基因功能的研究方法

分子生物学研究法-基因功能研究技术第六章分子生物学研究法（下）基因功能研究技术随着越来越多的基因组序列相继被测定，人类对生物本质的认识已经发生了重大变化。

但是，海量序列信息也向我们提出了新的挑战。

如何开发利用这些序列信息，如何通过生物化学、分子生物学等方法研究基因的功能，从而进一步了解生物体内各种生理过程，了解生物体生长发育的调节机制，了解疾病的发生、发展规律，给出控制、减缓甚至完全消除人类遗传疾病，是新时期生物学家所面临的主要问题。

转录组测序技术、原位杂交技术、基因芯片技术为研究单个或多个基因在生物体某些特定发育阶段或在不同环境条件下的表达模式提供了强有力的手段。

用基因定点突变（site-directed mutagenesis）技术、基因敲除技术、RNAi技术可以全部或部分抑制基因的表达，通过观察靶基因缺失后生物体的表型变化研究基因功能。

酵母单杂交、双杂交技术，四分体技术等都是研究蛋白质相互作用、蛋白质-DNA相互作用等的重要手段。

随着分子生物学技术的发展，研究者可以在活细胞内和细胞外研究蛋白质之间的相互作用，为认识信号转导通路、蛋白质翻译后修饰加工等提供了丰富的技术支持。

本章将主要介绍研究基因功能的各种分子生物学技术和方法。

6. 1 基因表达研究技术6. 1. 1转录组测序6.1.1 转录组分析和RNA-Seq转录组（transcriptome），广义上指在某一特定生理条件或环境下，一个细胞、组织或者生物体中所有RNA的总和，包括信使RNA（mRNA）、核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）及非编码RNA（non-coding RNA或sRNA）；狭义上特指细胞中转录出来的所有mRNA的总和。

基因组－转录组－蛋白质组（genome－transcriptome －proteome）是中心法则在组学框架下的主要表现形式。

通过特定生理条件下细胞内的mRNA丰度来描述基因表达水平并外推到最终蛋白质产物的丰度是目前基因表达研究的基本思路。

研究基因功能的方法
基因功能的研究思路主要包括:
1.基因的亚细胞定位和时空(发育期或梯度药物处理浓度,不同组织/器官)表达谱;
2.基因在转录水平的调控(可以通过genomewalkingPCR或通过已有的资源库寻找该基因的启动子等转录调控区域,通过单杂交或ChIP等技术,寻找该基因的转录调控蛋白)
3.细胞生化水平的功能研究(也就是蛋白蛋白作用复合体的寻找验证,具体方法有酵母双杂交,GSTpulldown,co-IP,BRET,FRET,BiFc等等,对该基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的定位)
4.gain-of-function&loss-of-function:也就是分别在细胞和个体水平,做该基因的超表达和knockdown(或knockout),从表型分析该基因的功能.
功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次研究,综合分析.
关于基因的表达和定位，可以这样去做：
1.mRNA水平检测基因表达：选择表达目的基因的组织/细胞（发育不同时期、机体不同部位、加处理因素...），提取RNA，反转录，做RT-PCR或realtimeRT-PCR，检测基因的表达情况/变化。

（或者以northernblot、Rnaseprotectionassay方法，检测基因的mRNA 表达情况/变化。

）
2.蛋白质水平检测基因表达：选择相应的组织/细胞，以Westernblot、免疫组化（OR免疫荧光)检测目的蛋白的表达。

3.检测目的蛋白的细胞定位：将目的基因克隆至带荧光标签（如GFP）的表达载体，在适合的模式细胞中表达，在活细胞中观察蛋白的细胞定位。

功能基因组学的基本研究思路与基本方法功能基因组学，听起来像是一个高大上的专业名词对吧？别急，今天就带你走进这个有点“深奥”却又超有趣的领域，让你明白这玩意到底是怎么回事。

你知道吗？其实功能基因组学不是什么高高在上的学术语言，它就是帮助我们弄清楚基因在生物体内到底是干什么的。

咱们人体里有成千上万的基因，它们每一个都像是一个小小的工人，埋头在不同的岗位上忙碌着。

那这些工人到底在干嘛？它们有没有默契合作？这一切，就是功能基因组学要解开的谜团。

哎，你想想，咱们日常生活中，有些人特别擅长做饭，有些人擅长修电脑，大家在自己的“岗位”上发挥特长。

基因也是一样，它们各有分工。

功能基因组学就是要告诉我们，这些“基因小工人”在细胞里面扮演什么角色，如何配合，甚至是他们的工作出错会有什么后果。

想像一下，如果厨房里负责切菜的人突然拿错了刀，结果把土豆切成了蒜瓣，哈哈，后果可想而知！功能基因组学的研究，不就是要找出那些“出错”的基因吗？就是这么一回事。

说到研究方法嘛，那可真是五花八门。

咱们简单聊几种，毕竟一提到方法，很多人都头大。

不过你放心，我不会让你感觉像是读了一本《基因学大辞典》。

最常见的一种方法叫基因表达分析。

这个听起来有点复杂对吧？简单说，它就是看看哪些基因在某个时间点特别活跃。

就好比一个办公室，大家有时忙得团团转，有时又像是开了个假期。

所以，基因表达分析就相当于在记录每个基因“上班”的情况，看看他们究竟啥时候最忙，忙些什么，或者是根本没动静。

另外一种常用方法叫基因敲除，顾名思义，就是把某个基因“敲掉”，看看它不在时会发生什么。

就像在一个车间里，工人突然消失，大家还会正常运作吗？这个方法能帮我们了解某些基因是不是特别重要，或者是说，没有了它，大家还能正常工作。

就像是你家猫咪，突然变得特别粘人，原来是家里有了新鲜的空气净化器，它的基因变化影响了它的行为。

听起来是不是很有意思？不过也不是所有敲除都那么简单，毕竟有些基因真的是“全能工人”，一不小心就会把整个系统搞崩溃。

基因功能研究的具体步骤
嘿，朋友们！今天咱们来聊聊超级神奇的基因功能研究的那些事儿。

咱得先搞清楚要研究的是哪个基因，就像你要了解一个新朋友，得先知道他叫啥。

这一步呢，就需要从茫茫的基因海洋里把咱们的“目标基因”给揪出来。

可以通过各种高大上的技术，比如基因测序啥的。

揪出来之后，就得看看这个基因在细胞或者生物体里到底在啥地方待着。

这就好像要知道你的朋友平时喜欢在哪活动一样。

科学家们会用一些特别厉害的染色方法或者显微镜技术，把基因的位置给找出来。

然后呢，还得研究这个基因和其他基因之间的关系。

它是不是有一群好“基友”，大家一起合作完成重要的任务？还是它特立独行，自己玩自己的？这就得通过一系列复杂又有趣的实验来搞明白。

再说说基因的突变吧。

有时候基因会发生一些小变化，就像人会偶尔犯个小错误一样。

咱们得看看这些小错误会给基因的功能带来啥影响，是变得更强大了，还是直接“罢工”了？
还得把咱们研究出来的这些结果，放到实际的疾病或者生物现象中去验证。

看看这个基因是不是真的和某些病有关系，能不能成为治疗疾病的新靶点。

啊，研究基因功能就像是一场刺激的冒险，充满了惊喜和挑战。

科学家们就像超级侦探，一步步揭开基因的神秘面纱，为人类的健康和未来努力探索着！怎么样，是不是觉得超级酷？。

植物基因功能研究的主要方法随着植物基因组计划的实施和完成，大量的基因组数据库和EST数据库得以建立和完成，因此产生的问题是成千上万新基因的功能有待分子生物学家鉴定。

研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学和反向遗传学策略。

正向遗传学是传统的方法，策略是通过筛选天然或人工产生的突变体进而克隆相关目标基因，即从功能（表型）－突变体－基因，最后得到具有相关功能（如对干旱敏感或耐旱）的基因，常用手段是图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）。

反向遗传学的策略是从已知的基因序列入手鉴定其功能，研究手段包括基因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除、基因激活等。

采用反向遗传学鉴定基因功能是基因组计划由结构基因组学过渡到功能基因组学的必然要求。

目前，植物抗逆性功能基因的研究策略主要集中在利用差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析、cDNA微阵列（或基因芯片）等技术筛选与逆境胁迫相关的表达序列标签（EST）或转录因子，然后利用反向遗传学等技术对转录因子的功能进行研究。

正向遗传学手段主要集中在抗逆性状的遗传分析和QTL定位方面，然而目前尚无抗逆性状QTL基因克隆的报道；通过突变体抗逆筛选的途径主要是在模式植物拟南芥中，特别是克隆了一大批与ABA合成或ABA 敏感性有关的基因，例如ABA不敏感的abi8突变体(Brocard-Gifford et al., 2004)。

近年来许多国家（特别是我国）的水稻突变体数量剧增，为通过抗逆筛选克隆基因奠定了基础。

综合利用这些研究手段可以全面地了解植物对胁迫响应的复杂机制和相互作用以及相应的信号传导途径，从而为更加高效地利用基因工程技术来提高植物的抗逆性奠定基础。

下面就几种常见的研究抗逆基因功能的策略作简要介绍。

1. 超量表达（Over-expression）超量表达是指将目的基因全长序列与高活性的组成型或组织特异型启动子融合，通过转化获得该基因产物大量积累的植株，从而扩大该基因在生理生化过程中的效应，这部分扩大的效应带来的与正常植株在各种表型上的差异有助于帮助理解基因功能。

研究植物基因功能的策略和方法研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学（forward genetics）和反向遗传学（reverse genetics）策略。

正向遗传学即通过生物个体或细胞基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关表型或性状改变，然后通过图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能，例如遗传病基因的克隆。

反向遗传学的原理正好相反，人们首先是改变某个特定的基因或蛋白质，然后再去寻找与之有关的表型变化，例如基因剔除技术或转基因研究。

简单地说，正向遗传学是从表型变化研究基因变化，而反向遗传学则是从基因变化研究表型变化。

研究植物体内基因功能的方法主要有以下几种：（1）基因功能丧失或减少，即筛选目的基因功能部分丧失或全部丧失的突变体，比较其与野生型的表型差异来确定该基因功能；（2）基因功能增加或获得，即筛选目的基因高水平表达的植株，比较其与相应对照植株（野生型植株，功能丧失突变体或模式植物植株）差异，观察其表型性状变化来鉴定基因功能；（3）基因异位表达（Ectopic expression），通过定向调控靶基因的时空表达模式来研究基因功能；（4）微阵列（Microarray）是一种在全基因组水平对基因表达进行高通量检测的技术；（5）酵母双杂交技术（Yeast two-hybrid system）用于分析基因产物即蛋白质之间的互作。

1 基因功能丧失或减少以前，通常通过筛选自然突变体来获得基因功能部分或全部丧失的突变体，但概率较低；现在一般通过各种人工方法来获得合适突变体。

人工产生基因功能丧失的方法有插入突变、反义抑制（antisense suppression）、共抑制（cosuppression）、双链RNA干扰（double-stranded RNA interference, dsRNAi）。

几种常用的基因功能分析方法和工具（转自新浪博客）一、GO分类法最先出现的芯片数据基因功能分析法是GO分类法。

Gene Ontology（GO，即基因本体论）数据库是一个较大的公开的生物分类学网络资源的一部分，它包含38675 个Entrez Gene 注释基因中的17348个，并把它们的功能分为三类：分子功能，生物学过程和细胞组分。

在每一个分类中，都提供一个描述功能信息的分级结构。

这样，GO中每一个分类术语都以一种被称为定向非循环图表（DAGs）的结构组织起来。

研究者可以通过GO分类号和各种GO 数据库相关分析工具将分类与具体基因联系起来，从而对这个基因的功能进行描述。

在芯片的数据分析中，研究者可以找出哪些变化基因属于一个共同的GO功能分支，并用统计学方法检定结果是否具有统计学意义，从而得出变化基因主要参与了哪些生物功能。

EASE（Expressing Analysis Systematic Explorer）是比较早的用于芯片功能分析的网络平台。

由美国国立卫生研究院（NIH）的研究人员开发。

研究者可以用多种不同的格式将芯片中得到的基因导入EASE 进行分析，EASE会找出这一系列的基因都存在于哪些GO分类中。

其最主要特点是提供了一些统计学选项以判断得到的GO分类是否符合统计学标准。

EASE能进行的统计学检验主要包括Fisher 精确概率检验，或是对Fisher精确概率检验进行了修饰的EASE 得分（EASE score）。

由于进行统计学检验的GO分类的数量很多，所以EASE采取了一系列方法对“多重检验”的结果进行校正。

这些方法包括弗朗尼校正法（Bonferroni），本杰明假阳性率法（Benjamini falsediscovery rate）和靴带法（bootstraping）。

同年出现的基于GO分类的芯片基因功能分析平台还有底特律韦恩大学开发的Onto-Express。

2002年，挪威大学和乌普萨拉大学联合推出的Rosetta 系统将GO分类与基因表达数据相联系，引入了“最小决定法则”（minimal decision rules）的概念。

基因功能分析范文
基因敲除是一种通过将基因从生物体中删除来研究其功能的方法。

这可以通过使用人工合成的核酸链，如小干扰RNA或剪接酶导向的Cas9系统来实现。

通过将这些核酸链引入生物体，可以选择性地靶向并删除目标基因。

通过观察删除基因后是否会引起生物体的明显变化，可以确定基因在生物体中的功能。

基因过表达是一种研究基因功能的方法，可以通过在生物体中大量表达目标基因来揭示其功能。

这可以通过将目标基因的DNA序列插入到带有启动子和增强子的表达载体中来实现。

然后，携带表达载体的质粒可以被转染到生物体细胞中，从而导致目标基因的过表达。

通过观察基因过表达后生物体的变化，可以推测出基因的功能。

基因功能分析的最终目标是理解基因在生物体内的作用以及其在自然选择中的起源和演化。

这些研究对于疾病诊断和治疗、农业改良和生物技术的发展都具有重要意义。

通过深入研究基因功能，我们可以更好地理解生物体的生命活动和表型表达，为未来的研究和应用提供更多的机会。