细胞培养实验和Western Blot实验报告 姓名：张人龙学号：YX16100508115 专业：中医骨伤科学 实验一：细胞培养 1.实验目的 初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物工程在医学上的应用打下基础。 2.实验原理 从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重要手段。近年来，在体细胞遗传、分化、胚胎发生、肿瘤发生、免疫学、细胞工程、放射生物学以及老年学等一系列的研究领域中得到广泛的应用，并取得了丰硕的成果。细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。 细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、pH值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。 3.实验用品 3.1 材料和标本乳兔、HeLa细胞(人宫颈癌细胞) 3.2 器材和仪器手术器械、平皿、培养瓶、吸管、离心管(灭菌后备用)、酒精灯、烧杯、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。 2.3 试剂含有5％小牛血清的MEM培养液、0.01mol／L PBS，0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液、75％乙醇。 4.实验方法 4.1 原代细胞培养 4.1.1 原理 细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。
姓名班级 13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目动物细胞融合 【实验题目】 动物细胞融合 【实验目的】 1.了解动物细胞融合的常用方法。 2.学习化学融合的基本操作过程。 3.观察动物细胞融合过程中细胞的行为与变化。 【实验材料与用品】 1、材料 鸡血红细胞 2、试剂 50%PEG、GKN溶液、Alsever’s细胞保存液、0.85%氯化钠溶液。 3、器材 倒置显微镜、离心机、载玻片、盖玻片、离心管、废液缸、滴管等。 【实验原理】 细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括：病毒诱导融合、化学诱导融和和电激诱导融合。 1、病毒诱导融合 仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融时也可介导细胞与细胞的融合。用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。 2、化学诱导融合 很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复过程中想接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。PEG 是广泛使用的化学融合剂。 3、电激诱导融合
姓名班级 13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目动物细胞融合 包括电诱导、激光诱导等。其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。 【实验步骤】 在本次实验中采用的是化学诱导融合的方法，利用PEG使鸡血红细胞发生融合。具体实验步骤如下： 1、取鸡血2ml+2mlAlsever液，再加入6mlAlsever液，混匀后制悬液（4℃保存）【老师已做好，可直接使用】 2、取（1）中悬液1ml+4ml的0.85%的NaCl溶液，进行以下三次离心处理： ①在1200r/min下离心5min，去掉上清液，再加入0.85%的NaCl溶液至5ml； ②1000-1200r/min下离心5min，去掉上清液，再加入0.85%的NaCl溶液至5ml； ③1000-1200r/min下离心7min 【因时间关系此次实验只离心一次】 3、将离心后的沉降血球（去上清后约0.1-0.2ml）加入GKN至1-2ml，使之成为10%的细胞悬液； 4、取上述10%的血球悬液1ml,加入3mlGKN液，使每毫升含血球15000000个； 5、分别取（4）1ml+0.5ml50%PEG，（4）0.5ml+0.5ml50%PEG，（4）0.5ml+1.0ml50%PEG，混匀滴片，编号分别为①②③号溶液。在常温下2-3min后，显微镜下观察。 【实验结果】 1、实验中可观察到两个和多个细胞发生质膜融合现象,可看到不同融合状态的细胞： ①两细胞的细胞膜相互接触、粘连； ②接触部分的细胞膜崩解，两细胞的细胞质相同，形成一个细胞质的通道，呈现哑铃状； ③通道扩大，两个细胞连成一体，呈现一个长椭圆形细胞； ④细胞融合完成形成含有双核或者多核的细胞，呈圆形。 比较典型的细胞融合时的形态如下图：
苏州大学实验报告 院、系医学部年级专业姓名学号 课程名称医学免疫学实验成绩 指导老师葛彦同组实验者实验日期 2020/6/3
六、思考题 1.阐述脾脏细胞和骨髓瘤细胞融合后的五种状态，以及在HAT选择性培养基里生存与否的原理。 1)五种状态：未融合的B细胞；未融合的骨髓瘤细胞；B细胞融合B细胞；骨髓瘤细胞融合骨 髓瘤细胞；B细胞融合骨髓瘤细胞。 2)生存与否的原因 B细胞无法在体外长期大量生存，故未融合的B细胞和B细胞相互融合都无法在HAT选择性 培养基生存； 骨髓瘤细胞和骨髓瘤同核融合细胞在HAT培养液中时，DNA合成的主要途径被A阻断，由于缺乏HGPRT或/及TK，不能利用培养基中的H及T，无法完成DNA的合成； B细胞和骨髓瘤细胞的异核融合体即杂交瘤细胞，既从B细胞获得了HGPRT和TK，从而利用培养液中的H和T合成DNA，又从骨髓瘤细胞获得了无限增殖的能力，因此，只有杂交瘤细胞能在HAT选择培养液中生存下来。 2.现需要利用杂交瘤技术制备鼠抗人CD3单克隆抗体，请设计一个实验计划，阐述各阶段的实验 方案和过程，以及所需的实验材料 1)实验材料 人CD3抗原、小鼠、小鼠骨髓瘤细胞、细胞融合剂、PBS、HAT培养液、120目钢丝筛网、 玻璃平板、96孔细胞培养板、温控离心机。 2)实验方案和过程 a)将人CD3抗原注入小鼠体内，进行几周加强免疫； b)取小鼠脾脏 处死小鼠，固定于解剖架上打开腹腔，取出脾脏。置于120目的钢丝网中，将网移入 盛有生理盐水的平皿中，轻轻压磨，使其成为单个细胞悬液，吸取细胞悬液，与骨髓 瘤细胞SP2/0按比例混合，离心后弃上清； c)用HAT培养基培养纯化，得到杂交瘤细胞，使其产生抗人CD3单克隆抗体。
鸡血细胞的体外融合 【实验目的】 1．掌握聚乙二醇（PEG ）诱导体外细胞融合的基本原理。 2．通过PEG 体外诱导鸡血细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。 【实验原理】 细胞融合(cell fusion ）又称体细胞杂交，是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞(hybrid cell ）。细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段。 显微镜下的细胞融合过程 融合过程中两个细胞膜的变化过程
依据融合过程采用的助融剂的不同，细胞融合可分为：（1）病毒诱导的细胞融合，如：仙台病毒（hemagglutinating virus of Japan，HVJ）；（2）化学因子诱导的细胞融合，如：聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）；（3）电场诱导的细胞融合；（4）激光诱导的细胞融合。 PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子质量的多聚体。PEG可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，引起细胞融合。该方法应用分子质量为400—6000的PEG溶液引起细胞的聚集和粘连，产生高频率的细胞融合。融合的频率和活力与所用PEG的分子质量、浓度、作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。 【方法与步骤】 1. 鸡血细胞的获得： 从家鸡的翼根静脉用注射器采血，注入试管后，迅速加入肝素（100U 肝素/ 5ml全血）混合，制成抗凝全血。 2. 鸡血细胞储备液的制备： 在抗凝全血的试管中，加入4倍体积的0.85 %NaCl溶液，制成红细胞储备液，置于4℃冰箱内可供一周内使用。 3. 鸡血细胞悬液的制备： 取鸡血细胞储备液1ml，加入4ml 0.85 %NaCl溶液，混匀后，1200rpm离心5min，弃去上清液，再加入5ml 0.85 %NaCl溶液按上述条件离心一次。最后，弃去上清液，加入10ml的GKN 溶液制成鸡血细胞悬液。 4. 计数： 取0.5ml鸡血细胞悬液，加3.5ml的GKN溶液进行稀释，在血细胞计数板上计数。若细胞浓度过大，用GKN溶液稀释至1X107个/ml左右。 5. 鸡血细胞的收集： 吸取1ml鸡血细胞悬液放入离心管中，加入4mlHanks液混匀，1000rpm离心5min。弃去上清液，用手指轻弹离心管底部，使沉淀的血细胞团块松散。 6. PEG诱导细胞融合： 吸取0.5ml 37℃的50%PEG4000溶液，慢慢沿着离心管壁逐滴加入，边加边轻摇离心管，使PEG与细胞混匀，然后在37℃水浴中静置2min。
山东大学细胞生物学实验报告 聚乙二醇（PEG ）法诱导的动物细胞融合实验 2012/9/11 实验目的： 了解细胞融合技术的发展过程和主要方法的基本原理，用聚乙二醇(PEG)化学诱导法进行鸡血红细胞的融合实验，掌握实验的基本操作，观察鸡血红细胞融合的不同时期。 实验原理： 1. 细胞融合的概念 两个或两个以上的细胞或原生质体在自然或人为诱导的情况下细胞质膜相互融合，细胞质相互混合成为一个整体杂合细胞的现象被称为细胞融合。细胞融合可以发生在同种细胞之间也可以在不同物种间实现。 2. 细胞人工融合的主要方法及基本原理 细胞体外融合的主要方法分为病毒诱导，化学诱导和物 理诱导。1953年，M. Kuroya 在临床中第一次分离到仙台 病毒（HVJ ）[1]。1958年，日本学者Okada 发现仙台病毒 （HVJ ）能诱导动物细胞融合[2]，其基本原理是仙台病毒 的衣壳上有细胞表面受体的结合位点，可以诱导不同细 胞凝集，最终使不同细胞的细胞膜相互融合。 1974年，加拿大学者高国楠发明了细胞的聚乙二醇 （Polyethyleneglycol ，PEG ）化学融合法，由于该方法对 实验条件要求极低，试剂易得，操作简单，成为应用最广泛 的细胞融合方法。化学诱导细胞融合的基本原理是PEG 等化 学物质能够诱导细胞膜磷脂分子的极性基团发生结构重 排，相互接触的细胞在细胞膜恢复过程中借助磷脂分子的亲和作用和表面张力实现融合。比之于仙台病毒诱导法，PEG 诱导法的效率提高了几百倍。 80年代，科学家发明了细胞电融合法[4, 5] ，电融合法将细胞融合的产率提高到了50%-80%。电融合法的建立是基于细胞膜表面带电荷的性质。当在细胞悬液周围加入特定方向的电场时，细胞表面会发生极化现象，相邻的细胞将吸附在一起。这时突然提高电场强度，细胞间彼此接触的细胞膜会被击穿，细胞膜修复时受到磷脂分子间的亲和作用和细胞膜表面张力的作用将会发生融合。 图2. 以电融合方法得到的3T3-C2融合细胞 （引自J. Teissie 等，1982 )。 图1. 仙台病毒示意图。a 和b 是病毒套膜，c 为糖蛋白，d 为类染色体。
原理，实验步骤或实验方法，实验结果与分析，注意事项，实验感悟 实验一培养基母液的配制 一、实验目的 通过配置MS培养基母液，掌握母液的配置和保存方法 二、实验原理 配置培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配置，即按培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配置即可。 三、实验材料、试剂和仪器设备 1.试剂 NH 4NO 3 ,KNO 3 ,KH 2 PO 4 , CaCl 2 ·2H 2 O ,MgSO 4 ·7H 2 O,FeSO 4 ·7H 2 O Na 2-EDTA,MnSO 4 ·4H 2 O,ZnSO 4 ·7H 2 O, , KI,CuSO 4 ·5H 2 O,CoCl 2 ·6H 2 O,肌醇，甘氨酸， 盐酸硫胺素，盐酸吡哆醇，烟酸，蒸馏水NAA,6-BA 2.仪器设备 电子天平，烧杯（50ml、100ml、500ml、1000ml）量筒（1000ml、100ml、25ml），容量瓶(1000ml、500ml、100ml)，试剂瓶，玻璃棒数支，药芍，称量纸等。 四、实验步骤 1 大量元素母液的配制 先用量筒称量适当蒸馏水放入500ml烧杯中，按照配方表中用量依次分别称取： NH 4NO 3 ,KNO 3 , KH 2 PO 4 , MgSO 4 ·7H 2 O, CaCl 2 ·2H 2 O，待第一种化合物完全溶解后再 加入第二种化合物，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液转移至500ml容量瓶中，用蒸馏水定容至500ml，然后转移至细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存备用。 2 微量元素母液的配制 按照配方表中用量用电子天平依次称取MnSO 4·4H 2 O, ZnSO 4 ·7H 2 O H3BO3 , KI, Na 2 MoO 4 ·2H 2 O，CuSO 4 ·5H 2 O, CoCl 2 ·6H 2 O,按制备母液I的方法逐个 溶解，转移至容量瓶中，然后定容至500ml，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存备用。 3铁盐母液的制备
题目：PEG促细胞融合 一．实验目的: 1.掌握细胞融合的方法 2.学习使用PEG促进细胞融合的方法和步骤 二．实验原理 1.细胞融合：在自然条件下或用人工方法（生物的、物理的、化学的）使两个或两个以上 的细胞合并形成一个细胞的过程。由于体外培养的细胞很少会发生自发融合融合频率大约在10?4-10?6之间，因此要采用生物、化学或物理的方法人为地促使细胞融合。 2.促进细胞融合的方法 a)生物方法：病毒（Sendai virus，Newcastle disease virus，Vaceine virus） b)化学方法：聚乙二醇、盐类融合剂、二甲亚砜（DMSO）、甘油-醋酸酯、油酸盐、脂 质、Ca2+配合物等。PEG相对分子质量在200-6000均可用作细胞融合剂。普遍认为 聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏 散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用， 从而使细胞发生融合。在众多的化学试剂中，PEG应用最为广泛，因PEG液比病毒 更易制备和控制、活性稳定、使用方便、而且促进细胞融合的能力更强。 c)物理方法：电融合:电处理融合法是20世纪80年代发展起来的细胞融合技术，是 融合率大为提高。电脉冲作用时引起膜结构局部扰乱，出现小孔洞。而相对的脂 双层间分子在范德华力作用下，形成脂分子桥。由于连接处的细胞膜表面曲率大， 处于高张力状态，在热力学上是不稳定的，所以最终导致两细胞逐渐融合成一个圆 形的大球状细胞。与ⅣG法比较，电融合法融合率高：重复性强：诱导仅发生在 质膜接触部位，对细胞或原生质体伤害小：融合是在同步状态下进行，活细胞数目 多；装置精巧，方法简单，可在显微镜下观察或录象融合过程：免去PEG诱导后的 洗涤过程，诱导过程可控制性强。 三．实验材料及设备 1.实验材料： a)50%PEG混合液
细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理
细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法： 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。 取材注意事项： 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物：9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤
【实验题目】 动物细胞融合 【实验目的】 1.了解动物细胞融合的常用方法。 2.学习化学融合的基本操作过程。 3.观察动物细胞融合过程中细胞的行为与变化。 【实验材料与用品】 1、材料 鸡血红细胞 2、试剂 50%PEG、GKN溶液、Alsever’s细胞保存液、0.85%氯化钠溶液。 3、器材 倒置显微镜、离心机、载玻片、盖玻片、离心管、废液缸、滴管等。 【实验原理】 细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括：病毒诱导融合、化学诱导融和和电激诱导融合。 1、病毒诱导融合 仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融时也可介导细胞与细胞的融合。用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。 2、化学诱导融合 很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复过程中想接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。PEG 是广泛使用的化学融合剂。 3、电激诱导融合 包括电诱导、激光诱导等。其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由
于表面张力的作用，两细胞发生融合。电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。 【实验步骤】 在本次实验中采用的是化学诱导融合的方法，利用PEG使鸡血红细胞发生融合。具体实验步骤如下： 1、取鸡血2ml+2mlAlsever液，再加入6mlAlsever液，混匀后制悬液（4℃保存）【老师已做好，可直接使用】 2、取（1）中悬液1ml+4ml的0.85%的NaCl溶液，进行以下三次离心处理： ①在1200r/min下离心5min，去掉上清液，再加入0.85%的NaCl溶液至5ml； ②1000-1200r/min下离心5min，去掉上清液，再加入0.85%的NaCl溶液至5ml； ③1000-1200r/min下离心7min 【因时间关系此次实验只离心一次】 3、将离心后的沉降血球（去上清后约0.1-0.2ml）加入GKN至1-2ml，使之成为10%的细胞悬液； 4、取上述10%的血球悬液1ml,加入3mlGKN液，使每毫升含血球15000000个； 5、分别取（4）1ml+0.5ml50%PEG，（4）0.5ml+0.5ml50%PEG，（4）0.5ml+1.0ml50%PEG，混匀滴片，编号分别为①②③号溶液。在常温下2-3min后，显微镜下观察。 【实验结果】 1、实验中可观察到两个和多个细胞发生质膜融合现象,可看到不同融合状态的细胞： ①两细胞的细胞膜相互接触、粘连； ②接触部分的细胞膜崩解，两细胞的细胞质相同，形成一个细胞质的通道，呈现哑铃状； ③通道扩大，两个细胞连成一体，呈现一个长椭圆形细胞； ④细胞融合完成形成含有双核或者多核的细胞，呈圆形。 比较典型的细胞融合时的形态如下图： 初 步 接 触 融 合 图1 图2 图3
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
鸡血细胞的体外融合 [实验目的] 1、了解聚乙二醇（PEG）诱导体外细胞融合的基本原理。 2、通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。[实验原理] 细胞融合又称体细胞杂交，是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞。 依据融合过程采用的助融剂不同，细胞融合可分为： ●病毒诱导的细胞融合，如仙台病毒（HVJ）； ●化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二醇（PEG）； ●电场诱导的细胞融合； ●激光诱导的细胞融合 PEG是乙二醇的多聚化合物，可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，诱导产生细胞融合。 商品PEG存在一系列不同分子质量的多聚体，一般应用PEG4000~6000的溶液，能够产生高频率的细胞融合。 [实验材料] 注射器、滴管、烧杯、容量瓶、凹面载玻片、盖玻片、离心机、水浴锅、显微镜、细胞计数板、酒精灯、刻度离心管、 Hanks液：Hanks原液 100mL 重蒸水 896mL 0.5%酚红 4mL 配好的Hanks液，分装包扎好贴上标签，经过灭菌后，4℃保存。GKN液：50%（m/V）PEG溶液 取50g PEG4000放入100mL瓶中，高压灭菌20min 让PEG冷却到50~60℃，勿让其凝固 加入50mL预热至50 ℃的Hanks液，混匀，至37 ℃保温备用。 詹纳斯绿染液、0.85% NaCl溶液
[实验步骤] 1、鸡血细胞悬液的制备 在离心后的鸡血细胞沉淀中加入10ml的GKN溶液，将细胞悬浮。取0.5ml 鸡血细胞悬液，加3.5ml GKN溶液。镜检，在血细胞计数板上计数。稀释至1X107个/ml，于37℃保温。 2、鸡血细胞的收集 吸取1ml鸡血细胞悬液放入离心管中，加入4mlHanks液混匀，1000rpm离心5min。弃去上清液，用手指轻弹离心管底部，使沉淀的血细胞团块松散。 3、PEG诱导细胞融合 吸取0.5ml 37℃的50%PEG溶液，慢慢沿着离心管壁逐滴加入，边加边轻摇离心管，使PEG与细胞混匀，然后在37℃水浴中静置2min。 4、终止PEG作用 缓慢加入5mL Hanks缓冲液，轻轻吹打混匀，于37℃水浴中静置5min。 5、制备细胞悬液 用吸管轻轻吹打细胞团数次使细胞团分散，1000rpm离心5min，使细胞完全沉降。弃去上清液，加Hanks液，再离心一次，弃多数上清，留少许溶液，混匀。 6、染色和镜检 吸取细胞悬液，在凹面载玻片上滴一滴，加入詹纳斯绿染液混匀，染色3min 后盖上盖玻片，在显微镜下观察细胞融合情况。 注意事项：温度、融合时间、PEG的浓度与作用时间、细胞密度、机械力等因素均影响融合率，实验操作时应予以注意，并在需要的时候及时镜检。[实验结果] 1、细胞融合率是指在显微镜的视野内，已发生融合细胞的细胞核总数与该视野内所有细胞的细胞核总总数之比，通常以百分数表示。 融合率 = 视野内融合细胞的核数/视野内细胞的总核数×100％ 2、测定时要进行多个视野计数，并进行统计分析。
细胞生物学与细胞工程实验 课程编号：2511240 英文名称：Cell Biology and Cell Engineering 课程负责人：王昌留 师资队伍：王昌留、黄玲、李清、曲明娟、孙振兴 适用专业：生物科学 开课学期：秋季学期 课程类型：专业基础必修课 实验课性质：独立设课/非独立设课 先修课程：植物学实验/2511110、动物学实验/2580070、生物化学实验/2501040 总学时：理论学时实践学时 36 课外学时 总学分：1 采用教材及参考书： 1. 安利国主编：《细胞生物学实验教程》，科学出版社，2004 2. 杨汉民主编：《细胞生物学实验》第二版，高等教育出版社，1997 3. 李志勇：《细胞工程》第一版，科学出版社，2003 4. 徐承水，党本元主编：《现代细胞生物学技术》，青岛海洋大学出版社，1995 5. 王金发主编：《细胞生物学实验教程》，科学出版社，2003 内容简介： 本课程是一门理论性和技术性都很强的课程，是在学生已修完生物学、生物化学、细胞遗传学、细胞生物学与细胞工程、微生物学、免疫学基础上而设立的，是生物科学专业的必修课程。 本课程既包括细胞生物学基础实验又包括细胞工程综合实验，是一门对实验仪器要求较高的课程。开设本课程的目的是使学生掌握细胞生物学与细胞工程实验设备的操作方法，具备观察和研究细胞结构、功能与生命活动的基本方法，学会发现问题和解决问题的基本技能，为毕业后从事生物学相关的科研和教学工作奠定基础。 本课程考核成绩由平时成绩（占30%）、实验报告成绩（占30%）和终期考核成绩（占40%）三部分构成。 本实验包括的实验项目包括：
细胞传代培养 一.实验目的 初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物技术在医学上的 应用打下基础。 二、原理 从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生 长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接 观察 活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可 以与 体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较 经济， 因此成为生物学研究的重要手段。 细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养 为 原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞 分散 后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养， 传 代培养的累积次数就是细胞的代数。 细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受 温度、渗透压、ph值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌 操 作是细胞培养成败的关键。 三、材料和试剂 1、细胞：293细胞株 2、试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清） 3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、电动枪，培养板，吸液枪，5ml玻璃吸管、酒精 灯等 四、操作步骤 1、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。 2、加入1~2ml 0.25％胰酶溶液，使板底细胞都浸入溶液中。 3、马上吸走胰酶液，再次加入2ml左右的胰酶，同样马上吸去，再加入几滴胰酶放入 培养箱中消化几分钟 4、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液，再按照观察的生长情况确定的传代比例传代 5.根据确定的比例来取需要的量（剩余的细胞拿来做细胞计数），加入4ml左右的培养液 6.前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后，将培养板放入培养箱 7.收拾整理超净台 附：消化液配制方法： 称取2.5克胰酶蛋白酶，加入100ml10xpbs+纯水溶解到1l，滤器过滤除菌，4℃保存， 用前可在37℃下回温。 10x pbs配方：na2hpo4(14.2g) kh2po4(2.32g) nacl(80g) kcl(2.02g) (调至ph=7.4） 五、实验结果
山东大学实验报告2015年3月6 日 姓名闫于倓班级13级生命基地班学号201300140112 同组者：彭旸科目细胞生物学实验题目细胞融合一，实验目的： 1、了解动物细胞融合的常用方法。 2、学习化学融合的基本操作过程。 3、观察动物细胞融和过程中细胞的行为和变化。 二、实验用品 1、材料鸡血红细胞 2、试剂50%PEG、Hank’s溶液（pH7.4）、Alsever’s细胞保存液0.85%氯化钠溶液。 3、器材普通光学显微镜、离心机、量筒、载玻片、盖玻片离心管、废液缸等。 三、实验原理 细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括病毒诱导融合、化学诱导融和和电激诱导融合： 1、病毒诱导融和：仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融时也可介导细胞与细胞的融合。用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。
2、化学诱导融合：很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复过程中想接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。PEG是广泛使用的化学融合剂。 3、电激诱导融合：包括电诱导、激光诱导等。其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。 四、实验步骤 1、鸡血细胞的制备与保存（老师完成）。 2、取鸡血1ml+0.85%的NaCl溶液4ml，在1200r/min的离心机内离心5分钟。 3、将上一步的沉降血球（去上清液后，约0.1-0.2ml），加入GKN 液至4ml，制成细胞悬液。 4、有下面两种方法： 方法一：取上步得到的细胞悬液1ml，加0.5ml的PEG液，静置5min
中国海洋大学实验报告 姓名：常天易系年级：海洋生命学院2012级专业：生物科学 科目：分子细胞生物学实验学号：12050011006 PEG 介导的动物细胞融合技术 一、实验目的 （１）、通过实验，对体细胞融合有一个清醒的认识 （２）、通过ＰＥＧ介导鸡血细胞融合，初步掌握利用ＰＥＧ介导动物细胞融合的实验技术。 二、实验原理 真核细胞通过介导和培养，两个或多个细胞合并成一个双核或多核的细胞的过程称为细胞融合，通过此技术可以实现不同种类的细胞的融合。基因型相同的细胞融合称为同核体（ｈｏｍｏｋａｒｙｏｎ），基因型不同的细胞融合称为异核体（ｈｅｔｅｒｏｋａｒｙｏｎ） 目前，诱导细胞融合的技术主要有三种：病毒，聚乙二醇（ＰＥＧ），电激。第一种方法是通过生物病毒的方式，诱导细胞与细胞之间的融合。后两种方法通过化学物理的手段使得细胞膜的膜脂类分子的排列发生变化，去掉作用因素后，质膜分子的排列恢复原有的形态，
在恢复的过程中，可以诱导相接触的细胞发生融合。 ＰＥＧ介导的细胞融合，其融合效果受到以下几个因素的影响 ①、ＰＥＧ的分子量与浓度 ＰＥＧ的分子量及其浓度越大，细胞融合效果越明显，但对细胞的毒性也越大。本实验使用的ＰＥＧ分子量为４０００Ｄ，浓度为５０％ ②、ＰＥＧ的ｐｈ值 经验证，ＰＥＧ的浓度在８.０～８.２时，融合效果最好 ③、ＰＥＧ处理时间 处理实验越长，融合效果越好，但对细胞的毒性也越大。故一般将处理时间限制在１分钟以内。本实验不涉及后续的细胞培养，所以处理时间可适当放宽至数分钟 ④、融合时的温度 温度越高，细胞膜脂质的流动性越好，故在细胞可以承受的范围内，适当的提高温度有利于细胞的融合 三、实验材料 新鲜鸡血 ０.８５％生理盐水 ＧＫＮ液 ５０％ＰＥＧ液
山东大学实验报告2018年4月9日 ________________________________________ _________________________ 姓名：丁志康系年级：2016级组别：1-1 科目：细胞生物学实验题目：动物细胞融合实验学号：201600140055 实验序号：4 一、目的要求 1.了解动物细胞融合的常用方法。 2.学习化学融合的基本操作过程。 3.观察动物细胞融合过程中细胞的行为和变化。 二、实验原理 1、细胞融合的概念 细胞融合(cell fusion)，细胞遗传学名词，是在自发或人工诱导下，两个细胞或原生质体融合形成一个双核或多核的杂种细胞的过程，也被称为细胞杂交（cell hybridization）。 基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体（homokaryon）；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）。 同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称诱导融合。 2、细胞融合的方法及发展简史 ①诱导细胞融合的方法： a.生物法（病毒诱导融合）： 某些病毒因为其被膜中含有融合蛋白，可以介导病毒同宿主细胞融合，同时也可以介导细胞 与细胞的融合，所以这些病毒经紫外线灭活后可作为细胞融合的生物诱导剂使用，例如仙台 病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等。 b.化学法（化学诱导融合）： 很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性 卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后， 细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复过程中想接触的细胞由于接口处脂质双分子层的 相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导 融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。PEG是广 泛使用的化学融合剂。 c.物理法（电激诱导融合）： 包括电诱导、激光诱导等。其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排 布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表 面张力的作用，两细胞发生融合。电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。 ②细胞融合的发展简史 Muller于1838年观察到脊椎动物肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。 Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。 Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。 Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。
细胞工程实验小结 专业：生物技术班级：0801 姓名：励丹学号： 在本次暑期短学期的细胞工程实验课上，我们做了细胞工程中基础的几个实验——饲养层细胞的制备、动物细胞的原代培养（组织块法培养小鼠肝脏细胞，消化法培养小鼠肾脏细胞）、免疫脾细胞的制备、免疫脾细胞与骨髓瘤细胞的融合、细胞的超低温冻存与复苏及活性测定（MTT法检测）、抗体IgG的检测（ELISA 法），让我受益菲浅。其中很多知识在平时的学习中都是无法学习到的，其中很多实验都开阔了我们的视野，让我们获得了许多平时课堂上得不到的知识。在细胞工程实验课即将结束的时候，我对这个短学期的学习进行总结，总结细胞工程课程试验来的收获与不足。 这次的实验分成了8个小组，因为细胞工程的实验都须在无菌室内进行，而无菌室较小，所以各小组轮流进无菌室进行实验操作，故没轮到进无菌室的小组在外面的实验室进行简单的操练，所以较为轻松。 我们中的大多数人都是第一次进无菌室，对无菌室充满了好奇。而进无菌室也需要一重重地灭菌，以确保无菌室内的安全。首先需要用新吉尔灭溶液对需要带进无菌室的物品及我们的手进行消毒灭菌，然后进入缓冲间穿戴无菌服、帽、手套及口罩。在进入无菌室后还需要用酒精棉擦拭手、超净台以及一些物品。在无菌室内的操作都需在超净台上进行，而且需要在酒精灯边上进行，不可以远离超净台，否则可能使培养的细胞或培养液等受到污染，从而造成实验失败。 我们小组在细胞培养的实验中较为成功，细胞生长状态良好，没有出现染菌现象。在进行细胞超低温冻存于复苏实验时，我们组将两只小鼠的细胞混在一起，是的细胞数增加，相对的在冻存中损伤的细胞数也增多，这个实验应该算不成功的。 通过9天的细胞工程实验，我发现实验是细胞工程学学的实践，我们学到的许多理论都会最终作用于实验，也学到了许多其他专业课上没有教到的理论。很多实验都是需要花费许多心思去学习的，也是非常复杂的。我们学习理科的同学，更加要重视实验课，因为理论与实际结合是最重要。在每次实验之后，我们都要做实验报告，通过实验讲义和自己参阅资料，得知本次实验的目的、原理、所需仪器、实验步骤、实验中的要求及注意事项等问题。实验操作当然是细胞工程
细胞工程实验报告 专业：生物技术班级：0801 姓名：励丹学号：30804305 一、实验目的 1、了解动物细胞培养的相关实验器材以及实验前器材的清洗与消毒、无菌室灭菌与消毒等基本方法，以建立起无菌操作的概念。 2、了解和掌握动物细胞原代培养的基本方法，熟悉组织块法和消化法培养的基本操作过程。初步掌握无菌操作技术。 3、学习与了解细胞超低温冻存于复苏的基本原理，初步掌握培养细胞常规超低温冻存于复苏以及玻璃化超低温冻存于复苏的方法。 4、掌握ELISA测定抗体效价的方法，细胞的超低温冻存和复苏，及MTT法测定细胞活性的方法。 5、学习和掌握制备饲养层细胞的方法，为杂交瘤细胞的制备做准备。 6、学习从脾脏组织制备免疫细胞的方法，从免疫脾脏中制备免疫细胞悬液，用于杂交瘤细胞的融合。 7、学习和掌握动物细胞融合的基本方法，通过免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，并进行选择。 8、学会细胞形态的观察和分析，细胞技术等细胞培养中常见的问题。 二、实验原理 1、原代培养 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后直到第一次传代为止。原代培养首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织或器官，切成一定大小的组织块，直接或经消化分散成单个游离的细胞，在人工培养条件下，使其不断地生长、繁殖。 2、细胞活性测定——MTT法 MTT法是利用细胞线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶四氮唑蓝还原成难溶的蓝紫色结晶——甲瓒，经二甲基亚砜（DMSO）溶解后，在490nm处测吸收值，其吸收值可间接反映细胞的活性状态及活细胞数量。 3、培养细胞的超低温冻存于复苏 为了保持细胞株（系）遗传的稳定性以及非连续使用细胞的长期保存，建立了细胞
基于web的动物识别系统 一、实验目的 理解和掌握产生式知识表示方法及产生式系统的基本过程，能够利用Web编程技术建立一个基于产生式知识表示的简单的智能系统。 二、实验环境 (1) 硬件环境：网络环境中的微型计算机。 (2) 软件环境：Windows操作系统，Microsoft Visual Studio C#语言。 三、实验原理 该系统用到的表示方法是产生式表示方法，是陈述性知识表示方法的一种。 3.1 产生式表示的基本方法 （1）事实的表示
在产生式表示方法中，事实通常是用三元组或四元组来表示的。对确定性知识，一个事实可用一个三元组 （对象，属性，值）或（关系，对象1，对象2） 来表示。这种表示方式，在机器内部可用一个表来实现。 （2）规则的表示 规则描述的事物间的因果关系。规则的产生式表示形式常称为产生式规则，简称为产生式，或规则。其基本形式为 P→Q 或者 IF P THEN Q 其中，P是产生式的前提，也称为产生式的前件，它给出了该产生式可否使用的先决条件，用事实的逻辑组合来构成；Q是一组结论或操作，也成为产生式的后件，它指出当前提P满足时应该推出的结论或应该执行的操作。产生式的含义是：如果前提P满足，则可推出结论Q或执行Q所规定的操作。 2．产生式系统的基本结构及过程 通常，把用产生式知识表示方法构造的智能系统统称为产生式系统。一个产生式系统的基本结构包括综合数据库、规则库和控制系统这三个主要部分。 2.1综合数据库 综合数据库也称为事实库，是一个用来存放与求解问题有关的各
种当前信息的数据结构。在推理过程中，当规则库中某条规则的前提可以和综合数据库中的已知事实相匹配时，该规则被激活，由它推出的结论将被作为新的事实放入综合数据库，成为后面推理的已知事实。 2.2规则库 规则库是一个用来存放与求解问题有关的所有规则的集合。它包含了将问题从初始状态转换成目标状态所需要的所有变换规则。 2.3控制系统 控制系统也成为推理机，它由一组程序组成，用来控制整个产生式系统的运行，决定问题求解过程的推理路线，实现对问题的求解。其主要工作如下： （1）按一定策略从规则库中选择规则与综合数据库的已知事实进行匹配。 （2）当匹配成功的规则多于一条时，推理机构应该能够按照某种策略从中选出一条规则去执行。 （3）对要执行的规则，如果该规则的后件不是问题的目标，则当其为一个或多个结论时，把这些结论加入到综合数据库中；当其为一个或多个操作时，执行这些操作。 （4）对要执行的规则，如果该规则的后件满足问题的结束条件，则停止推理。 （5）在问题求解过程中，记住应用过的规则序列，以便最终能够给出问题的解路径。