基因工程专题1：基因芯片和第二代测序技术简介

第三代测序技术（单分子实时DNA测序）与第二代测序技术（高通量测序技术）简介第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介第三代测序技术简介如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会认为他异想天开，没有一点生物的sense。

我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了～这个就是被称为第三代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time(SMRT) DNA Sequencing”(单分子实时DNA测序)。

我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座，根据自己粗浅的理解记录整理一下。

要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。

第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。

显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子”。

但是它可以实时记录荧光的强度变化。

当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。

当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。

这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。

第二个是纳米微孔。

因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候，DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景。

这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。

Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔[zero-mode waveguides (ZMWs)]，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。

在这么小的孔内，DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。

而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成，荧光基团被DNA聚合酶切除为止(见图)。

二代基因测序原理接下来，文库构建是将DNA片段连接到适当的DNA测序模版上，以建立DNA文库。

这通常涉及到DNA片段的断裂、连接到适配体和文库放大。

适配体是一种包含特定序列的DNA片段，用于辅助连接和模版扩增的引物。

在文库构建完成后，进行模版扩增。

这一步骤使用PCR技术，通过引物扩增文库中的DNA片段，生成大量的模版DNA。

PCR扩增周期的次数决定了特定DNA片段的拷贝数。

随着模版DNA量的增加，进入测序阶段。

二代基因测序技术主要有Illumina（原称Solexa）、Ion Torrent（美国盖奥因生物公司）和454测序（Roche）等，其中Illumina是最常用的一种。

Illumina测序平台以反应塔阵列为基础，使用化学方法进行核酸链延伸和显色标记。

首先，单个DNA模板附着到玻璃底片的合成警告员上，随后通过PCR进行扩增。

随着DNA扩增的进行，每个DNA模板会产生大量分子，每一个分子都将与一个反应塔阵列中的探针相匹配。

然后，每一个DNA模板上的反应塔中都会加入一个不完全互补的碱基，只能链延伸一次。

在每个循环的末尾，使用碱基的特定颜色标记已添加的碱基。

通过检测每个循环中的荧光信号，可以确定加入的碱基。

最后，数据分析是测序结果的处理和分析阶段。

这一步骤主要包括序列质量控制、序列拼接、序列比对和变异检测等过程。

数据分析的目标是从原始的测序数据中得出有效的生物学信息。

总结起来，二代基因测序的原理基于DNA的扩增和测序。

通过逐步处理DNA样本，建立文库，进行模版扩增，测序和数据分析，可以高效地获得大量的基因组信息。

这种技术的广泛应用已经推动了基因组学、转录组学和表观基因组学等领域的发展，并为疾病的研究和药物的开发提供了重要的基础。

第三代测序技术（单分子实时DNA测序）与第二代测序技术（高通量测序技术）简介第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介第三代测序技术简介如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会认为他异想天开，没有一点生物的sense。

我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了～这个就是被称为第三代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time(SMRT) DNA Sequencing”(单分子实时DNA测序)。

我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座，根据自己粗浅的理解记录整理一下。

要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。

第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。

显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子”。

但是它可以实时记录荧光的强度变化。

当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。

当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。

这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。

第二个是纳米微孔。

因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候，DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景。

这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。

Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔[zero-mode waveguides (ZMWs)]，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。

在这么小的孔内，DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。

而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成，荧光基团被DNA聚合酶切除为止(见图)。

基因芯片技术简介及应用随着基因组学研究的不断深入，人类已进入一个崭新的生物世纪，基因芯片在基因功能研究、临床诊断及新药开发等方面显示了巨大的威力，被誉为基因功能研究领域最重要的技术之一。

一、基因芯片技术基本原理基因芯片的创意来自于计算机芯片。

它和计算机芯片一样，具有超微化、高度集成、信息贮存量大等特点，所不同的是，计算机芯片采用的是半导体集成电路，而基因芯片是以基因片段作为“探针”来进行工作的。

（一）基因芯片的定义基因芯片（gene chip）又称DNA芯片，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，样品DNA或RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光等标记分子，然后按碱基配对原理与固定的探针杂交，再通过荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一探针的信号进行处理，从而迅速得出所需要的信息。

基因芯片技术工作原理与经典的核酸分子杂交是一致的，都是应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析。

在一块1cm2大小的基因芯片上，根据需要可固定数以千计甚至万计的基因片段，以此形成一个密集的基因方阵，与标记的样品分子进行杂交，实现对成千上万个基因的高通量同步检测（见文末彩图-1）。

图-1 经荧光扫描后的芯片图示（二）基因芯片技术的主要特点基因芯片技术归纳起来，具有高并行性、多样性、微型化和自动化这四大特点。

高并行性有利于基因芯片所示图谱的快速对照和阅读，效率大为提高；多样性则提供了样品的多指标测定，每块芯片上都含有成百上千种的寡核苷酸探针或cDNA探针，能够用于基因突变、单核苷酸多态性（SNP）、细菌分型等需要高通量的检测；微型化的好处在于对样品的需要量非常少，而且还能节省试剂用量，降低检测成本；自动化使得人力、物力投入减少，检测时间缩短并保证了质量。

同时，它还具有操作简便、信息综合处理能力强、结果可靠和仪器配套齐全等优势，因而备受青睐。

原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d NTP，其中的一种用放射性P32标记 )存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸 ( dd NTP )，因为双脱氧核苷没有3’-O H，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷，链就可以继续延长。

如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。

反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳，分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。

经过放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。

Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。

后来在此基础上发展出多种DNA 测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。

荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger 原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了D NA测序的速度和准确性。

20世纪80 年代初Jorgenson 和 Lukacs提出了毛细管电泳技术( c a p il l ar y el ect r ophor es i s )。

1992 年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳 ( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法，并采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25只毛细管并列电泳，每只毛细管在内可读出350 bp，DNA 序列,分析效率可达6 000 bp/h。

1995年Woolley研究组用该技术进行测序研究，使用四色荧光标记法，每个毛细管长，在9min内可读取150个碱基，准确率约 97 % 。

目前, 应用最广泛的应用生物系统公司 ( ABI ) 37 30 系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的D NA测序仪。

如ABI3730XL 测序仪拥有 96 道毛细管, 4 种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记, 在通过毛细管时不同长度的 DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发, 发出不同颜色的荧光, 被 CCD 检测系统识别, 并直接翻译成 DNA 序列。

DNA的二代测序原理及应用概述DNA的二代测序技术是一种高通量、高效率的DNA序列分析方法，已经广泛应用于基因组学研究、环境微生物学、生物医学、农业科学等领域。

本文将介绍DNA的二代测序的原理以及其在不同领域的应用。

原理DNA的二代测序技术主要基于DNA的复制和测序反应的不同原理。

主要有以下几种常见的二代测序技术：1. Illumina测序技术Illumina测序技术是目前最常用的二代测序技术之一。

它基于桥式PCR扩增和红外烯酮技术，通过将DNA片段连接到测序芯片上的固定位置，使用荧光标记的碱基逐个加入，在每个周期后使用摄像机记录荧光信号，并通过计算机软件将数据转化为DNA序列信息。

2. Ion Torrent测序技术Ion Torrent测序技术基于离子探测和DNA聚合酶链反应。

通过在测序芯片上检测关联于DNA聚合酶链反应释放的氢离子，来测定DNA序列。

3. PacBio测序技术PacBio测序技术利用了单分子实时测序的原理。

它使用DNA聚合酶在DNA模板上合成新的DNA链，并通过检测DNA聚合酶在每个碱基加入过程中所散发的光信号来测序。

4. Oxford Nanopore测序技术Oxford Nanopore测序技术基于DNA分子通过纳米孔的速度和电导率的差异来实现测序。

将DNA添加到纳米孔中，当DNA分子通过孔道时，它会散发出微弱的电流信号，并根据这些信号来确定DNA的序列。

应用DNA的二代测序技术在许多领域中得到了广泛的应用。

以下列举了几个常见的应用领域：1. 基因组学研究DNA的二代测序技术在基因组学研究中起着重要的作用。

它可以用于确定物种的基因组序列，揭示基因组的结构和功能，研究基因的表达和调控，以及研究遗传变异的机制等。

2. 疾病诊断和治疗DNA的二代测序技术在疾病诊断和治疗中有着重要的应用。

它可以用于寻找与疾病相关的基因突变，帮助诊断疾病，评估疾病风险，预测治疗效果，以及指导个体化治疗方案。

二代测序技术的原理与应用二代测序技术，也被称为高通量测序技术，是一种快速、高效的DNA 测序技术，相对于传统的Sanger测序技术，具有更高的测序速度、更低的成本和更高的测序深度。

二代测序技术的原理与应用主要包括以下几个方面。

一、原理1. SBS（Sequencing by Synthesis）技术SBS技术是Illumina公司最早推出的二代测序技术，其原理是将接头连接的DNA模板固定在流胶片上的一些位置上，通过引物和DNA聚合酶引发的PCR反应，在流胶片上合成新链，并使用带有多个荧光标记的核酸碱基以逐个加入新链中，每个碱基的加入都会释放出荧光信号，通过检测这些荧光信号就可以确定DNA的序列。

2. Pyrosequencing技术Pyrosequencing技术是Roche公司开发的一种基于酶促反应的二代测序技术，其原理是在每个碱基加入新链时，由于核苷酸的化学反应产生的PPi（高能键的磷酸），会引发一系列的酶促反应，生成可探测的光信号。

通过检测这些光信号的数量和强度，可以推断出DNA的序列。

3. Ion Torrent技术Ion Torrent技术是由Ion Torrent Systems公司开发的一种基于电离测序的二代测序技术，其原理是在每个碱基加入新链时，由于核苷酸的化学反应产生的H+离子数量与碱基数目成正比，通过检测这些H+离子的数量，可以推断出DNA的序列。

二、应用1.基因组学研究二代测序技术可以用来对各种生物体的基因组进行全面、高通量的测序，从而揭示物种的基因组组成、基因结构和基因功能的相关信息。

这对于研究基因组进化、物种之间的亲缘关系、基因家族、基因变异和突变等具有重要意义。

2.转录组学研究二代测序技术可以用来对生物体的转录组进行全面、高通量的测序，从而揭示在不同生理或病理状态下基因的表达情况和调控网络的重构。

这对于深入了解基因调控机制、寻找新的治疗靶点、诊断疾病和评估药物药效等具有重要意义。

三分钟了解4代基因测序技术基因检测技术是近年来伴随“精准医疗”概念的提出而迅速发展起来的一门科学技术，它可以从基因组机制上阐释遗传学、发育生物学、进化生物学等学科的经典概念，在全基因组水平延伸了染色体高级构象、细胞异质性、功能模块等新概念，为精准医学开辟了应用性新领域。

近年来，随着分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，基因检测成为临床诊断和研究的热点。

基因检测技术应用于遗传病诊断、罕见病、产前筛查、临床个体用药以及肿瘤监诊断疗等领城的科研成果也层出不穷。

目前，应用较广的基因检测技术大致分三类：基因测序、以核酸扩增为基础的PCR技术，以荧光杂交检测为基础的FISH技术。

这三类技术沟通构成了基因检测基础，大部分基因检测项目都有赖于这三项基础技术开展。

与PCR和FISH技术相比，基因测序技术可直接读取DNA分子的30亿个碱基序列，具有高通量、数据量大的特点。

此外，基因芯片技术应用范围也较广。

基因检测技术对比在本文中，小编汇总了4代基因测序技术并比较其优缺点，以期帮助正在从事基因检测工作或行业的您，了解这项技术的发展历程。

基因组学与基因检测技术的概述基因组学是伴随“人类基因组计划”发展起来的一门新兴学科，是新世纪科学的莫基学科，已成为生命科学发展的基础性和引领性学科。

20世纪50年代，Watson和Crick提出DNA双螺旋结构后，人们对基因的遺传学功能逐渐有所认识，并开始致力于DNA序列检测的探索。

1975年Sanger等发明了第一代测序技术并在1980年完成了人类历史上第一个基因组序列¬——噬菌体X174的测序，它标志着人类正是进入基因组学时代。

从1985年人类基因组计划提出，到2001年人类基因组草图完成，基因组学的研究也从以全基因组测序转向以基因功能鉴定为日标的后基因组时代。

基因检测技术经过近70年的发，从第一代的双脱氧链测序技术已经发展到第四代固态纳米测序技术。

测序技术的发展使人们能够方便准确地获取大量的基因组信息，并将其应用于疾病的研究，借此人们遜渐认识到基因变异与疾病发生发晨的关系。

二代测序方法原理
二代测序方法，也被称为下一代测序或高通量测序，是一种基于序列的扩增和检测的测序技术。

其基本原理是通过捕捉新添加的碱基所携带的特殊标记来确定DNA的序列。

在二代测序中，单个DNA分子必须扩增成由相同DNA组成的基因簇，然后进行同步复制，以增强荧光信号强度从而读出DNA序列。

这一过程包括文库构建、成簇和测序三个主要步骤。

首先，文库构建即为测序片段添加接头。

DNA片段需要加接头修饰才能进行上机测序，这个过程称为二代测序的文库构建。

其次，成簇是DNA片段被扩增的过程，该过程在流动池中完成。

所有的DNA片段都会被克隆扩增，桥式扩增后，反向链会被切断洗去，仅留下正向链。

为防止特异性结合重新形成单链桥，3‘端被封锁。

最后，测序是在Flowcell中加入荧光标记的dNTP和酶，由引物起始开始合成子链。

通过捕捉新添加的碱基所携带的特殊标记来确定DNA的序列。

现有的技术平台主要包括Roche的454 FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等。

由于在二代测序中，基因簇复制的协同性降低，导致碱基测序质量下降，这严格限制了二代测序的读长（不超过500bp），因此，二代测序具有通量高、读长短的特点。

以上内容仅供参考，建议查阅关于二代测序方法的资料、文献，或者咨询生物信息学专家，获取更准确的信息。

测序技术的前世今生测序技术的发展历程第一代测序技术（Sanger测序）第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）,在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。

原理：ddNTP的3’无羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP （分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。

第二代测序技术(NGS)第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。

经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa、Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。

其大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多，大多只有100bp-150bp。

1.illuminaIllumina公司的Solexa和Hiseq是目前全球使用量最大的第二代测序机器，占全球75%以上，以HiSeq系列为主，技术核心原理都是边合成边测序的方法，测序过程主要分为以下4步：步：1）构建DNA测序文库测序文库DNA分子用超声波打断成200bp-500bp长的序列片段，并在两端添加上不同的接头。

2）测序流动槽（flowcell）结构：Flowcell是测序的载体，课吸附DNA文库，每个flowcell有8条lane，每个lane有2镜头课捕获荧光信号。

生物芯片与第二代测序技术丁香园答...生物芯片与第二代测序技术是两种重要的高通量基因组学研究方法，在生命科学研究领域有着极其广泛的应用前景。

经过近20年的发展，生物芯片技术逐渐成熟，正在向着“高密度，灵活定制，微量样品” 的方向发展，从一个实验室技术发展成一个基因组学研究所依赖的，快速产生海量数据的常规手段，正在逐步走向产业化。

第二代测序技术是最近几年建立的高通量技术，其特点是一次测序反应可以产生千万到亿条序列，而测序的成本大大降低，到2010年已经进入数千美元测定一个人全基因组的时代。

上海伯豪生物技术有限公司/生物芯片上海国家工程研究中心受丁香园网站邀请，在其论坛发布了生物芯片与第二代测序技术答疑专帖。

以下精选（2010年9月—2011年9月）部分问题，希望能帮助大家解决针对生物芯片及二代测序方面的疑问！问题1. 如果要对人类的肿瘤组织进行全基因组测序，是进行de novo 还是 Re-Sequence？人类的全基因组测序结果已经公布（千人基因组），但是肿瘤组织每种肿瘤、不同病理类型、不同种族差异很大。

答：对人类样本测序都是Re-Sequence。

因为已经有参考序列，在NGS中，参考序列的意义是搭建一个框架，然后NGS得到的数据就可以根据这个框架搭建上去（拼接）。

虽然不同的个体，不同的肿瘤组织基因组序列不同，但是框架是一样的。

NGS得到的数据依靠框架重新拼接起来，就可以得到各个组织独特的基因组序列。

问题 2. 我准备在特定病人群取血，测定血浆/血清中的microRNA,但是之前没有做过这类的试验，并且经过我这几天的资料查询，血浆/血清的miRNA只能做表达谱，但是似乎不能完成功能谱分析，原因可能是量太少，来源不清等问题。

现在的问题是：正常人血清中也含有几十种miRNA.如何避免检测这些miRNA,并且据文献报道，血清中的miRNA多以蛋白结合的方式存在，这对提取RNA是否造成了相当的影响？答：正常人的血清中是含有microRNA，但是我们并不需要避免检测它们。

二代测序原理范文二代测序是指第二代高通量测序技术，也称为下一代测序技术。

它是相对于第一代测序技术的一种新一代测序技术。

二代测序技术以其高通量、高准确性和低成本的特点，对生命科学领域的研究和应用产生了革命性的影响。

二代测序技术有多种不同的原理，其中最常见的是Illumina公司的技术，也被称为SBS（Sequencing by Synthesis）技术。

下面将以Illumina技术为例，详细介绍二代测序的原理。

Illumina二代测序技术的主要步骤包括文库构建、DNA片段连接、PCR扩增、DNA片段固定到测序芯片上、质控、测序和数据分析等。

具体流程如下：首先，将DNA样本加工成文库。

文库的构建过程包括将DNA剪切成适当大小的片段，然后加上适配体（由引物和适配物组成，用于连接DNA片段和测序引物），并进行片段连接。

然后，将DNA片段连接到测序芯片上。

测序芯片是一块玻片，上面有数百万个96孔小孔，每个小孔下面有数百万个聚合物支持点。

通过较长的捕获序列将DNA片段固定在聚合物支持点上。

接下来是PCR扩增。

扩增的目的是将固定在测序芯片上的DNA片段复制成数百万个相同的片段，以便进行测序。

PCR扩增需要引物和适配体的配对，引物用于定向扩增目标DNA片段。

之后是测序。

测序分为两个步骤：首先是引物结合和延伸，其次是信号检测和图像化。

在引物结合和延伸步骤中，测序芯片被浸入含有测序试剂的流动细胞，并且通过合成DNA链中每个位置的碱基来进行序列测定。

在每个碱基的加入过程中，会释放出荧光信号。

接下来，这些信号被检测到，并转化为电信号，然后被图像化。

最后，进行数据分析。

测序仪将生成原始数据，然后需要进行数据分析以获取最终的测序结果。

数据分析的过程包括原始数据的去噪、序列拼接和质量控制等。

总而言之，二代测序技术通过将DNA样本分解为数百万个小片段，并对它们进行多次重复的扩增和测序，最终得到完整的DNA序列信息。

这一技术的高通量、高准确性和低成本的特点，使其在基因组学、遗传学、生物医学研究和临床诊断中有着广泛的应用。

关于⼆代测序（NGS）的若⼲讨论⽣物芯⽚与第⼆代测序技术是两种重要的⾼通量基因组学研究⽅法，在⽣命科学研究领域有着极其⼴泛的应⽤前景。

经过近20年的发展，⽣物芯⽚技术逐渐成熟，正在向着 “⾼密度，灵活定制，微量样品” 的⽅向发展，从⼀个实验室技术发展成⼀个基因组学研究所依赖的，快速产⽣海量数据的常规⼿段，正在逐步⾛向产业化。

第⼆代测序技术是最近⼏年建⽴的⾼通量技术，其特点是⼀次测序反应可以产⽣千万到亿条序列，⽽测序的成本⼤⼤降低，到2010年已经进⼊数千美元测定⼀个⼈全基因组的时代。

那么，⼆代测序会不会取代芯⽚技术呢？是不是Sanger测序（⼀代测序不⽤了呢）？下⾯主要针对在⼀个帖⼦上发的问题总结⼀下，主要讨论⼆代测序与基因芯⽚的区别与优缺点：讨论 1 ⼆代测序与基因芯⽚的区别与优缺点。

⽣物芯⽚与第⼆代测序都是基因组学研究的重要⼿段。

经过近20多年的发展，⽣物芯⽚相对第⼆代测序⽽⾔，优势在于价格便宜，便于分析。

缺点则在于必须有参考序列（因为⽣物芯⽚的探针设计就是根据参考序列设计的）。

当然还有很多技术上的优缺点，这⾥主要讨论他们的本质，来消除很多⼈对于⼆者的误解，认为基因芯⽚被⼆代测序取代⾄少在⽬前看来还是⽐较⽚⾯的。

相同点：⾼通量和⼀些应⽤领域上的重合（⽐如表达谱，SNP）不同点：1.本质不同：基因芯⽚的本质是核酸杂交。

只不过是同时进⾏上万个核酸杂交⽽已；第⼆代测序在本质上是PCR.先⽤PCR的⽅法构建测序⽂库（SOLiD的油包⽔PCR，Solexa的桥式PCR），随后再以“边合成边测序”或者“连接介导的测序”，得到序列信息。

2.应⽤不同：由于是核酸杂交，不需要扩增。

因此基因芯⽚是个相对封闭的系统，只能检测序列已知的⽚段的浓度；另外，由于不需要扩增，保真性也较好。

第⼆代测序本质上是测序，因此是个开放的系统，能检测到那些没有参考序列的⽚段，并且给出序列。

由于在构建测序⽂库的过程中有PCR放⼤的过程，因此相对灵敏度较⾼（需要⾼覆盖倍数的测序深度配合），但也由于PCR放⼤过程的不均衡性，样品中⽚段的内在浓度⽐例常常会被破坏掉。

第二代DNA测序技术1.概述DNA测序（DNA sequencing）作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的应用。

早在DNA双螺旋结构（Watson and Crick,1953)被发现后不久就有人报道过DNA测序技术，但是当时的操作流程复杂，没能形成规模。

随后在1977年Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法，同年A.M.Maxam和W.Gilbert发明了化学降解法。

Sanger法因为既简便又快速，并经过后续的不断改良，成为了迄今为止DNA测序的主流。

然而随着科学的发展，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序，都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，第二代测序技术（Next-generation sequencing)应运而生。

第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。

这三个技术平台各有优点，454 FLX的测序片段比较长，高质量的读长（read）能达到400bp；Solexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有454测序的1/10；SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，是目前第二代测序技术中准确度最高的。

虽然第二代测序技术的工作一般都由专业的商业公司来完成，但是了解测序原理、操作流程等会对后续的数据分析有很重要的作用，下文将以Illumina/Solexa Genome Analyzer 测序为例，简述第二代测序技术的基本原理、操作流程等方面。