基因工程的工具酶解析

一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。

2．类型：来自原核生物，有三种类型。

Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。

Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。

另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。

同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。

与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。

常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。

显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。

但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。

Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。

三种限制酶的区别如下表所示：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处）与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。

基因工程工具酶引言基因工程是一门利用重组DNA技术来改变生物体遗传性状的学科。

在基因工程的过程中，基因工程工具酶发挥着关键的作用。

本文将介绍几种常用的基因工程工具酶，包括限制性内切酶、连接酶和修饰酶。

一、限制性内切酶1.1 定义限制性内切酶（Restriction Enzyme）是一类具有特异性切割DNA双链的酶。

它可以识别并切割DNA的特定序列，通常这个序列是对称的，在切割后会产生特定的片段。

1.2 工作原理限制性内切酶能够通过识别和结合DNA的特定序列来进行切割。

它们通常识别的序列是4到8个碱基对长，具有一定的对称性。

一旦内切酶与特定序列结合，它会切断DNA的链，在特定的位置形成断裂，从而将DNA切割成特定的片段。

1.3 应用限制性内切酶在基因工程中有着广泛的应用。

它们可以用于构建基因工程载体、进行DNA片段的精确克隆等。

通过选择适当的限制性内切酶，可以对DNA进行特定的切割和连接，从而实现对目标基因的定向操作。

二、连接酶2.1 定义连接酶（Ligase）是一种酶类，能够将两条DNA片段连接起来。

在基因工程中，连接酶通常被用于连接目标基因和载体。

2.2 工作原理连接酶通过催化两条DNA片段之间的磷酸二酯键的形成来连接DNA。

它可以将两条具有互补末端的DNA片段连接在一起，形成一个新的DNA分子。

2.3 应用连接酶在基因工程中的应用非常广泛。

它们可以用于构建重组DNA分子、进行目标基因的插入等。

通过连接酶的作用，可以将多个DNA片段连接起来，构建出符合需要的重组DNA分子。

三、修饰酶3.1 定义修饰酶是指能够修饰DNA分子的酶类。

在基因工程中，修饰酶通常被用于添加或去除特定的DNA序列。

3.2 工作原理修饰酶可以通过催化酸解或碱解反应来改变DNA分子的结构。

它们可以添加或去除DNA上的甲基基团、酶解酶切位点等。

3.3 应用修饰酶在基因工程中起着重要的作用。

它们可以用于DNA甲基化的分析、目标基因的修饰等。

基因工程所用到的酶基因工程中所用到的酶。

一、限制性核酸内切酶。

1. 作用。

- 限制性核酸内切酶能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点切割DNA分子。

例如，EcoRⅠ识别的序列是GAATTC，它会在G和A之间切割DNA双链。

这种酶在基因工程中的作用至关重要，它就像是一把“分子剪刀”，可以将目的基因从供体DNA中精准地切割下来。

- 原因是基因工程常常需要将特定的基因片段进行分离和操作。

如果没有这种精确切割的酶，就无法准确获取目的基因，后续的基因重组等操作也就无法进行。

2. 类型。

- 限制性核酸内切酶分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。

其中Ⅱ型限制性核酸内切酶是基因工程中最常用的类型。

- Ⅰ型限制性核酸内切酶的切割位点不固定，离识别位点较远，并且需要ATP、Mg²⁺和S - 腺苷甲硫氨酸等多种辅助因子，这使得其在基因工程中的应用受到限制。

而Ⅱ型限制性核酸内切酶只需要Mg²⁺作为辅助因子，它的识别序列和切割序列是固定的，通常是4 - 8个碱基对的回文序列，这使得它能够非常精准地切割DNA，方便基因工程操作。

Ⅲ型限制性核酸内切酶也需要多种辅助因子，且切割位点不固定，所以应用较少。

二、DNA连接酶。

1. 作用。

- DNA连接酶能够将两个具有相同粘性末端或者平末端的DNA片段连接起来。

在基因工程中，它的作用是将切割下来的目的基因与载体（如质粒）连接在一起，形成重组DNA分子。

例如，T4 DNA连接酶可以连接粘性末端和平末端的DNA片段，在构建基因表达载体时起到关键的连接作用。

- 原因是基因工程的核心是构建重组DNA分子，而将目的基因和载体连接是构建重组DNA的关键步骤。

如果没有DNA连接酶，目的基因和载体就无法形成一个完整的重组分子，也就无法将目的基因导入受体细胞进行表达。

2. 种类。

- 常见的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。

E.coli DNA连接酶只能连接粘性末端，并且需要NAD⁺作为辅助因子；而T4 DNA连接酶既能连接粘性末端，也能连接平末端，需要ATP作为辅助因子。