山东大学鸡血红细胞细胞融合

鸡血细胞的体外融合[实验目的]1、了解聚乙二醇（PEG）诱导体外细胞融合的基本原理。

2、通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。

[实验原理]细胞融合又称体细胞杂交，是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞。

依据融合过程采用的助融剂不同，细胞融合可分为：●病毒诱导的细胞融合，如仙台病毒（HVJ）；●化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二醇（PEG）；●电场诱导的细胞融合；●激光诱导的细胞融合PEG是乙二醇的多聚化合物，可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，诱导产生细胞融合。

商品PEG存在一系列不同分子质量的多聚体，一般应用PEG4000~6000的溶液，能够产生高频率的细胞融合。

[实验材料]注射器、滴管、烧杯、容量瓶、凹面载玻片、盖玻片、离心机、水浴锅、显微镜、细胞计数板、酒精灯、刻度离心管、Hanks液：Hanks原液 100mL重蒸水 896mL0.5%酚红 4mL配好的Hanks液，分装包扎好贴上标签，经过灭菌后，4℃保存。

GKN液：50%（m/V）PEG溶液取50g PEG4000放入100mL瓶中，高压灭菌20min让PEG冷却到50~60℃，勿让其凝固加入50mL预热至50 ℃的Hanks液，混匀，至37 ℃保温备用。

詹纳斯绿染液、0.85% NaCl溶液[实验步骤]1、鸡血细胞悬液的制备在离心后的鸡血细胞沉淀中加入10ml的GKN溶液，将细胞悬浮。

取0.5ml鸡血细胞悬液，加3.5ml GKN溶液。

镜检，在血细胞计数板上计数。

稀释至1X107个/ml，于37℃保温。

2、鸡血细胞的收集吸取1ml鸡血细胞悬液放入离心管中，加入4mlHanks液混匀，1000rpm离心5min。

弃去上清液，用手指轻弹离心管底部，使沉淀的血细胞团块松散。

实验一：鸡血细胞融合一、实验目的1、熟悉细胞融合的理论；2、掌握PEG诱导的细胞融合方法。

二、实验原理1、细胞融合原理两个以上的细胞合并成为一个双核或多核细胞称为融合细胞。

在通常情况下，两个细胞接触并不发生融合现象，因为各自存在完整的细胞膜，在特殊融合诱导物的作用下，两个细胞膜发生一定的变化，就可促进两个或多个细胞聚集，相接触的细胞膜之间融合，继之细胞质融合，形成一个大的融合细胞。

利用PEG介导的动物细胞融合，其实验原理到目前为止还没有完全定论。

学者们一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的重排质膜在修复时相互合并在一起,使两细胞的胞质沟通,从而造成相互接触的细胞之间发生融合。

细胞与组织不同，不排斥异类、异种细胞。

不仅能产生同种细胞融合、种间细胞融合，而且也能诱导动植物细胞间产生融合。

细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。

人工诱导的细胞融合不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合。

2、细胞融合方法诱导细胞融合的主要方法有：病毒诱导融合，化学融合剂诱导融合和电融合。

1. 病毒诱导融合：有许多种类的病毒能介导细胞融合，最常用的是灭活的仙台病毒（HVJ），为RNA病毒。

病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最后形成融合细胞。

2. 化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚已二醇（PEG）。

PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：①可促使细胞凝结；②破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个打的双核或多核融合细胞。

动物细胞融合实验实验报告
实验目的：1、了解动物细胞融合的常用方法
2、学习化学融合的基本操作过过程
3、观察动物细胞融合过程中的细胞行为和变化
实验材料：鸡血红细胞、50%PEG溶液、0.85%氯化钠溶液、显微镜、离心机、载玻片、盖玻片等
实验原理：聚乙二醇（PEG）能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。

在恢复过程中相接触的细胞由于接口处脂质双分
子层的互相亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。

实验步骤：1、取鸡血，离心后去除上清液，以0.85%氯化钠溶液制成5%~10%的悬液
2、加入GKN液4ml，混匀
3、加入14滴PEG液，静置3~5min后混匀，放于显微镜下观察
实验结果：显微镜下可观察到有些细胞发生质膜融合
分析与讨论：细胞融合的应用有微生物原生质体融合构成新菌株、利用原生质体融合和培养技术培育新植物、细胞杂交瘤技术与单克隆抗体、用于基因定位和绘制人类基因
图谱、用于生产树突状细胞抗肿瘤疫苗、用于动物育种、用于细胞疗法等。

姓名系年级13级生科组别同组者科目细胞生物学实验题目动物细胞融合学号动物细胞融合【实验目的】1.了解动物细胞融合的常用方法。

2.学习化学融合和电融合的基本操作过程。

3.观察动物细胞融合过程中细胞的行为和变化。

【实验原理】细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。

目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括病毒诱导融合、化学诱导融合和电激诱导融合。

1.病毒诱导融合仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融合。

这类病毒的被膜中含有融合蛋白，可介导病毒同宿主细胞融合，同时也可介导细胞与细胞的融合。

用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。

2.化学诱导融合很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。

这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。

在恢复过程中相接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。

化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。

PEG 是被广泛使用的化学融合剂。

3.电激诱导融合包括电诱导、激光诱导等。

其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。

电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。

【实验材料和用品】1.材料鸡血红细胞2.试剂50%PEG溶液、Alsever’s细胞保存液、GKN溶液、0.85%氯化钠溶液。

3.器材光学显微镜、离心机、载玻片、盖玻片、离心管、滴管等。

姓名系年级13级生科组别同组者科目细胞生物学实验题目动物细胞融合学号【实验步骤】本实验采用PEG促细胞融合法，实验步骤如下：1. 取鸡血2ml+2ml Alsever液，再加入6ml Alsever液，混匀后制悬液。

山东大学细胞生物学实验报告聚乙二醇（PEG ）法诱导的动物细胞融合实验2012/9/11实验目的：了解细胞融合技术的发展过程和主要方法的基本原理，用聚乙二醇(PEG)化学诱导法进行鸡血红细胞的融合实验，掌握实验的基本操作，观察鸡血红细胞融合的不同时期。

实验原理：1. 细胞融合的概念两个或两个以上的细胞或原生质体在自然或人为诱导的情况下细胞质膜相互融合，细胞质相互混合成为一个整体杂合细胞的现象被称为细胞融合。

细胞融合可以发生在同种细胞之间也可以在不同物种间实现。

2. 细胞人工融合的主要方法及基本原理细胞体外融合的主要方法分为病毒诱导，化学诱导和物理诱导。

1953年，M. Kuroya 在临床中第一次分离到仙台病毒（HVJ ）[1]。

1958年，日本学者Okada 发现仙台病毒（HVJ ）能诱导动物细胞融合[2]，其基本原理是仙台病毒的衣壳上有细胞表面受体的结合位点，可以诱导不同细胞凝集，最终使不同细胞的细胞膜相互融合。

1974年，加拿大学者高国楠发明了细胞的聚乙二醇（Polyethyleneglycol ，PEG ）化学融合法，由于该方法对实验条件要求极低，试剂易得，操作简单，成为应用最广泛的细胞融合方法。

化学诱导细胞融合的基本原理是PEG 等化学物质能够诱导细胞膜磷脂分子的极性基团发生结构重排，相互接触的细胞在细胞膜恢复过程中借助磷脂分子的亲和作用和表面张力实现融合。

比之于仙台病毒诱导法，PEG 诱导法的效率提高了几百倍。

80年代，科学家发明了细胞电融合法[4, 5]，电融合法将细胞融合的产率提高到了50%-80%。

电融合法的建立是基于细胞膜表面带电荷的性质。

当在细胞悬液周围加入特定方向的电场时，细胞表面会发生极化现象，相邻的细胞将吸附在一起。

这时突然提高电场强度，细胞间彼此接触的细胞膜会被击穿，细胞膜修复时受到磷脂分子间的亲和作用和细胞膜表面张力的作用将会发生融合。

图2. 以电融合方法得到的3T3-C2融合细胞 （引自J. Teissie 等，1982 )。

实验六鸡血细胞的体外融合2017.11.10 6.1实验结果
A B C
D E F
图1.鸡血细胞体外融合情况
A：开始融合的两个鸡血细胞B：融合中期的两个鸡血细胞
C：完成融合的两个鸡血细胞D：完成融合的三个鸡血细胞
E：多细胞融合后涨破F：未发生融合的鸡血细胞
A B
C D
图2鸡血细胞体外融合
（1）统计图2可得鸡血细胞体外融合率为：融合细胞数/细胞总数=23/223=10.31％
（2）分析：总体来说，细胞融合率较低。

从观察结果来看，存在许多多个细胞融合后涨破的现象而单个未融合的细胞较少，所以我认为应该是由于加入PEG后或是水浴后没有很好地分散细胞团，从而导致多个细胞融合使面积过大从而涨破最终导致细胞融合率较低；也有可能是因为离心速度过高从而破坏了细胞使融合率降低。

6.2回答问题
为了提高融合率，某同学打算选用5种分子量PEG、各设5种浓度、5个融合时间，探索最佳条件组合。

按常规设计，共5*5*5=125组合，因而工作量大。

请你帮助该同学找到一种设计方法，能够科学地减少组合而不影响结果；列出组合表，用一句话解释该设计的原理。

答：设5种相对分子质量分别为：M1，M2，M3，M3，M4，M5
5种浓度分别为：c1，c2，c3，c4，c5
5个时间为t1，t2，t3，t4，t5
步骤一：
步骤二：
2.探究细胞融合最适PEG浓度
表
步骤三：
通过计算细胞融合率可得细胞融合最适时间T，最适浓度C，最适相对分子质量M，则最佳组合为（T，C，M）
设计原理：三个变量是独立的，其对细胞融合的作用不存在相互影响。

实验五鸡血细胞融合一、实验目的掌握细胞融合技术二、实验原理PEG是乙二醇的多聚化合物，PEG可与水分子以氢键结合，在高浓度（50％）的PEG溶液中自由水消失，导致细胞脱水而发生质膜结构的变化，引起细胞融合三、实验用品（1）器材：离心机显微镜水浴锅血球计数板离心管滴管注射器盖玻片载玻片（2）试剂：①Alsever溶液：葡萄糖2.05g 柠檬酸钠0.80g Nacl 0.42g 溶于100Ml,ddH2O中②0.85％生理盐水③GKN溶液：Nacl 8g Kcl 0.4g Na2HPO4·12H2O 3.75g NaH2PO4·2H2O0.78g 葡萄糖2g 酚红0.01g 溶于100ML ddH20中④苏木精和伊红（HE）染液⑤ 50％PEG溶液，，取一定量PEG（WM=4000）水域加热溶解后（50℃）与GKN（50℃）等体积混合⑥鸡血四、方法与步骤注射器吸2ML Alsever 溶液取鸡血2ML→加入离心管→加入6MLAlsever （1:4）→取1 ML鸡血悬浮液加4ML 0.85％Nacl→离心1500r／min 3 min 后弃去上清液反复三次→加GKN 4 ML离心弃去上清液→加GKN（1：9）制成10％悬液→利用血球计数板计数控制在3-4×107个／ML取1 ML于离心管→37℃水浴同时水浴温度恒温（3-4 min）→加入50％PEG液0.5 ML（慢慢沿离心管流下融合），边加边摇匀放入水浴锅中→20-30 min后加GKN至8 ML（沿器壁）静止水浴锅中20 min→1500r／min 3 min 离心，弃上清液加GKN溶液离心→弃上清液加适量混匀取少量于载玻片上进行HE染色（可在水浴锅上适当烤片）,进行观察。

五、作业1、计算融合率融合率=视野内发生融合的细胞核总数／视野内所有细胞核总数2、绘图显示能观察到的细胞融合（要注明是何倍数下的结果）附：HE染色 1、染色划片晾片 2、苏木精（蒸馏水冲洗）15-20 min 3、伊红3 min（蒸馏水冲洗）。

一、实验目的1. 了解PEG诱导细胞融合的基本原理。

2. 通过细胞融合实验，初步掌握细胞融合技术。

3. 观察鸡细胞融合过程中的细胞行为与变化。

二、实验材料与用品1. 实验材料：鸡红细胞、Hanks液、PEG（聚乙二醇）。

2. 实验用品：生物显微镜、离心机、恒温水浴箱、试管、离心管、滴管、酒精灯、载玻片、盖玻片、生理盐水、剪刀、镊子等。

三、实验方法1. 准备鸡红细胞悬液：取新鲜鸡血，用生理盐水稀释至10%的悬液。

2. 制备PEG溶液：称取0.5克PEG（分子量4000）放入试管内，在酒精灯上融化，迅速加入0.5ml预热的Hanks液混匀，制成50%的PEG溶液。

放入37℃水浴中待用。

3. 处理鸡红细胞：取10%的鸡红细胞悬液1ml放入离心管中，加入5ml Hanks液混匀，以1000rpm离心5分钟，小心弃去上清，用指弹法将细胞团块弹散。

4. 诱导细胞融合：取上述50%的PEG溶液0.5ml，在1分钟内滴加到鸡红细胞悬液中，边加边轻轻摇动混匀。

待PEG全部加入后静置1分钟左右。

此过程均在37℃水浴中进行。

5. 终止PEG作用：缓慢滴加9ml Hanks液以终止PEG的作用，在37℃水浴中静置5分钟。

6. 离心弃上清：离心弃去上清，取一滴融合后的细胞悬液滴片，加盖片镜检。

四、实验结果与分析1. 镜检观察：在显微镜下观察，可见鸡红细胞融合后的细胞呈现球形，细胞膜较厚，细胞质较为均匀。

2. 实验结果分析：本实验成功诱导鸡红细胞融合，说明PEG诱导细胞融合技术在鸡细胞融合实验中具有可行性。

鸡红细胞融合后的细胞形态较为规则，细胞膜完整，细胞质均匀，说明细胞融合过程较为顺利。

五、讨论1. 鸡红细胞融合实验的成功，为细胞融合技术的研究提供了实验依据。

本实验采用PEG诱导细胞融合技术，具有操作简便、效果显著等优点。

2. 鸡红细胞融合实验过程中，PEG的浓度、处理时间等因素对细胞融合效果有较大影响。

实验中，PEG浓度为50%，处理时间为1分钟，能够获得较好的融合效果。

鸡血红细胞融合实验实验目的：1、掌握细胞融合的概念，及基本原理。

2、初步掌握PEG诱导细胞融合技术。

3、了解细胞融合技术的生物学和医学意义。

实验原理：PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体。

PEG可与水分子借氢键结合，在高浓度（50%）的PEG溶液中自由水消失，导致细胞脱水而发生质膜结构的变化，引起细胞融合。

为了发挥PEG促进细胞融合的效力，必须采取较高浓度的PEG溶液，但在高浓度PEG溶液下，细胞可能因为脱水而受到显著的破坏。

因此，选择合适的分子量、浓度及作用时间是PEG融合技术的关键。

鸡血红细胞其核结构紧密，易于观察。

实验用品：１、器具：普通光学显微镜、普通离心机、恒温水浴箱、１０ml刻度离心管、试管架、吸管、注射器、载玻片等２、材料：新鲜鸡血或与Alsever液混合的备用鸡血３、试剂：５０％PEG（现用现配）、Alsever液、０.８５％生理盐水、GKN液、Janus green 染液或Giemsa染液实验步骤：１、鸡血的采集与抗凝：将新鲜鸡血与Alsever液按１：４混成悬液（抗凝效果最佳）。

２、５０％PEG溶液的配制：称取适量PEG（Mr４０００）放入烧杯中，将其加热熔化，待冷却至５０℃，加入等体积的已预热至５０℃的GKN液并充分混匀，37℃保温备用。

PEG 溶液需使用前现配。

３、细胞融合操作：（1）、离心洗涤：取鸡血悬液0.5ml加0.85%生理盐水至5ml，混匀。

↓3000rpm,1min,弃上清。

↓（重复一次）加GKN溶液至5ml，混匀。

↓3000rpm,1min,弃上清。

（2）、水浴：加GKN溶液至0.5ml,混匀。

↓（39℃水浴5min）缓慢逐滴加0.25ml的50%PEG至悬液，边加边混匀。

↓水浴15min加入GKN溶液至5ml，混匀。

↓水浴10min3000rpm，1min，弃上清。

↓加入GKN溶液至5ml,混匀，3000rpm,1min。

（3）、结果观察：弃去上清液，加入GKN溶液至1ml处，混匀。

《 PEG介导/鸡血细胞融合》实验报告姓名翟贞文院系生物2012级学号201117140189小组成员于诚慧，王瑞璞指导教师评阅教师实验目的：1.了解并掌握细胞融合的基本原理和操作。

2.了解细胞融合的应用范围3.尝试用细胞融合的观点解决生物问题4.练习光学显微镜的使用实验背景：通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cellfusion）或细胞杂交（cellhybridization）。

基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体（homokaryon）；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）。

同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称诱发融合。

诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电激和激光）。

某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusionprotein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。

化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。

目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。

PEG的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷脂的酰键及极性基团发生结构重排。

另一方面促进相邻细胞的磷脂双分子层融合。

在表面张力作用下，发生细胞融合。

再在细胞膜的修复功能与张力作用下，整合成一个多核细胞。

实验材料：配置好的鸡的红细胞悬液（Alsever溶液与鸡血细胞混合液，4：1）；PEG（分子量约为4000）；GKN溶液；生理盐水；光学显微镜；普通离心机；量筒；滴管等实验步骤：（1）混合好的鸡血悬浮液取1毫升，加3毫升生理盐水混匀（2）离心机离心12000r/min离心2min，而后弃去上清液，加4ml生理盐水，混匀后，离心2min,12000r/min（3）取血细胞沉淀(0.2ml),，加适量GKN溶液稀释为10%血细胞溶液.（4 配制不同浓度的PEG与血细胞混合液A 取细胞悬液1ml,加0.5PEGmlB.取细胞悬液0.5ml，加0.5PEGmlC.取细胞悬液0.5ml，加1.0PEGml作用30s后，混匀，2min后制作临时装片，在显微镜下观察细胞融合情况。