生姜蛋白酶的研究进展

（３）ＤＴＴ对该酶有强烈的激活作用。 （４）讨论了酶与底物作用专一性的机理。 （５）结晶为四聚体，阐明了单体间的连接方式。
２ 生姜蛋白酶的蛋白质性质
３ 生姜蛋白ຫໍສະໝຸດ Baidu的酶学性质
２．１ 等电点和分子量 １９６８年Ｍｉｃｈｉ 等人首先报道了生姜蛋白酶。
１９７３年Ｔｈｏｍｓｏｎ等人［ 把 ６］ 从姜根茎中制取的酶命名 为Ｚｉｎｇｉｂａｉｎ，认为生姜蛋白酶是蛋白水解酶的一种 新 来 源 ；他们用 丙 酮 沉 淀 法 初 步 分 离 了 这 种 酶 ，研 究 了 它 的 酶 学 性质及其在肉类嫩化中的应用，并预计 它会有较好的应用前景。同年，Ｉｃｋｉｋａｗａ和Ｒｏｓｈｉｅ等人
又如：２００５年，Ａｄｕｌｙａｔｈａｍ等在研究生姜蛋白酶 的部分纯化和稳定性的时候采用如下的提取方法［５］： 鲜姜，切片，与４倍（ｗ／ｖ）的冷Ｔｒｉｓ－盐酸缓冲溶液 （０．０５Ｍ，ｐＨ８）混合均匀，均质，四层纱布过滤，滤 液在５℃，１２０００ｇ的离心机中离心２０ｍｉｎ。上清液，即 生姜蛋白酶，在５℃保存。
在丙酮粉的制备过程中，生姜中的疏水性多酚被去 除。浆状物质也在低温下由于丙酮的作用而脱水。与从 鲜姜中提取的粗酶相比，丙酮粉有较高的稳定性。这可 以有如下解释：一方面降低了植物色素的浓缩度，另一 方面降低了水分活度，而酶的三维结构在低水分活度的 系统中更易于保持。这些影响确实可以通过引入玻璃态 化临界温度来证实。因此，丙酮粉可作为生姜蛋白酶的 一种长期的保存方式。但是，丙酮粉仍然需要经过浸提 才能获得纯度较高的可直接使用的酶制剂，因此有必要 进一步研究较纯的生姜蛋白酶的稳定方法，例如采用微 胶囊包被等方法使其固定化。
４ 研究方向
由以上生姜蛋白酶的研究进展可以看出，目前对生 姜蛋白酶的认识尚不统一，因此需要在提取高纯度的生 姜蛋白酶的基础上，对其等电点和分子量继续进行探 讨。生姜蛋白酶的稳定性不高，失活快是限制其在生产 中推广应用的主要原因，因此需要对生姜蛋白酶的稳定 性和固定化继续进行研究。◇
参考文献
［１］Ｎａｖｅｅｎａ，Ｂ．Ｍ．，＆ Ｍｅｎｄｉｒａｔｔａ，Ｓ．Ｋ．Ｔｅｎｄｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｎｔ ｈｅｎ ｍｅａｔ ｕｓｉｎｇ ｇｉｎｇｅｒ ｅｘｔｒａｃｔ．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｐｏｕｌ－ ｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，４２，３４４－３５０．
附表 生姜蛋白酶的基本酶学性质
项目
性质
最适温度
６０℃
最适 ｐＨ 抑制剂 激活剂
以酪蛋白为底物时６．０，以牛血清蛋白为底物时５．０ 汞、铜、铬和锌等二价重金属离子，ＰＣＭＢ，亚硫酸氢钠
巯基化合物，Ｅ Ｄ Ｔ Ａ ，Ｄ Ｔ Ｔ
［２］经研究得出结论：生姜蛋白酶在３０℃保温３０ｍｉｎ， 酶活力不会降低。随着温度进一步升高，酶活性下 降，６０℃、７０℃、８０℃时，该酶的半衰期（即酶活丧 失５０％所需的时间）分别为１７、１２和３ｍｉｎ。Ａｄｕｌｙａｔｈａｍ 认为［５］，粗酶在５℃存放４ｄ时，其活力已损失了８０％， 粗酶的半衰期从５℃的２±０．１６ｄ降至３０℃的１７ｍｉｎ。ＶＣ （０．２％ｗ／ｖ）能使生姜蛋白酶稳定，在５℃保存１４ｄ没 有活力损失。在６０℃时，生姜蛋白酶的半衰期是２．３ｍｉｎ， 添加０．２％（ｗ／ｖ）ＶＣ后变成２４ｍｉｎ。当温度低于５０℃ 时，生姜蛋白酶完全可以被ＶＣ稳定。
［２］张平平，卢绍娟，刘宪华．生姜蛋白酶的部分纯化及酶学 性质研究．天津农学院学报，２００１，８（３）：１９－２３．
［３］唐晓珍，黄学松，乔聚林，等．生姜蛋白酶的工业提取方 法比较．无锡轻工大学学报，２００３，２２（８）：１８－２１．
［４］Ｋｙｕｎｇ Ｈ．Ｃｈｏｉ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄ Ａ．Ｌａｕｒｓｅｎ．Ａｍｉｎｏ－ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｇｌｙｃａｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏ－ ｔｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｐｒｏｌｉｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｒｏｍ ｇｉｎｇｅｒ ｒｈｉｚｏｍｅ Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２０００，２６７：１５１６－ １５２６．
３．１ 基本酶学性质 由于不同的人在提取生姜蛋白酶时，采用的生姜品
种不同，提取纯化方法不同，纯化的程度不同，因此对 酶学性质的研究也没有形成一致的结论。目前关于生姜 蛋白酶的酶学性质的基本研究结论如附表所示。 ３．２ 稳定性
生姜蛋白酶在常温下放置活性很快降低。张平平
孙国梁等：生姜蛋白酶的研究进展
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碎机捣碎，放入布氏漏斗抽滤，再用适量的冷丙酮抽滤 洗涤３次，将丙酮粉放入通风橱中干燥至无丙酮气味， 然后用筛子筛去粗纤维之类，装入塑料袋中真空密封， 放入－２０℃下冰箱中存放备用。
目前国内研究中采用较多的沉淀法有３种。 １．１．１ 有机溶剂沉淀法 张平平在制取丙酮粉后，用 丙酮沉淀生姜蛋白酶，其工艺为［２］：取丙酮粉，用 ｐＨ５．６ 的缓冲液溶解，离心后取上清液，加入 １．２ 倍体积的丙 酮，再离心取沉淀，冷冻干燥。唐晓珍则直接用无水乙 醇从姜汁中沉淀生姜蛋白酶，其工艺为：用无水乙醇（－ ２０℃）与姜汁配成 ６０％的乙醇姜汁溶液混匀后，４℃放 置 ３０ｍｉｎ，离心取沉淀，真空中除去乙醇并冷冻干燥，即 得粗酶粉。 １．１．２ 硫酸铵沉淀法 张平平通过实验确定了如下提 取工艺［２］：取经丙酮沉淀获得的粗酶粉，加入固体硫酸 铵至４０％饱和度，离心后取上清液，加入硫酸铵至６０％ 的饱和度，再离心取沉淀，透析除盐即可获得生姜蛋白 酶。而代景泉确定的工艺则与之略有不同：取丙酮粉用 ２０ 倍（Ｗ ／ Ｖ）０．１Ｍ，ｐＨ８．０ 的磷酸缓冲液提取，上清 液加硫酸铵至 ４０％饱和度，其间控制 ｐＨ＞７．０，离心弃 去沉淀，上清液继续添加硫酸铵至 ８０％饱和度，离心取 沉淀，透析除盐后冷冻干燥即可。 １．１．３ 单宁沉淀法 唐晓珍用单宁沉淀法提取生姜蛋 白酶，其方法为［３］：取丙酮粉，用 ｐＨ６．０ 的缓冲液溶 解并浸提 ３５ｍｉｎ，然后离心，于上清液中加入单宁至
用ＤＥＡＥ－纤维素柱层析对该酶进行了纯化，证明该酶是 由两个组分（ＧＰ－１、ＧＰ－２）构成的，除电泳迁移率外， 两个组分在其他方面基本相同；用Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００测得 两个组分的分子量均为２２５００，ｐＩ为７．０和８．０，纯酶结晶 为六面体。１９７８年Ｏｈｔｓｕｋｉ、ｋｏｚｏ等人用Ｐ－１００生物胶过滤 对该酶进行纯化，得出该酶分子量为２９０００。１９９５年，赵 帜平等［７］以安徽舒城的生姜为原料，采用ＤＥＡＥ－纤维 素ＤＥ－５２和Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５纯化得两个组分，等电点分别 为７．０和８．０，用苯酚－硫酸法鉴定均为糖蛋白，并证明糖 肽键型均为非Ｏ－型。同年，Ｏｈｔｓｕｋｉ再次发表论文［８］， 报道了用ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ和Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５纯化该酶，用 等电聚焦电泳将该酶分为三个组分，ｐＩ值分别为４．５、４． ６和４．８，并用ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳和ＴＳＫＧ２０００ＳＷ 凝胶过滤再次证明该酶分子量为２９０００。２００２年，代景 泉［９］以莱芜生姜为原料，用硫酸铵沉淀法对生姜蛋白酶 进行粗提，证明了生姜蛋白酶具有酸性蛋白酶的性质， 并用ＤＥＡＥ－纤维素ＤＥ－５２对该酶进行纯化，将该酶分为 两个组分，用ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳得出其分子量分 别为４７０００左右和１４０００左右。 ２．２ 分子结构
１９９９年，ｋｙｕｎｇ［４］等利用Ｘ－射线晶体衍射法研究了 生姜蛋白酶２．１Ａ精确度下的晶体结构。发表了以下重要 研究成果：
（１）生姜蛋白酶－ＩＩ是一个含有２２１个氨基酸残基的 糖蛋白，在Ａｓｎ９９和Ａｓｎｌ５６上有两条Ｎ型寡糖链，糖基 含量占８％，并阐明了寡糖残基的组成及连接方式。
（２）生姜蛋白酶－ＩＩ总体结构类似于Ｐａｐａｉｎ等其他 植物巯基蛋白酶，肽链折叠成两个独立的大小差不多的 结构域，两者之间有一道裂隙，活性中心就位于裂隙 中。
生姜蛋白酶活性降低的一些可能原因是巯基被氧 化。巯基与ＳＯ２的相互转化，形成了醌－硫醇复合物，巯 基基团被强金属离子环绕，形成氨基－硫醇复合物，并 且自降解。生姜蛋白酶也可以因为氢键或静电作用而与 单宁结合。
从鲜姜中提取的粗酶很快褐变。这一过程可能包 括：在内源多酚氧化酶的作用下，多酚氧化形成醌类化 合物。醌进而可以和氨基、巯基以及生姜蛋白酶中的其 他亲核残基反应，因此导致了酶活性的降低。Ｄ Ｄ Ｔ 和 ＶＣ都是褐变的抑制剂，然而，前者并不能稳定生姜蛋 白酶。显然，对褐变的抑制不能说明ＶＣ稳定生姜蛋白 酶的机理。
２００７ 年第 ５ 期
中国食物与营养 Food and Nutrition in China
Ｎｏ．５，２００７
生姜蛋白酶的研究进展
孙国梁 １，刘 涛 ２，王玉林 ３，乔园园 １，唐晓珍 １
（１ 山东农业大学食品科学与工程学院，泰安 ２７１０１８；２ 黄岛出入境检验检疫局，青岛 ２６６５５５； ３ 山东省科技厅科学器材供应服务站，济南 ２５００００）
生姜蛋白酶目前广泛采用的提取方法主要有沉淀法 和超滤法两大类，提取后所得酶液都需经过冷冻干燥获 得酶粉。 １．１ 沉淀法
沉淀法是比较传统的分离纯化蛋白质的方法，目前 仍在实验室内广泛使用，是提取生姜蛋白酶的主要方 法。该法所需设备简单、操作方便，在生姜蛋白酶纯化 的初期，可以迅速减少样品体积，起到浓缩的作用，便 于后续的纯化，降低纯化成本；还可以尽快将目的酶与 杂质分开，提高其稳定性；通过该方法，生姜蛋白酶的 收率比较高。通常采用的沉淀剂主要是有机溶剂如丙酮 和乙醇，盐类如硫酸铵，以及单宁等。沉淀法大都以丙 酮粉作为酶的来源，其制作方法为［２］：将黄姜洗净、切 碎，加上５倍（Ｗ／Ｖ）－２０℃下预冷的丙酮，用组织捣
生姜→洗净→切碎→榨汁→离心除去淀粉→抽滤→ 超滤→取浓汁→真空冷冻干燥保存。
唐晓珍通过实验得出结论：操作压力为０．０６Ｍｐａ 时，酶活力和膜通量最好；膜通量随操作温度、姜汁 流速的提高而增加，随姜汁浓度、操作时间的增加而 降低。
以上是提取生姜蛋白酶最常用方法，近几年的一些 新的提取方法，则综合运用了上述各种方法，例如： ２０００年，Ｋｙｕｎｇ在研究生姜蛋白酶的氨基酸序列时，采 用如下的提取方法［４ ］：生姜切成小块，３ ℃下，在 １０００ｍｌ ２０ｍＭ７．０的磷酸缓冲液中研磨，混合物搅拌１ｈ然 后用纱布过滤，取滤液。滤渣再用５００ｍｌ缓冲液浸提， 过滤，合并滤液，加入２％的氯化钠，搅拌２ｈ，在４℃下 １５０００ｇ离心３０ｍｉｎ。上清液用硅藻土过滤以除去悬浮 物，然后加入硫酸铵至２０％饱和度，将溶液搅拌１ｈ，然 后１３０００ｇ离心３０ｍｉｎ，上清液继续添加硫酸铵至６０％饱 和度，用ＮａＯＨ调节ｐＨ至７．２，４℃下搅拌３ｈ，离心取沉 淀，用约１５０ｍｌ ２０ｍＭｐＨ为７．０的磷酸缓冲液（含有５ｍＭ 的连四硫酸钠）溶解。溶液用截流分子量为１２０００的透 析袋对２０ ｍＭ７．０的磷酸缓冲液（其中含有５ ｍＭ的连四 硫酸钠，１ｍＭＥＤＴＡ）透析１６ｈ以上。透析液在４ ℃下 １００００ｇ离心３０ｍｉｎ以除去任何不溶性物质的粗酶液，他 在此基础上进行层析纯化。
资助项目：山东省自然科学基金项目（Ｑ２００４Ｂ０１） 作者简介：孙国梁（１９８２～ ），男，山东龙口人，在读硕士研究生，主要研究方向为功能食品的开发。 通讯作者：唐晓珍。
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中国食物与营养
０．１２％的浓度，离心取沉淀，冷冻干燥即可。 １．２ 超滤法
２００１年，唐晓珍首先报道了采用超滤法提取生姜蛋 白酶［３］，基本工艺如下：
摘 要：本文综述了生姜蛋白酶的沉淀法、超滤法等提取方法，等电点、分子量以及分子结构等蛋白质性质， 以及稳定性等酶学性质的研究现状。
关键词：生姜蛋白酶；提取；性质
生姜蛋白酶是在继木瓜蛋白酶等以后发现的一种新 的植物蛋白酶，它在结构与性质上与木瓜蛋白酶、菠萝 蛋白酶以及无花果蛋白酶等具有很多的相似性，被认为 是木瓜蛋白酶家族的又一新成员。生姜蛋白酶在肉类嫩 化、酒类澄清以及凝乳中均具有广泛的应用前景，开发 潜力较大。生姜蛋白酶用于肉类嫩化，不仅可以显著提 高肉的嫩度，而且可以使其具有良好的风味［１］。生姜蛋 白酶用于酒类澄清，可显著提高啤酒和葡萄酒的澄清 度。我国传统食品“姜撞奶”用姜汁作为凝乳剂，其中 的凝乳因子被证明就是生姜蛋白酶。 １ 生姜蛋白酶的提取方法