基因工程常用工具酶及应用共42页文档

基因工程工具酶引言基因工程是一门利用重组DNA技术来改变生物体遗传性状的学科。

在基因工程的过程中，基因工程工具酶发挥着关键的作用。

本文将介绍几种常用的基因工程工具酶，包括限制性内切酶、连接酶和修饰酶。

一、限制性内切酶1.1 定义限制性内切酶（Restriction Enzyme）是一类具有特异性切割DNA双链的酶。

它可以识别并切割DNA的特定序列，通常这个序列是对称的，在切割后会产生特定的片段。

1.2 工作原理限制性内切酶能够通过识别和结合DNA的特定序列来进行切割。

它们通常识别的序列是4到8个碱基对长，具有一定的对称性。

一旦内切酶与特定序列结合，它会切断DNA的链，在特定的位置形成断裂，从而将DNA切割成特定的片段。

1.3 应用限制性内切酶在基因工程中有着广泛的应用。

它们可以用于构建基因工程载体、进行DNA片段的精确克隆等。

通过选择适当的限制性内切酶，可以对DNA进行特定的切割和连接，从而实现对目标基因的定向操作。

二、连接酶2.1 定义连接酶（Ligase）是一种酶类，能够将两条DNA片段连接起来。

在基因工程中，连接酶通常被用于连接目标基因和载体。

2.2 工作原理连接酶通过催化两条DNA片段之间的磷酸二酯键的形成来连接DNA。

它可以将两条具有互补末端的DNA片段连接在一起，形成一个新的DNA分子。

2.3 应用连接酶在基因工程中的应用非常广泛。

它们可以用于构建重组DNA分子、进行目标基因的插入等。

通过连接酶的作用，可以将多个DNA片段连接起来，构建出符合需要的重组DNA分子。

三、修饰酶3.1 定义修饰酶是指能够修饰DNA分子的酶类。

在基因工程中，修饰酶通常被用于添加或去除特定的DNA序列。

3.2 工作原理修饰酶可以通过催化酸解或碱解反应来改变DNA分子的结构。

它们可以添加或去除DNA上的甲基基团、酶解酶切位点等。

3.3 应用修饰酶在基因工程中起着重要的作用。

它们可以用于DNA甲基化的分析、目标基因的修饰等。

第二章 基因工程中常用的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA 分子的特异切割分子的特异切割DNA 甲基化酶—用于DNA 分子的甲基化分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA 和RNA 的连接的连接核酸聚合酶—用于DNA 和RNA 的合成的合成核酸酶—用于DNA 和RNA 的非特异性切割的非特异性切割核酸末端修饰酶—用于DNA 和RNA 的末端修饰的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。

用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。

§2-1 核酸内切限制酶定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸内切酶。

双链结构的核酸内切酶。

到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。

种以上不同的核酸内切限制酶。

核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图）一 、限制修饰系统的种类（图）限制修饰系统的种类（图）二、 限制性内切酶的定义、命名1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II 型限制酶。

型限制酶。

2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。

限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。

例如：Hin d Ⅲ 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae ，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。

表示分离到的第三个限制酶。

Eco RI RI——Escherichia coli RI RI Hin d Ⅲ—Haemophilus influensae d ⅢSac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA 分子中的特定序列，但它们的切割作用却是随机的，在距特异性位点至少1000bp 的地方可以随机地切割DNA 分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。

基因工程的工具酶⏹限制性核酸内切酶⏹DNA连接酶⏹DNA聚合酶⏹碱性磷酸酶⏹末端脱氧核苷酸转移酶限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶.是体外剪切基因片段的重要工具限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具,而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定防御机制：⏹任何物种都有排除异物、保护自身的防御机制⏹人:免疫系统⏹细菌：限制与修饰系统寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段, 各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶,对自身的DNA进行了修饰,限制性酶对修饰过的DNA不能起作用.这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。

限制酶(restriction enzyme）修饰酶(modifying enzyme）核酸酶切位点：既可以在3ˊ，5ˊ—磷酸二酯键的3ˊ酯键处（A）,也可以在5ˊ酯键处（B）切断磷酸二酯键1）核酸限制性内切酶的类型2）核酸限制性内切酶的基本特性3）同裂酶和同尾酶4）核酸限制性内切酶的命名法5）影响核酸限制性内切酶活性的因素限制性核酸内切酶的类型及特性按照限制酶的组成、与修饰酶活性的关系以及切断核酸的情况不同,分为三类：Ⅰ型Ⅱ型＊Ⅲ型第一类（I型）限制性内切酶:能识别专一的核苷酸顺序并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因如：Eco B、Eco K等第二类(II型)限制性内切酶：能识别专一的核苷酸顺序（回文对称顺序）并在该顺序内的固定位置上切割双链是DNA重组技术中最常用的工具酶之一这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸,少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的回文对称顺序：有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同⏹切割后形成具有粘性末端（cohesive end)的DNA片段⏹切割后形成具有平末端（blunt end）的DNA片段限制酶在识别序列的对称轴上切割,形成的DNA片段没有突出的单链第三类（III型)限制性内切酶也有专一的识别顺序,但不是对称的回文顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链.但这几个核苷酸对不是特异性的。