红豆杉属基因的密码子偏性分析摘要：运用emboss（the european molecular biology open software suite）软件包中的chips（condon heterozygosity in a protein coding sequence）和cusp（create a condon usage table）程序对红豆杉属的52个基因的密码子偏性进行综合分析，并与大肠杆菌、酵母、拟南芥和水稻的密码子偏性进行比较。
结果表明，红豆杉属基因的nc（有效密码子数）为45～58，大部分密码子使用频率较为一致。
部分氨基酸密码子使用频率存在较大差异，如ala、asp、phe、gly、his、asn、arg、thr、tyr等。
红豆杉属基因密码子偏性与拟南芥等双子叶植物较接近，与原核生物和单子叶植物相差较远。
关键词：红豆杉属；密码子偏性；chips；cusp中图分类号：s791.49 文献标识码：a 文章编号：0439-8114（2013）10-2427-04核酸是蛋白质合成的模板，编码天然蛋白质的20种氨基酸的密码子共61种，每一种氨基酸可由1个密码子（met和trp）至6个密码子（arg、leu和ser）编码[1]。
编码同一种氨基酸的密码子在不同物种中具有不同的使用频率，这就造成密码子偏性（codon bias）[2]。
从原核生物到真核生物，这种基因组中同义密码子使用偏性的现象普遍存在，它的产生与多种因素有关，如基因表达水平、g/c含量、trna的丰富性等[3]。
密码子偏性的产生与基因的碱基组成、表达水平、编码蛋白的结构与功能等众多因素有关，且各因素间还可能相互影响，因而进行密码子偏性分析是一个较为复杂的问题。
从这些复杂的现象中分析并发现内在规律，将对新基因的预测、基因功能和表达调控机制研究、基因编码蛋白的细胞定位及分子进化研究等具有重要指导意义。
紫杉醇是从双子叶植物红豆杉（taxus brevifolia）中提炼出来的具有天然活性的双萜抗癌药物[4]，是1971年从短叶红豆杉的树皮、树根和枝叶中提炼出来的[5]，被广泛用于卵巢癌、非小细胞肺癌、乳腺癌等癌症的治疗[6]。
目前紫杉醇主要的合成方法是化学合成，但是收益低、成本高，从红豆杉植物中提取紫杉醇会造成严重的资源破坏。
产量不足，带动了紫杉醇合成的全方位的研究，其中利用生物工程方法实现紫杉醇的高产合成成为研究热点。
许多科学家希望实现紫杉醇合成基因在大肠杆菌等微生物中异源表达来实现紫杉醇的生物合成。
但是蛋白质在异源宿主中表达一般会受到限制，因为编码这些蛋白质的核酸序列往往含有宿主不喜欢使用的密码子，从而降低了表达效率[7]。
因此，分析红豆杉属植物基因的密码子偏性对于选择基因外源表达的合适的宿主有重要意义。
研究利用emboss（the european molecular biology open software suite）软件，以麦迪红豆杉和东北红豆杉为主，从红豆杉属植物中选取52个基因，对其编码区进行密码子偏性分析，并与大肠杆菌、酵母、拟南芥和水稻的密码子偏性进行比较，为利用生物工程方法实现紫杉醇的生物合成提供参考。
1 材料与方法1.1 红豆杉基因来源以麦迪红豆杉和东北红豆杉为主，从红豆杉属植物中选取52个基因。
登录号分别为ay724737，gu568338， fj608574， eu078561，af457109，af228104， hb792670， fb922725， ay675557，ay461811，hb792772， fb922713， gu568337，ay563630， fb922731，ay453402， hb792790，af466397， bd313599， hb792668，ay453403，dq836053， ay644708， ay628433， hb792746，fb922723，ay452666， ay277740， ay326950，hb792782， hb792744，ay307951， ay461450，ay188177， hb831819， hb776721，bd313592，bd313600， bd313597， ay588482， ay505129，eu549861，ay289209， ay866412， bd313598，ay453404， eu549860，ay571340， hb769723，ay789508， ay518383， bd313601。
1.2 分析软件与数据库用emboss软件包中的chips（condon heterozygosity in a protein coding sequence）和cusp（create a condon usage table）程序进行密码子偏性分析[1，2]。
chips可对密码子使用频率进行统计，计算特定序列中有效密码子的nc（有效密码子数），该值是一个基因的密码子使用频率与同义密码子平均使用频率偏差的量化值。
nc=2+9/f2+1/f3+5/f4+3/f6f=■， n﹥1，pi=ni/n其中，n表示基因中所使用的密码子总数；k为同义密码子数量；pi是第i个密码子的使用频率（ni/n）。
nc值与基因长度和氨基酸组成有关，因此可以对基因的密码子偏性程度提供一个客观的评价标准。
cusp是对一个或多个编码序列进行阅读后计算出密码子频率。
该程序可计算不同密码子在同一氨基酸编码中所占的比例，并通过外延法计算密码子在编码基因中出现的频率。
本研究的大肠杆菌、酵母、拟南芥和水稻的密码子偏性数据来自密码子数据库[8]。
2 结果与分析2.1 红豆杉属基因编码区长度与g+c含量对从红豆杉属植物中选取的基因结构完整的52个基因进行分析（图1），其编码区长度主要为 1 200～1 600 bp。
这些基因的（g+c）含量从34.0%到56.5%，平均（g+c）含量为43.7%，少数基因的（g+c）含量在50%以上（3/52）或40%以下（7/52）。
如氨基变位酶基因ay724737的（g+c）含量为56.2%，苯丙氨酸解氨酶基因gu568338的（g+c）含量为56.5%，jamyc转录因子fj608574的（g+c）含量为50.8%。
（g+c）含量在40%以下的基因有7个，其中成熟酶k基因eu078561、红豆杉山定子成熟酶k基因af457109、东北红豆杉的成熟酶k基因af228104的（g+c）含量分别为34.0%、34.1%、34.7%。
2.2 红豆杉属基因有效密码子数nc值描述密码子使用偏离随机选择的程度（并不是某个特殊密码子的使用频率与其他密码子的比较），能反映密码子家族中同义密码子非均衡使用的偏好程度。
其数值范围在20（每个氨基酸只使用一个密码子的极端情况）到61（各个密码子都被使用）之间。
已知高表达基因其密码子偏爱程度较大，从而nc值较小；低表达基因则含有较多种类的稀有密码子，nc值较大，所以，当前普遍通过比较nc来确定内源基因表达量的相对高低。
nc值越小，对应的内源基因往往表达量越高。
红豆杉属基因有效密码子数nc值主要为45～58（图2），表明一个基因并没有使用所有的密码子，编码氨基酸的密码子有一定的偏性。
2.3 红豆杉属基因的密码子偏性红豆杉属基因密码子偏性cusp软件分析结果见表1。
由表1可知，除了cys、glu、lys、gln等，编码ala、asp、phe、gly、his、ile、asn、pro、arg、thr、val、tyr的密码子以及终止密码子存在比较明显的偏性。
其中ala偏爱密码子gca的比例达0.39，而gcg的比例仅为0.10；asp偏爱密码子gat的比例达0.64，而gac的比例仅为0.36；phe偏爱密码子ttt的比例达0.61，而ttc的比例仅为0.39；gly偏爱密码子gga的比例达0.42，而ggc的比例仅为0.16；his偏爱密码子cat的比例达0.69，而cac的比例仅为0.31。
此外ile、asn、pro、arg、thr、val、tyr和终止肽链合成的偏爱密码子分别为att、aat、cca/cct、aga、aca/act、gtt、tat和tga。
观察发现紫杉醇合成途径中的偏爱密码子和高频密码子的第三位碱基多为a/t，紫杉醇合成基因偏爱使用a/t结尾的密码子，少量或避免使用g/c结尾的密码子，这与kawabe等[9]利用4种单子叶植物和3种双子叶植物进行密码子研究的结果一致，即双子叶植物偏爱使用a/t结尾的密码子且nc值较高，而单子叶植物偏爱使用g/c结尾的密码子且nc值较低。
同时发现偏爱密码子和高频密码子一般含有较多的a/t，而含有较少的g/c，这一现象与紫杉醇合成基因的（g+c）含量较低的现象是一致的，紫杉醇合成基因的（g+c）含量只有43.7%，相应的在密码子选择上，占优势的密码子含有更多的a/t。
2.4 红豆杉基因密码子与大肠杆菌、酵母、拟南芥和水稻密码子偏性比较结果红豆杉基因密码子偏性与大肠杆菌、酵母、拟南芥和水稻的密码子偏性比较结果见表2。
由表2可知，红豆杉基因密码子偏性与大肠杆菌、酵母、拟南芥和水稻等不同种类模式生物的密码子偏性具有不同程度的差异。
其与大肠杆菌的22个密码子使用偏性差异较大。
如编码ala的密码子gcg在大肠杆菌中的频率是31.7‰，在红豆杉中则只有8.5‰；编码ile的密码子ata在大肠杆菌中的频率为5.4‰，在红豆杉中却高达18.8‰。
基因密码子的偏性之所以在两个物种间存在较大的差异可能主要是由于大肠杆菌属于原核生物而红豆杉则是高级植物，它们的亲缘性差别较大，导致它们对密码子的选择性也不同。
因此若需将红豆杉的紫杉醇基因在大肠杆菌中表达，需要通过部分改造密码子，来适应大肠杆菌的密码子使用法则，来提高表达效率。
红豆杉与同为双子叶植物的拟南芥密码子使用法则基本一致，仅有2个密码子差异较大，而与单子叶植物水稻的密码子使用法则差异较大，有15个密码子有明显差异。
因此在进行外源基因表达时，红豆杉的紫杉醇合成基因可以不经过密码子优化，而在拟南芥等双子叶植物中获得高效表达；若需将紫杉醇合成基因在水稻等单子叶植物中表达，则可以按照该研究提供的密码子偏性进行适当的密码子改造来提高表达效率。
3 小结与讨论密码子是生物体内信息传递的基本环节，在长期的进化过程中，任何一个物种为适应其基因组环境，都要形成特定的符合其基因组的密码子使用法则。
不同生物物种密码子偏性有一定差别，造成外源基因在宿主中表达有强弱现象。
选择密码子偏性相近的宿主，可能有利于外源蛋白质的高效表达。
有研究报道通过改变目的基因的同义密码子，使其适应宿主的密码子偏性来提高目的蛋白质的表达量。
