基因工程凝乳酶

凝乳酶的定义凝乳酶是一种在乳制品加工中起关键作用的酶类。

它能够催化牛奶中的乳糖分子分解为葡萄糖和半乳糖，从而促进奶液凝结。

凝乳酶广泛应用于乳制品工业，尤其是在奶酪制作中起到至关重要的作用。

凝乳酶属于一类酶，称为“酶切酶”。

它能够特异性地识别乳糖分子，并在特定的条件下将其切割成葡萄糖和半乳糖。

凝乳酶主要存在于某些微生物和真菌中，如乳酸杆菌、乳酸链球菌和曲霉等。

这些微生物和真菌通过发酵过程产生凝乳酶，然后将其提取和纯化，以用于乳制品加工。

在奶酪制作过程中，凝乳酶发挥着至关重要的作用。

首先，鲜牛奶中的乳糖通过乳糖酶的作用被分解成葡萄糖和半乳糖。

然后，凝乳酶作为“酶切酶”介入，将乳糖分子进一步切割成更小的碎片。

这些碎片在特定的条件下相互结合，形成了奶酪的凝结网络。

这个凝结网络能够捕获水分和脂肪，从而形成奶酪的特殊口感和质地。

除了奶酪制作，凝乳酶还被广泛应用于其他乳制品工业中。

例如，在酸奶的生产中，凝乳酶可以促进乳液凝结，使酸奶具有较浓稠的口感。

在乳酸菌发酵的过程中，凝乳酶还能够降低乳酸的生成速率，从而延长酸奶的保质期。

此外，凝乳酶还可以用于优化乳制品的质地和口感，使其更加适合消费者的口味需求。

凝乳酶的应用不仅仅局限于乳制品工业。

近年来，凝乳酶还被应用于医药领域。

研究表明，凝乳酶具有抗菌和抗病毒的活性。

它可以破坏细菌和病毒的细胞壁或膜结构，从而抑制它们的生长和繁殖。

这使得凝乳酶成为一种潜在的抗生素和抗病毒药物的候选物质。

凝乳酶是一种在乳制品加工中起关键作用的酶类。

它能够催化乳糖分子的分解，促进奶液凝结，从而在奶酪制作等乳制品工业中发挥重要作用。

凝乳酶不仅可以改善乳制品的口感和质地，还具有抗菌和抗病毒的潜力。

随着对凝乳酶研究的不断深入，相信它将在更多领域展现出巨大的应用潜力。

凝乳酶的发展及其在奶酪生产中的应用朱玉英;王存芳【摘要】随着我国乳制品行业的快速发展,奶酪的生产越来越受到人们的关注.凝乳酶是在奶酪生产过程中起凝乳作用的关键性酶,势必将成为我国未来重点开发的酶制剂之一.本文通过简要介绍凝乳酶的种类、结构、一般特性、凝乳机理以及不同凝乳酶在奶酪生产中的应用,综述了凝乳酶的研究进展,对凝乳酶的开发前景进行展望.【期刊名称】《乳业科学与技术》【年(卷),期】2015(038)004【总页数】4页(P25-28)【关键词】凝乳酶;研究进展;奶酪;生产;应用【作者】朱玉英;王存芳【作者单位】齐鲁工业大学轻工学部食品学院,山东省微生物工程重点实验室,山东济南 250353;齐鲁工业大学轻工学部食品学院,山东省微生物工程重点实验室,山东济南 250353;山东农业大学动物科技学院(动物医学院),山东泰安 271018【正文语种】中文【中图分类】S826.94乳品行业在人们的生活中占据着越来越重要的位置。

发酵乳制品，尤其是奶酪，以其独特的口感、易消化、营养丰富、便于保藏等优点成为了乳品行业中的重要产业，在人们的生活中变得越来越备受青睐［1］。

奶酪，别名干酪、乳酪，或芝士、起司、起士，就其工艺而言，可作为发酵的牛乳；就其营养而言，可作为浓缩的牛乳［2］。

奶酪中的钙、磷和生物活性肽可直接影响脱矿化和再矿化，故奶酪可作为一种抗龋齿产品。

在奶酪的生产过程中，凝乳酶作为一种关键性酶，不但在凝乳过程中起凝乳作用，同时又对奶酪的质构和特有风味的形成具有不可估量的作用［3］。

因此，随着奶酪生产的增加，凝乳酶势必将成为我国未来重点开发的酶制剂之一。

凝乳酶存在于哺乳动物的胃液中，能使乳中蛋白质凝聚成奶酪，而哺乳类以外的动物则很少存在凝乳酶。

凝乳酶是一种酸性蛋白酶，最早发现于未断奶的小牛胃中，在食品很多方面都有应用［4-5］，是生产奶酪不可缺少的制剂，其产值占整个酶制剂总产值的15.5%。

随着凝乳酶的研究及其在奶酪生产中的应用，其来源不断扩大。

我国凝乳酶的研究进展凝乳酶（Chymosin）,一种酸性蛋白酶，能够促使乳内蛋白质凝聚形成乳酪。

在生产过程中，凝乳酶是生产干酪的一种不可缺少的酶制剂，主要来源为未断奶的小牛胃粘膜。

凝乳酶的主要作用是使原奶凝结，给乳清排出提供一定的条件。

在凝乳酶作用下形成的乳酪易被各种蛋白质酶消化，因此凝乳酶只是提高酶效率，在实际运用中，并不能算酶。

由于随着生产的发展，传统来源的凝乳酶已经越来越不能满足社会需要，通过科学技术手段寻求其替代品，寻找凝乳活力高，蛋白水解活力低的凝乳酶。

通过研究凝乳酶发酵生产及分离纯化，使凝乳酶回收率达到最优。

1.凝乳酶的简介1.1凝乳酶的结构及其活力凝乳酶是以无活性的酶原分泌到胃里，凝乳酶原含365个氨基酶，在酸性条件下形成有活性、成熟的凝乳酶，与天冬氨酸蛋白酶有高度同源性，能够专一地切割κ酪蛋白的Phe105-Met106之间的肽键，从而使牛奶凝集[1]。

凝乳酶没有绝对的活力单位，是以一定的凝乳酶稀释液，在特定条件下，将一定量牛乳凝固所需时间为标准，牛乳凝固时间不相同，因此很难标准化[2]。

1.2凝乳酶的作用原奶在凝乳酶作用下凝结，主要是因为酪蛋白发生变化。

一般酪蛋白可分为α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白。

κ-酪蛋白的作用可以保护蛋白质胶体不发生凝固，在凝乳酶作用下，κ-酪蛋白会水解成副κ-酪蛋白，同时释放相对分子量大约为6000-8000的可溶性糖肽。

而副κ-酪蛋白则可以和Ca2+结合凝固，α-酪蛋白和β-酪蛋白对Ca2+本身不稳定，同时有失去了κ-酪蛋白的保护作用，因此一起凝固形成奶酪。

在干酪生产中，凝乳酶是起着凝乳作用的关键性酶，其传统来源是从小牛皱胃中提取，即皱胃酶[3]。

随着干酪生产的需要，不得不促使人们寻找其他凝乳酶来替代其传统来源。

目前已从动物、植物、微生物和基因工程等方面着手，来寻找传统凝乳酶的替代品。

但是由于高蛋白水解作用是细菌来源的凝乳酶成为商品凝乳酶的主要障碍，因此凝乳酶活力高，蛋白水解活力低的细菌凝乳酶也将成为传统凝乳酶的替代品，在工业化生产中将脱颖而出。

1、下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资料，请分析回答下列问题。

资料1：巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源，此时AOX1基因受到诱导而表达[5′AOX1和3′AOX1（TT）分别是基因AOX1的启动子和终止子]。

资料2：巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以科学家改造出了图1所示的pPIC9K 质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。

资料3：限制酶酶切位点）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在HBsAg基因两侧的A B位置接上______、______限制酶识别序列，这样设计的优点是避免质粒和目的基因自身环化。

（2）酶切获取HBsAg基因后，需用__________将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取。

（3）步骤3中应选用限制酶______来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。

（4）为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入卡那霉素以便筛选，转化后的细胞中是否含有HBsAg基因，可以用__________方法进行检测。

（5）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入______以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。

（6）与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行并分泌到细胞外，便于提取。

2、凝乳酶是奶酪生产中的关键性酶。

直接利用动、植物生产凝乳酶受多种因素限制，培育高酶活力凝乳酶微生物菌种是目前最有前途的发展方向。

从牛胃液中分离到的凝乳酶以催化能力强而被广泛应用，研究人员运用基因工程技术，将编码该酶的基因转移到了微生物细胞中。

（1）从牛胃细胞中提取，再逆转录形成cDNA，以此cDNA 为模板PCR 扩增目的基因，有时需要在引物的5’端设计（填“限制酶”“DNA 连接酶”或“R NA 聚合酶”）识别序列，以便构建重组DNA 分子。

详细设计小牛凝乳酶基因工程制备的方案和路线
小牛凝乳酶基因工程制备的方案和路线如下：
第一步：收集小牛凝乳酶的基因序列并进行分析；
第二步：将小牛基因序列进行克隆，插入到表达载体中；
第三步：转化大肠杆菌进行表达，收集表达产物进行纯化；
第四步：进行酶活测定，筛选出高活性的产物；
第五步：通过超滤浓缩和深冻干燥等方式进行制备。

具体操作步骤如下：
1. 收集小牛凝乳酶的基因序列并进行分析
从小牛的基因组中提取凝乳酶的基因序列，对其进行测序和序列分析，确定其编码区域和启动子、终止子等功能元件，并着手克隆和表达该基因序列。

2. 将小牛基因序列进行克隆，插入到表达载体中。

根据基因序列设计合适的引物，进行PCR扩增，将小牛凝乳酶基因扩增出来。

将该基因与适用的表达载体进行限制酶切割，并进行连接、转化。

3. 转化大肠杆菌进行表达，收集表达产物进行纯化；
将重组的表达菌接种到含有适宜抗生素的含有诱导剂的LB培养基中培养，进行蛋白表达，根据标准方法进行收纳和纯化处理。

4. 进行酶活测定，筛选出高活性的产物。

将小牛凝乳酶的相关酶活测定方法进行优化和实验验证，筛选出活性最高的产物。

5. 通过超滤浓缩和深冻干燥等方式进行制备。

经过深入浓缩、洗涤、干燥等工艺处理，将制备好的小牛凝乳酶保证其高纯度、高效性、高稳定性及良好的贮存寿命，同时也能够在饮料、乳制品等各种食品加工行业得到广泛应用。

第3章基因工程：第3节基因工程的应用一、理清主干知识一、基因工程在农牧业方面的应用二、基因工程在医药卫生领域的应用三、基因工程在食品工业方面的应用利用基因工程菌还能生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。

1．凝乳酶(1)目的基因：编码牛凝乳酶的基因。

(2)受体细胞：大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌。

(3)应用：生产奶酪。

2．加工转化糖浆需要的淀粉酶，加工烘烤食品用到的脂酶等也都可以通过基因工程技术生产。

二、诊断自学效果1．判断下列叙述的正误(1)转基因抗虫植物培育成功后可防治各种害虫(×)(2)将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株(√)(3)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中(×)(4)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用(×)2．下列不属于利用基因工程技术制取的药物是()A．从大肠杆菌体内获得白细胞介素B．从酵母菌体内获得干扰素C．从大肠杆菌体内获得胰岛素D．从青霉菌体内获得青霉素解析：选D利用基因工程技术可制取药物，如将外源白细胞介素基因导入大肠杆菌中并表达制取白细胞介素，使外源干扰素基因在酵母菌体内表达获得干扰素，使外源胰岛素基因在大肠杆菌体内表达获得胰岛素。

青霉素是由青霉菌自身基因表达产生的，因此在青霉菌体内提取的青霉素不属于基因工程药品。

3．我国已能自行生产乙肝疫苗等基因工程药物，乙肝疫苗的生产方法是()A．在受体细胞内大量增殖乙肝病毒B．在液体培养基中大量增殖乙肝病毒C．将乙肝病毒的全部基因导入受体细胞并表达D．将乙肝病毒的表面抗原基因导入受体细胞并表达解析：选D疫苗具有抗原性，乙肝病毒的抗原性由蛋白质外壳决定，所以生产乙肝疫苗利用的是乙肝病毒的蛋白质外壳。

生产乙肝疫苗的方法是获取乙肝病毒表面抗原基因，将其导入受体细胞，使受体细胞表达乙肝病毒的蛋白质外壳。

凝乳酶的基因工程引言凝乳酶是一种酶类，具有将乳中的蛋白质聚合成凝胶的能力，广泛应用于食品和乳制品加工工业中。

传统上，凝乳酶是通过提取动物胃内的瘤胃液获得的。

然而，这种方法不仅效率低，还面临着供给不足和动物福利问题。

因此，通过基因工程从微生物中产生凝乳酶已成为一种可行的替代方法。

本文将探讨凝乳酶基因工程的背景、主要方法和应用前景。

背景凝乳酶属于一类特殊的蛋白酶，主要作用是将乳中的蛋白质聚合成凝胶，形成乳酪、酸奶等乳制品的基础结构。

传统上，凝乳酶主要来源于动物胃内的瘤胃液，如牛胃中的胃蛋白酶。

然而，传统方法提取凝乳酶存在一些问题。

首先，提取过程繁琐且耗时，效率较低。

其次，由于供给不足，凝乳酶的价格居高不下。

此外，在动物福利意识日益增强的今天，从动物身上提取凝乳酶也面临着道德和法律的限制。

为了解决这些问题，人们开始研究通过基因工程的方式来产生凝乳酶。

基因工程的主要方法基因工程的目标是将目标基因导入到高效表达的宿主微生物中，并通过优化生产条件来大量产生目标蛋白。

凝乳酶基因工程的主要方法包括以下几个步骤：1. 基因的选择首先，需要选择凝乳酶基因的适当来源。

常见的选择包括从动物胃中提取的凝乳酶基因、已知的微生物产凝乳酶的基因以及通过基因改造获得的合成基因。

2. 基因的克隆通过现代分子生物学技术，将目标基因克隆到适当的表达载体中。

常见的表达载体包括质粒和病毒。

3. 转化宿主细胞将经过克隆的表达载体转化到适当的宿主细胞中。

常用的宿主细胞包括大肠杆菌和酵母等。

4. 诱导表达通过添加诱导剂或调节培养条件来促使宿主细胞表达凝乳酶基因。

常见的诱导剂包括异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）等。

5. 分离纯化将宿主细胞中表达的凝乳酶进行分离纯化，得到高纯度的凝乳酶产物。

常用的分离纯化方法包括离子交换、凝胶过滤和亲和层析等。

应用前景通过基因工程产生凝乳酶具有许多优点，使其具备了广泛的应用前景。

首先，基因工程可以显著提高凝乳酶的产量和纯度。