，王瑞璞指导教师评阅教师实验目的：1.了解并掌握细胞融合的基本原理和操作。

2.了解细胞融合的应用范围3.尝试用细胞融合的观点解决生物问题4.练习光学显微镜的使用实验背景：通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cellfusion）或细胞杂交（cellhybridization）。

基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体（homokaryon）；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）。

同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称诱发融合。

诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电激和激光）。

某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusionprotein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。

化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。

目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。

PEG的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷脂的酰键及极性基团发生结构重排。

另一方面促进相邻细胞的磷脂双分子层融合。

在表面张力作用下，发生细胞融合。

再在细胞膜的修复功能与张力作用下，整合成一个多核细胞。

实验材料：配置好的鸡的红细胞悬液（Alsever溶液与鸡血细胞混合液，4：1）；PEG（分子量约为4000）；GKN溶液；生理盐水；光学显微镜；普通离心机；量筒；滴管等实验步骤：（1）混合好的鸡血悬浮液取1毫升，加3毫升生理盐水混匀（2）离心机离心12000r/min离心2min，而后弃去上清液，加4ml生理盐水，混匀后，离心2min,12000r/min（3）取血细胞沉淀(0.2ml),，加适量GKN溶液稀释为10%血细胞溶液.（4 配制不同浓度的PEG与血细胞混合液A 取细胞悬液1ml,加0.5PEGmlB.取细胞悬液0.5ml，加0.5PEGmlC.取细胞悬液0.5ml，加1.0PEGml作用30s后，混匀，2min后制作临时装片，在显微镜下观察细胞融合情况。

动物细胞融合实验实验报告

动物细胞融合实验实验报告

动物细胞融合实验实验报告
实验目的：1、了解动物细胞融合的常用方法
2、学习化学融合的基本操作过过程
3、观察动物细胞融合过程中的细胞行为和变化
实验材料：鸡血红细胞、50%PEG溶液、0.85%氯化钠溶液、显微镜、离心机、载玻片、盖玻片等
实验原理：聚乙二醇（PEG）能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。

在恢复过程中相接触的细胞由于接口处脂质双分
子层的互相亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。

实验步骤：1、取鸡血，离心后去除上清液，以0.85%氯化钠溶液制成5%~10%的悬液
2、加入GKN液4ml，混匀
3、加入14滴PEG液，静置3~5min后混匀，放于显微镜下观察
实验结果：显微镜下可观察到有些细胞发生质膜融合
分析与讨论：细胞融合的应用有微生物原生质体融合构成新菌株、利用原生质体融合和培养技术培育新植物、细胞杂交瘤技术与单克隆抗体、用于基因定位和绘制人类基因
图谱、用于生产树突状细胞抗肿瘤疫苗、用于动物育种、用于细胞疗法等。

细胞生物学实验-鸡血细胞的体外融合

细胞生物学实验-鸡血细胞的体外融合
植物细胞融合配合常规育种技术，可望选出优良材料，加之体细胞杂交 来自双亲的遗传物质并非简单的堆积，而是发生了复杂的遗传重组，这正是 改良作物所期望的。植物细胞融合的作用主要表现在：通过植物细胞融合培 育抗病新材料；合成新的物种；转移细胞质基因。
鸡血细胞的体外融合
应用领域（微生物）： 对微生物而言，细胞融合技术主要用于改良微生物菌种特性、提高目的
鸡血细胞的体外融合
细胞融合的方法： 聚乙二醇诱导融合：聚乙二醇具有强烈的吸水性以及凝聚和沉淀蛋白质
的作用，能够有效地促进植物原生质体和动物细胞的融合。在不同种类的动 物细胞混合液中加入聚乙二醇，就会发生细胞凝集作用，在稀释和除去聚乙 二醇的过程中，就会发生细胞融合。聚乙二醇诱导细胞融合的分子机理还不 太清楚。作为化学试剂，聚乙二醇使用起来很方便，诱导细胞融合的频率比 较高，但是它有一定毒性，对有些细胞（如卵细胞等）不适用。
鸡血细胞的体外融合
成纤维细胞
Байду номын сангаас
鼠肿瘤细胞
植物细胞A
植物细胞B
仙台病毒 融合培养基
融合
去掉细胞壁
原生质体A
原生质体B
形成杂种细胞
在选择性培养 基中杂种细胞 增殖形成克隆
异核体 杂种细胞
原生质体融合 再生细胞壁
杂种细胞 细胞分裂
愈伤组织
杂种细胞克隆
杂种植株
鸡血细胞的体外融合
实验器材：
普通光学显微镜、剪刀、镊子、载玻片、盖玻片、注射器、滤纸、胶头吸管、 离心机、血细胞计数板、水浴锅、烧杯、容量瓶、酒精灯。
鸡血细胞的体外融合
应用领域（动物细胞）：
1. 用于基因定位和绘制人类基因图谱：根据杂种细胞中某一染色体或其片段的存 在与否和细胞的某一性状表达与否相联系，从而可以实现把基因定位于某一染 色体或某一区段上。

实验十一 鸡血细胞融合

实验十一 鸡血细胞融合

4
PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列 不同分子质量的多聚体。PEG可以改变各 类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类 分子发生聚散和重组，引起细胞融合。 融合的频率和活力与所使用的PEG的相对 分子质量、浓度、作用时间、细胞的生理 状态与密度等相关。
5
实验步骤
(1)取鸡血储备液1mL，加入4mL0.85％生理盐水，混匀， 1200rpm/min 离心5min，弃去上清液。 (2)加入5mLGKN工作液制成鸡血细胞悬液。 (3)取1mL鸡血细胞悬液，加入4mLHanks液混匀，1000rpm/min 离心5min，去上清液，用手指轻弹离心管底部，使沉淀的血细胞 团快松散。 (4)取50％PEG溶液0.5ml，在1分钟内逐滴加入到鸡红细胞悬液， 边加边轻轻摇动混匀。待PEG全部加入后37℃水浴静置2分钟左 右。此全部过程都要求在37℃水浴内进行。 (5)缓慢加入5ml Hanks液，轻轻吹打混匀，在37℃水浴内静置5 分钟以终止PEG的作用，。 (6)用吸管轻轻吹打细胞团快数次使细胞团分散，1000转离心 5min，弃去多数上清液，留少许溶液混匀，取一滴融合后的细胞 悬液滴片，滴加一滴詹纳斯绿染液或者Giemsa染液，加盖片镜 检。
实验十一 鸡血细胞融合
1
实验目的
掌握细胞融合原理 应用聚乙二醇（PEG）融合细胞的方法 细胞融合率的计算。
2
实验用仪器及材料
实验仪器及材料
一、材料 鸡红细胞 二、器材和仪器：显微镜、离心机、水浴箱、 刻度离心管、试管、载玻璃片、盖玻片 三、试剂 50％PEG(MW4,000)、Hanks液(pH7.4)
6用吸管轻轻吹打细胞团快数次使细胞团分散用吸管轻轻吹打细胞团快数次使细胞团分散10001000转离心转离心5min5min弃去多数上清液留少许溶液混匀取一滴融合后的细胞弃去多数上清液留少许溶液混匀取一滴融合后的细胞悬液滴片滴加一滴詹纳斯绿染液或者悬液滴片滴加一滴詹纳斯绿染液或者giemsagiemsa染液加盖片镜染液加盖片镜77数据记录数据记录结果观察结果观察在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡红细胞膜在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡红细胞膜融合在一起形成一个异核体细胞

PEG诱导鸡血细胞融合实验方法比较

PEG诱导鸡血细胞融合实验方法比较

文章编号：2096-0387 (2018) 02-0112-03第4卷第2期 生物化工Vol.4 No.22018 年 4 月Biological Chemical EngineeringApr. 2018PEG 诱导鸡血细胞融合实验方法比较黄伟伟，颜华，高梅，李绍军(西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨陵712100)摘要:细胞融合技术是细胞生物学的一项核心技术，在科学研究、医药开发、农业育种等方面有着广泛应用。

PEG 法诱导鸡血细胞融合实验也被作为细胞生物学本科实验的一项重要内容，但在实验课程中的融合效果不佳。

笔者查阅相关细胞生物学 实验指导教材和文献，发现存在两种截然不同的PEG 法诱导鸡血细胞融合操作方法。

因此，本文对两种方法进行了比较，并进一 步讨论了影响PEG 法诱导鸡血细胞融合效率的重要因素和改进方法。

关键词：细胞融合；PEG ;鸡血细胞；实验优化 中图分类号：Q813文献标志码：AComparison of Two Experimental Methods of PEG Induced Chicken Blood Cell FusionHuang Wei-wei, Yan Hua, Gao Mei, Li Shao-jun(College of Life Sciences, Northwest Agriculture and Forestry University, Shaanxi Yangling 712100)Abstract: Cell fusion is one of core technologies of cell biology, which has been widely applied in scientific research, medicine development, agricultural breeding and so on. Experiment of PEG induced chicken blood cell fusion is an important content of cell biology experimental course for undergraduate students, but the fusion effect in the experimental course is not good. The author consulted the relevant cell biology experimental guide textbooks and literature, and found that there are two different protocols for PEG induced chicken blood cell fusion. So in this paper, we compared these two operation methods, further discussed the important factors related with the cell fusion efficiency and give some advice for the operation method optimization.Key words ： Cell fusion; PEG; Chicken blood cells; Experiment optimization细胞融合（Cell fusion )是在自然条件下或人工 诱导条件下使两个或两个以上的细胞合并成为一个 双核或多核细胞的过程。

细胞生物学实验手册：细胞融合实验原理及步骤

实验十一细胞融合【实验目的】掌握细胞融合原理、应用PEG融合细胞的方法以及细胞融合率的计算。

【实验用品】一、材料鸡红细胞二、器材和仪器：显微镜、离心机、水浴箱、刻度离心管、试管、载玻璃片、盖玻片三、试剂 50％PEG(MW4,000)、Hanks液(pH7.4)【实验内容】一、原理细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。

人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。

由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。

细胞融合的诱导物种类很多．常用的主要有灭活的仙台病毒(Sendai virus)，聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)和电脉冲。

目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。

PEG的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷脂的酰键及极性基团发生结构重排。

二、方法(1)取新鲜鸡血以0.85％生理盐水制成10％的悬液。

(2)称取0.5克PEG(MW=4,000)放入试管内，在酒精灯上融化之，迅速加入0.5ml预热的Hanks液混匀制成50％的PEG溶液。

放入37℃水浴中待用。

(3)取上述10％的鸡红细胞悬液1ml放入离心管中，再加入5ml Hanks液混匀，然后以1,000rpm离心5分钟，小心弃去上清，用指弹法将细胞团块弹散。

(4)取上述50％PEG溶液0.5ml，在1分钟内滴加到鸡红细胞悬液，边加边轻轻摇动混匀。

待PEG全部加入后静置1分钟左右。

此全部过程都要求在37℃水浴内进行。

鸡血细胞的体外融合


四、实验方法与步骤
2. 鸡离心管中， 吸取 鸡血细胞悬液放入离心管中 4mlHanks液混匀，1000rpm离心 液混匀， 离心5min。弃去上清液， 液混匀 离心 。弃去上清液， 用手指轻弹离心管底部，使沉淀的血细胞团块松散。 用手指轻弹离心管底部，使沉淀的血细胞团块松散。
1. 高Ca2+浓度能够提高细胞融合率。有些抗凝剂中含有 浓度能够提高细胞融合率。 结合的化合物，与血液中的Ca 和Ca2+结合的化合物，与血液中的 2+形成难解离的 可溶性络合物，导致血液中的Ca 浓度降低， 可溶性络合物，导致血液中的 2+ 浓度降低，故起抗 凝血作用，但同时会造成细胞的融合率较低。 凝血作用，但同时会造成细胞的融合率较低。 2. 必须严格控制 必须严格控制PEG的作用时间，通常处理细胞 ～ 的作用时间， 的作用时间 通常处理细胞1～ 2min。PEG和二甲基亚砜（DMSO）并用，可以提高 和二甲基亚砜（ 。 和二甲基亚砜 ）并用， 细胞的融合率。 细胞的融合率。 3. 融合细胞继续培养就变成一个杂种细胞，它的染色体 融合细胞继续培养就变成一个杂种细胞， 数不是两核的倍数，因为一些染色体会逐渐消失。 数不是两核的倍数，因为一些染色体会逐渐消失。
1. 鸡血细胞悬液的制备
从家鸡的翼根静脉采血制备抗凝全血。 加入4倍体 从家鸡的翼根静脉采血制备抗凝全血。 加入 倍体 积的0.85 %NaCl溶液，制成红细胞储备液，保存于 溶液， 积的 溶液 制成红细胞储备液， 4℃。取鸡血细胞储备液 ℃ 取鸡血细胞储备液1ml，加入 ，加入4ml 0.85 %NaCl 溶液，混匀后， 离心5min，弃去上清液， 溶液，混匀后，1200rpm离心 离心 ，弃去上清液， 再加入5ml 0.85 %NaCl溶液按上述条件离心一次。最 溶液按上述条件离心一次。 再加入 溶液按上述条件离心一次 弃去上清液，加入10ml的GKN溶液制成鸡血细 后，弃去上清液，加入 的 溶液制成鸡血细 胞悬液。 鸡血细胞悬液， 胞悬液。取0.5ml鸡血细胞悬液，用GKN溶液稀释至 鸡血细胞悬液 溶液稀释至 1X107个/ml，备用。 ，备用。

细胞融合实验报告

细胞融合实验报告【实验题目】动物细胞融合【实验目的】1.了解动物细胞融合的常用方法。

2.学习化学融合的基本操作过程。

3.观察动物细胞融合过程中细胞的行为与变化。

【实验材料与用品】1、材料鸡血红细胞2、试剂50%PEG、GKN溶液、Alsever’s细胞保存液、0.85%氯化钠溶液。

3、器材倒置显微镜、离心机、载玻片、盖玻片、离心管、废液缸、滴管等。

【实验原理】细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。

目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括：病毒诱导融合、化学诱导融和和电激诱导融合。

1、病毒诱导融合仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融时也可介导细胞与细胞的融合。

用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。

2、化学诱导融合很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。

这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。

在恢复过程中想接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。

化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。

PEG是广泛使用的化学融合剂。

3、电激诱导融合包括电诱导、激光诱导等。

其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。

电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。

【实验步骤】在本次实验中采用的是化学诱导融合的方法，利用PEG使鸡血红细胞发生融合。

具体实验步骤如下：1、取鸡血2ml+2mlAlsever液，再加入6mlAlsever液，混匀后制悬液（4℃保存）【老师已做好，可直接使用】2、取（1）中悬液1ml+4ml的0.85%的NaCl溶液，进行以下三次离心处理： 1200r/min下离心5min，去掉上清液，再加入0.85%的NaCl溶液至5ml； 1000-1200r/min下离心5min，去掉上清液，再加入0.85%的NaCl溶液至5ml；1000-1200r/min下离心7min【因时间关系此次实验只离心一次】3、将离心后的沉降血球（去上清后约0.1-0.2ml）加入GKN至1-2ml，使之成为10%的细胞悬液；4、取上述10%的血球悬液1ml,加入3mlGKN液，使每毫升含血球xxxx个；5、分别取（4）1ml+0.5ml50%PEG，（4）0.5ml+0.5ml50%PEG，（4）0.5ml+1.0ml50%PEG，2-3min后，显微镜下观察。

#实验8 PEG法诱导鸡血细胞融合


观察时注意不同程 度的融合现象。 度的融合现象。通常分 为五个阶段: 为五个阶段: 两细胞膜接触，粘连; ①两细胞膜接触，粘连; 细胞膜形成穿孔； ②细胞膜形成穿孔； 两细胞的细胞质连通; ③两细胞的细胞质连通; ④通道扩大，两细胞连 通道扩大， 成一体； 成一体； 细胞完全合并， ⑤细胞完全合并，形成 一个含有两个或多个核 的圆形细胞。 的圆形细胞。
8、染色和镜检 、 吸取细胞悬液，在凹面玻片上滴一滴， 吸取细胞悬液，在凹面玻片上滴一滴，加入詹纳斯绿染 液混匀，染色3min后盖上盖玻片，在显微镜下进行观察细 后盖上盖玻片， 液混匀，染色 后盖上盖玻片 融合情况。 胞融合情况。 9、 9、计算细胞融合率 细胞融合率是指在显微镜的视野内， 细胞融合率是指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞其 细胞核总数与该视野内所有细胞（包括已融合细胞） 细胞核总数与该视野内所有细胞（包括已融合细胞）的细胞 核总数之比，通常以百分比表示，而且要进行多个视野测定, 核总数之比，通常以百分比表示，而且要进行多个视野测定 再加以平均统计，更为准确。 再加以平均统计，更为准确。
四、方法与步骤
（一）鸡血细胞的体外融合
1.鸡血细胞的获得 1.鸡血细胞的获得 用肝素溶液润洗注射器，从家鸡的翼根静脉用注射器采血， 用肝素溶液润洗注射器，从家鸡的翼根静脉用注射器采血， 注入试管后，速加入肝素（100U肝素/5ml全血 混合， 肝素/5ml全血） 注入试管后，速加入肝素（100U肝素/5ml全血）混合，制 成抗凝全血。 成抗凝全血。 2.鸡血细胞储备液的制备 2.鸡血细胞储备液的制备 在抗凝全血的试管中，加入4倍体积的0.85%NaCl溶液， 0.85%NaCl溶液 在抗凝全血的试管中，加入4倍体积的0.85%NaCl溶液，制 成红细胞储备液，置于4℃冰箱内可供一周内使用。 4℃冰箱内可供一周内使用 成红细胞储备液，置于4℃冰箱内可供一周内使用。 3、鸡血细胞悬液的制备及稀释 取细胞悬液1mL 1mL， 4mL0.85%NaCl溶液混匀 溶液混匀， 取细胞悬液1mL，加4mL0.85%NaCl溶液混匀，1200r/min 离心5min 弃上清液，再加入5ml 0.85%NaCl溶液按上述条 5min， 离心5min，弃上清液，再加入5ml 0.85%NaCl溶液按上述条 最后，弃去上清液，加入10ml GKN溶液 10ml的 溶液， 件离心一次。最后，弃去上清液，加入10ml的GKN溶液，制 成鸡血细胞悬液。吸取0.5ml鸡血细胞悬液，加入4.5ml 0.5ml鸡血细胞悬液 4.5ml的 成鸡血细胞悬液。吸取0.5ml鸡血细胞悬液，加入4.5ml的 GKN液进行稀释 液进行稀释。 GKN液合
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5、染色和镜检 吸取细胞悬液，在凹面玻片上滴一滴，加入詹纳斯绿染液 混匀，染色5min后盖上盖玻片，在显微镜下进行观察细胞 融合情况。
观察时注意不同程度的融合现象。通常分为五 个阶段。①两细胞膜接触，粘连；②细胞膜形成穿 孔；③两细胞的细胞质连通；④通道扩大，两细胞 连成一体；⑤细胞完全合并，形成一个含有两个或 多个核的圆形细胞。
荧光标记的细胞融合
三．实验仪器、材料和试剂
仪器、用具：注射器、刻度离心管、离心 机、血细胞记数板、水浴锅、滴管、显微 镜、烧杯、容量瓶、凹面载玻片、盖玻片、 酒精灯等。
材料：成年家鸡。
■ 试剂
（1）0.85%NaCl溶液:
（2）GKN液：8.0gNaCl，0.4g KCl,1.77 g Na2HPO4·2H2O， 0.69 g NaH2PO4·H2O，2.0g葡萄糖，0.01g酚红，溶于 1000ml重蒸水中。
• 影响原生质体融合的因素。 （1）首先是酶解条件： 渗透压稳定剂 Ca2+ 、Mg2+、蔗糖 可保持原生质体稳定利于再生；随着酶解时间的增加原生 质体的释放量增大；酶解浓度到达一定浓度后，原生质体 的再生率下降；再就是酶解温度。 （2）原生质体的脱壁是否完全会影响融合效果。有的原生质 体会很快再生细胞壁，因此在洗去酶液后，应立即进行融合 处理。 （3）原生质体的悬浮状况也会影响融合，如果两亲本原生质 体密度相差较大，就难以混和均匀，接触机会减少，这时应 用离心方法强迫它们密集
• 聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细 胞
接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于 两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此 的表面张力作用，使细胞发生融合。
• 细胞融合的频率和活力与所用PEG分子质量、浓度、 作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。
骨髓间质充质干细胞移植后的细胞融合
实验 十 PEG法诱导鸡血细胞融合
College of Life Science and Technology, XINJIANG Univercity
一、实验目的
了解聚乙二醇（PEG）诱导体外细胞融合 的基本原理。
通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验， 初步掌握细胞融合的基本方法。
二、实验原理
（3）50%（m/v）PEG溶液：取50gPEG(相对分子量=4000)放 入100ml瓶中，高压灭菌20min。让PEG 冷却至50-60℃， 勿让其凝固。加入50ml预热至50℃的GKN 液，混匀，置 37℃备用。
（4） Hanks原液(10×)： NaCl 80.0g；Na2HPO4·12H2O1.2g； KCl 4.0g；KH2PO4 0.6g；MgSO4·7H2O 2.0g； 葡萄糖 10.0g；CaCl2 1.4g。
称取1.4g的CaCl2，融于30-50ml的重蒸水中。取 1000ml的烧杯及容量瓶各一个，先放重蒸水800ml于烧 杯中，然后按上述配方顺序，逐一称取药品。必须在前 一药品完全溶解后，方可加入下一药品，直到葡萄糖完 全溶解后，再将已溶解的CaCl2溶液加入，最后加水至 1000ml。
（6）Hanks液：Hanks原液100 ml，加重蒸水896 ml，
2.严格控制PEG的作用时间，通常处理细胞1 －2min。
3.终止PEG的作用时，缓慢加入5ml Hanks 液， 轻轻吹打，以免融合的细胞分离。 2．计算细胞融合频率。 3．说明影响原生质体融合的因素。
• 本实验所用PEG融合方法不能直接用于未脱壁植物细胞的融 合，因为植物细胞具有细胞壁，PEG无法介导其细胞融合； 但是，如果将植物细胞进行脱壁处理后，则可使用PEG融合 方法进行融合实验。
细胞融合（cell fusion）又称体细胞杂交，是指 用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核 体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩 溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含 有一个细胞核的杂种细胞（hybrid cell）。
细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免 疫、病毒和肿瘤的重要手段。依据融合过程采用的 助融剂的不同，细胞融合可分为：病毒诱导的细胞 融合，如仙台病毒(hemagglutinating virus of Japan,HVJ);化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二 醇（polyethyleneglycol ,PEG）;电场诱导的细胞 融合；激光诱导的细胞融合。
6．计算细胞融合率
细胞融合率是指在显微镜的视野内，已发生融合 的细胞其细胞核总数与该视野内所有细胞（包括已 融合细胞）的细胞核总数之比，通常以百分比表示， 而且要进行多个视野测定，再加以平均统计，更为 准确。
细胞融合过程在形态上的变化
五、实验结果
六、注意事项
1.高压灭菌过的PEG 冷却至50-60℃时就加入 预热至50℃的GKN 液，勿让其凝固。
加0.5%酚红 4 ml。配好的Hanks液，分装包扎好 贴上标签，经过灭菌后，4℃保存。
（7）詹纳斯绿染液。
四、方法与步骤
（一）鸡血细胞的体外融合
1.鸡血细胞的获得 用肝素溶液润洗注射器，从家鸡的翼根静脉用注射器采血，
注入试管后，速加入肝素（100U肝素/5ml全血）混合，制 成抗凝全血。 2.鸡血细胞储备液的制备 在抗凝全血的试管中，加入4倍体积的0.85%NaCl溶液，制 成红细胞储备液，置于4℃冰箱内可供一周内使用。
3、鸡血细胞悬液的制备 取细胞悬液1mL，加4mL0.85%NaCl溶液混匀，1200r/min离
心5min，弃上清液，再加入5ml 0.85%NaCl溶液按上述条件 离心两次（5分钟，10分钟）。最后，弃去上清液，加入 10ml的GKN溶液，制成鸡血细胞悬液。吸取0.5ml鸡血细胞 悬液，加入4.5ml的GKN液进行稀释。
吸取悬液1mL放入离心管中，加入4mLHanks液混匀， 1000r/min离心5min，弃上清液，再加入适量GKN液，使 成10%的悬液。
4、PEG诱导细胞融合 吸取0.5ml 37℃的50%PEG溶液，慢慢沿着离心管壁逐滴 加入，边加边轻摇离心管，使PEG与细胞混匀，然后在 37℃水浴中静置5---10min。