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生姜蛋白酶的提取纯化工艺一、实验目的1、掌握生姜蛋白酶提取纯化工艺的基本原理和操作步骤2、掌握生物工程下游加工技术的一些方法和技能二、实验原理生姜蛋白酶是从生姜中提取的有蛋白水解活性的酶，可用于肉类嫩化、酒类澄清等。
其提取分离技术有超滤法、盐析法、有机溶剂法、絮凝法、亲和层析法等。
然而，生姜蛋白酶属大分子物质，超滤过程中易在膜表面聚积而产生浓差极化现象，且生姜蛋白酶在有机溶剂中易变性以及存在有机溶剂残留等问题，盐析法提取的生姜蛋白酶活性较低，与应用要求相差甚远；絮凝法提取专一性不强,制得的生姜蛋白酶纯度不高；亲和层析法提取的酶纯度虽然较高，但是操作复杂，不易工业化生产。
相对来说，双水相萃取法能有效分离提取高纯度生姜蛋白酶。
原因是双水相萃取具有两相界面而张力低，有助于保持生物活性和强化相际间的质量传递，易于连续化操作，具有目标产物收率高, 不存在有机溶剂残留，分离过程经济等特点。
双水相萃取技术是利用一种高分子聚合物和无机盐的混合溶液或两种水溶性不同的聚合物，在一定浓度下将体系分成互不相溶的两相，由于表面性质、电荷间及各种作用力（如憎水键、氢键和离子键）等因素的影响，使得目标蛋白酶和其他蛋白质在两相间的分配系数不同，从而达到分离目的。
通过调整双水相系统中一系列参数就可选择性地萃取目标蛋白酶。
本实验对成相物质组成、浓度和萃取条件进行了初步探索，建立了操作条件温和、能耗低、易放大、可连续操作、无有机溶剂残留、简单可行的分离提取生姜蛋白酶的方法。
三、试剂与仪器试剂：生姜 TCA纯度99.0％，酪蛋白含氮14.5％-15.5％，考马斯亮蓝G-250，各种聚乙二醇（PEG800、PEG1000、PEG2000、PE G4000、PE G6000、PE G8000，）；磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，EDTA纯度99.5％，L-半胱氨酸含量98％～102,生姜蛋白酶, 主要仪器：紫外分光光度计，离心机，美菱榨汁·搅拌机，精密增力电动搅拌器，酸度计，四、操作步骤1、生姜蛋白酶的提取取外形完好、无机械损伤和腐烂、富含纤维的生姜，切成小块，与磷酸缓冲液（0.03mol/L，pH7.5，内含1 mmol/L EDTA和5mmol/L L-半胱氨酸）按料液比1：2打浆，所得浆液低速搅拌20m i n，搅拌过程中缓慢加入20％（m/v）固体硫酸铵，四层纱布过滤后，将姜汁4℃下静置2h，离心（4 800rpm，5min）去除沉淀，上清液用1.5倍的无水乙醇进行沉淀，再次离心去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。
【标题】生姜中有效成分的提取及测定研究进展【作者】朱磊【关键词】生姜姜精油姜辣素姜油树脂提取分析测定【指导老师】贺薇【专业】化学【正文】1、引言姜又名地辛、百辣云，系姜科多年生宿根草本植物的根茎，它既是香料也是医药、食品、化妆、工业的天然原料。
中国是生姜的主要生产国之一，年出口量占世界总出口量的40%，我国中部、东南部至西南部都广为栽培，在河南、山东、湖北、四川等省种植较多，我国生姜产量高，但由于生姜鲜美不耐贮藏等原因，常造成大量损失。
实践证明，如果将生姜加工成姜油，则经济效益可提高3～5倍。
随着食品加工技术的进步，应用现代工艺技术提取生姜制成的姜精油、姜辣素、姜油树脂等深加工产品越来越受到推崇，广泛运用于餐饮、美容、医药等行业，为了满足市场需求，对生姜成分的研究和提取具有重大意义。
姜的现代加工方法主要有水汽蒸馏法、溶剂浸提法、压榨法、超声波法、微波辐射萃取法、液体浸CO2提法和超临界CO2萃取法等。
根据加工方法及所含组分的不同，得到姜精油和姜油树脂两种深加工产品。
姜的化学成分组分分析可分为挥发油组分分析和姜辣素组分分析两部分，目前分析过程中主要采用的方法有薄层层析法(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、气质联用(GC—MS)、顶空固相微萃取等手段，为取得较好的成分分析效果，大都是几种方法配合使用。
因此本文针对生姜中有效成分的提取和测定进行文献综述，希望对研究生姜有效成分新的提取和含量测定方法提供一定的理论依据。
2、生姜有效成分简介生姜营养丰富，含精油、姜辣素和微量矿物元素等，生姜的化学成分复杂，已发现的有100多种，可分为挥发油、姜辣素和二苯基庚烷3大类，另外还含有多种氨基酸、维生素及多种功能性成分。
2.1姜精油姜的挥发油是一种与水不相溶的油状液体，可经水蒸汽蒸馏法获取，其化学成分主要为萜类物质，其中倍半萜类碳水化合物占50%～60%，氧化倍半萜烯类占17%，其他主要是单萜烯类碳水化合物和氧化单萜烯类[1]。
生姜蛋白酶酶活测定方法的研究宋 琦， 许赣荣(江南大学生物工程学院，无锡 214122)摘要： 对生姜蛋白酶的酶活测定方法进行了研究。
鲜姜块与冷缓冲液以 1∶4(w/v )的比例制备匀浆， 过滤后滤液用乙醇沉淀法处理得到粗酶粉；在酪蛋白溶液浓度为 1%，反应温度为 50 ℃，柠檬 酸―磷酸氢二钠缓冲液(pH6.0)浓度为 0.05 mol/L 的条件下反应 4 min ，加 2 mL 三氯乙酸(0.4 m o l/ L )终止反应；用紫外分光光度法测定产物酪氨酸的含量。
在上述条件下，酶活力达到 135 U/m g 蛋白。
该方法 R S D=1.397%，重复性较好，可以作为生姜蛋白酶酶活的检测方法。
关键词： 生姜蛋白酶；紫外分光光度法；酶活测定 中图分类号： O 657.32文献标志码： A文章编号： 1005-9989(2010)01-0277-05A study on the method for evaluating of ginger protease activitySON G Qi, XU Gan-rong(School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122)A b s t rac t: The measurement of enzyme activity of protease from Ginger rhizome were investigated in thispaper. Fresh diced ginger was homogenized with 4 part(w/v) cold buffer. The mixture was filtrated and the crude enzyme was prepared by ethanol precipitation of the filtrate. Enzyme activity was assayed using casein (1% in 0.05 mol/L citric acid ―disodiu m hydrogen phosphate buffer, (pH6.0) at 50 ℃ for 4 min. The enzyme ca - talytic reaction was stopped by addition of 2 mL trichloroacetic acid (TCA)(0.4 mol/L), The product tyrosine was assayed using the UV. the protease activity can reach to 135 U/mg protein. The RSD is 1.397%, so the method has a better repeatability, it can be used in the measurement of ginger protease activity.Key words: ginger protease; UV spectrop hotom etry method; enzyme activity assay 生姜蛋白酶是继木瓜蛋白酶、菠萝蛋 白酶等 之后发现的一种新的植物蛋白酶，它在结构和性 质上与上述蛋白酶有很大的同源性，被认为是木 瓜蛋白酶家族的又一新成员[1]。
生姜蛋白酶提取设备主要步骤
生姜蛋白酶是从生姜中提取的一种新型的水解蛋白质的催化剂，与木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶等属于丝氨酸家族蛋白酶，能特异水解由脯氨酸氨基组成的肽键。
目前生姜蛋白酶提取的方法主要有两种：一种是反胶束萃取法，另一种是以生姜丙酮干粉为原料的制备方法。
两种方法各有特点，现分别介绍如下。
反胶束萃取纯化生姜蛋白酶工艺，以阴离子反胶束从粗酶提取液中进行分离纯化生姜蛋白酶，其主要优点是选择性较高，可在室温下进行处理，反胶束经处理后可再次回用。
生姜蛋白酶分离提取设备主要步骤
①粉碎、提取称取Ikg采摘3天以内的新鲜生姜块茎，切成约
1cm*1cm小块，加入4L温度为4℃、pH值为6.0的0.2mol/L磷酸缓冲液，置于高速组织匀浆机中粉碎，8层纱布过滤。
收集滤液，滤渣再次用6L上述缓冲液分两次进行匀浆粉碎处理，同法过滤，弃滤渣，合井滤液。
②盐析将收集的滤液用离心机以4000r/min的转速离心10min，收集上清液，加入饱和硫酸按溶液进行盐析，使上清液中的硫酸钱终饱和度达到60%时止。
③脱盐将盐析液用离心机以4000r/min转速离心15min，收集不溶物用少量pH7.50的柠檬酸缓冲液溶解，在4℃下对同种缓冲液透析脱盐8h，获得粗生姜蛋白酶提取液。
④萃取除杂取1L粗生姜蛋白酶提取液，加入等体积0.05mol/L的AOT-异辛烷反胶束液，用电动搅拌器以2OOr/min搅拌萃取5min，以除去提取液中的部分杂蛋白。
4000r/min离心10min，收集萃余液，再次用等体积0.05mol/L的AOT-异辛烷反胶束液同法萃取及分离。
项目名称：生姜蛋白酶的提纯与固定化及肉类嫩化技术申报奖种：山东省科学技术进步奖项目简介：本项目是在多个“生姜蛋白酶”课题资助的基础上,由山东省科技攻关项目、山东省自然科学基金资助的研究成果,利用我省特色生姜资源进行生姜蛋白酶的提纯、固定化、应用研究,拥有自主知识产权,达到国内领先水平;包括以下主要内容：1生姜蛋白酶的提取纯化技术：确定了生姜蛋白酶的最佳提取、纯化配套方案为无水乙醇沉淀法提取后采用Sephadex G-50 Medium尺寸排阻层析SEC纯化和Cellulose DE-52与Sepharose DE-52两种离子交换层析IEC联合纯化法;以姜汁酶活力为基准,SEC纯化倍数达到倍,是粗酶的倍;并确定了生姜蛋白酶由两个等电点不同的组分组成,且都是酸性蛋白质;2双水相萃取法：确定了生姜蛋白酶的三步双水相萃取方法中聚乙二醇最佳分子量和浓度、硫酸铵和NaCl电解质的最佳浓度以及双水相的配比和最佳pH,确定了第二、三步硫酸铵盐溶液的添加量和浓度;第一步双水相萃取得到的生姜蛋白酶酶活力分配系数为,酶活力回收率为%,上相酶纯化倍数为,酶的得率为%；第二步分别为, %, , %；第三步为,%,,%;3确定了乳化-交联法制备活性壳聚糖微球的最佳制备条件,及以其为载体采用吸附-交联法固定生姜蛋白酶的最佳固定化条件,所得固定化酶的酶活力为g,酶活回收率达到了%;同时比较了固定化酶与游离酶的酶学性质差异;4研究了生姜蛋白酶对肉类嫩化的最佳工艺条件是：酶用量为%,pH为,预处理温度为50℃,预处理时间是2h,嫩化效果显著;并通过测定牛肉肌纤维的小片化指数和牛肉肌纤维直径、全肌肉蛋白SDS-PAGE电泳等牛肉超微结构的变化,推断其嫩化机理可能是：生姜蛋白酶将牛肉肌纤维软化、分解,使牛肉肌纤维直径减小,促进牛肉肌纤维的小片化,同时促进了牛肉蛋白质降解成更小的物质,使牛肉成分整体上分解为更细、更小的成分,使其食用时变得细嫩、松软,从而达到嫩化的效果;5收集到全国38种不同品种的生姜,比较了不同品种生姜中蛋白酶含量差异,发现不同品种生姜中蛋白酶含量从黄山老姜到丹东姜,差异很大,从而分析出了国内外专家学者关于生姜蛋白酶的许多分歧点的可能原因是不同品种间的差异,这是造成生姜中蛋白酶含量差异较大的主要原因,远远高于不同提取方法造成的生姜蛋白酶含量差异;授权专利情况：专利“生姜蛋白酶的三步双水相萃取方法”已经授权;应用推广情况：生姜蛋白酶可广泛应用于食品、药品、纺织等领域,投资少,前景广阔,尤其发达国家,如欧美市场有大量需求;该项目已经在山东莱芜东兴源食品有限公司、山东日照赛普食品有限公司等4家单位进行了生产,三年新增利润万元,这主要是因为市场上该类产品很少,满足不了市场需求,价格昂贵,利润丰厚;我单位与日照赛普食品科技有限公司于2010年正式合作,通过国家农业成果转化项目2011GB2C600022进行该成果的推广和大规模、专业化生产；2011年与山东莱芜东兴源食品有限公司合作,成功启动了国家科技支撑计划子课题“生姜功能成分高效分离关键技术研究与功能食品开发”;全部完成人排序及对项目的贡献和工作量全部完成人排序：唐晓珍、张平平、王玉民、位思清、姜媛、乔旭光、马明、赵冬艳、申江涛全部完成人对项目的贡献和工作量：唐晓珍负责项目的申报书撰写,实验内容、技术路线、实验方案的设计；各年度实施计划制定和年度总结、鉴定材料的撰写,对项目各项创新都做出了不同的贡献,对本项目各项创新的具体贡献分别是1有4篇通讯作者的文章；2有1项第一位发明专利和2篇通讯作者的文章；4有2篇第一位、2篇通讯作者的文章；3、5是相关研究生论文的导师;投入的工作量占本人工作总量的80%左右;张平平参与完成了创新1、2、3、5,具体负责生姜蛋白酶的酶学性质的整个研究的实验内容、技术路线、实验方案的设计；各年度实施计划制定和年度总结、鉴定材料的撰写,,在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的70%;王玉民：参与完成了创新点1、2、3、5,具体负责生姜蛋白酶的纯化试验等技术路线和试验方案的设计以及部分实验,在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的70%;位思清：参与完成了创新点1、2、3、5,具体负责生姜蛋白酶的纯化试验等技术路线和试验方案的设计以及部分实验;负责整个项目的设备选型、维修,数据处理以及38种生姜中姜酶含量差异试验的设计与试验;在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的60%;姜媛：参与完成了创新点1、2、3、4、5,具体负责各个创新点的资料收集、查新、数据处理以及部分生姜蛋白酶的固定化技术试验的实施,在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的60%;乔旭光：参与完成了创新点1、2、3、4、5,具体负责各个创新点的实验设计与技术路线,负责整个项目的组织实施和生姜蛋白酶的固定化技术路线和试验方案的设计和工作报告的撰写;在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的60%;马明：参与完成了创新点1、2、3、4、5的各种实验指标测试,重点参与了创新点538种生姜的收集、调研以及提取试验的设计与试验;在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的60%;赵冬艳：参与完成了创新点1、2、3、4、5,具体负责生姜蛋白酶固定化的实验内容、技术路线、实验方案的设计及其各年度实施计划制定和年度总结、鉴定材料的撰写,在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的40%;申江涛：参与完成了创新点1、2、3、4、5,具体负责整个项目技术在其单位推广方案设计,组织生产的实施；推广技术在其单位应用效果的统计和经济效果的核算以及相关资料的撰写;在本项技术研发工作中投入的工作量占本人工作总量的30%;全部完成单位及排序：山东农业大学、日照赛普食品科技有限公司五、推广应用情况、经济效益和社会效益。
