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在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。
直接法简便可靠，但灵敏度较低。
(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。
使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下： 1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。
条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。
6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。
二、注意事项 1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照：(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物; (2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物; (3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
三、免疫荧光双标的经验之谈 1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。
免疫荧光双标操作方法及注意事项以下是免疫荧光双标操作方法及注意事项的详细介绍：方法：1.样品制备：a.细胞：将培养皿中的细胞用磷酸盐缓冲液洗涤，并以适当浓度悬浮于PBS（磷酸盐缓冲液）中。
b.组织：从动物体内取出组织样本，用PBS洗涤并切成适当大小的块。
2.固定：a.细胞：用适当浓度的乙醛在室温下固定细胞。
b.组织：用适当浓度的乙醛固定组织样本，然后在PBS中冲洗。
3.渗透：a.细胞和组织：将样本浸泡在PBS-T（含0.2%的肌凝蛋白酶）中，进行渗透处理，以增强抗体的渗透性。
4.阻断：a.使用几何草酸或明胶作为非特异性蛋白质的抗原来阻止非特异抗体的结合。
5.主抗体孵育：a.加入适当稀释倍数的一抗（特异抗体），孵育样本，可以在室温或4°C条件下进行。
6.洗涤：a. 用PBS-T或TBST（含0.1%的Tween 20）进行多次洗涤，以去除未结合的一抗。
7.次抗体孵育：a.加入适当稀释倍数的二抗（荧光标记的抗体），与一抗结合后，通过固定区域与目标蛋白进行特异结合。
8.洗涤：a.用PBS-T或TBST进行多次洗涤，以去除未结合的二抗。
9.核染色/细胞膜染色：a.加入DNA染色剂（如DAPI）或细胞膜标记（如细胞膜标记染料），用于定位目标蛋白。
10.显微镜观察：a.将样本放置在玻片上，用荧光显微镜观察并拍照或记录图像。
注意事项：1.温度控制：孵育和洗涤过程中，适当控制温度可以提高抗体结合的特异性和效率。
2.抗体稀释倍数：需要根据实验要求和试剂手册推荐的稀释倍数来使用抗体。
3.阻断剂的选择：根据实验要求选择适当的非特异性蛋白质抗原来阻断非特异抗体的结合。
4.试剂保存：将抗体和荧光标记物保存在适当的低温条件下，避免暴露在光和高温下。
5.孵育时间：一抗和二抗的孵育时间需要根据试剂手册推荐的时间来进行。
6.具体细胞/组织类型的处理：不同的细胞或组织在样品制备和处理过程可能需要略微不同的方法，可以参考试剂手册或已发表的方法。
免疫荧光双标检测实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项免疫荧光双标技术（Immunofluorescence Double Staining Technique）是一种常用于生物医学研究中的实验技术，通过检测特定抗原和抗体的结合情况，可以对细胞或组织中的蛋白质进行定位和表达研究。
在进行免疫荧光双标实验时，为了确保实验结果的准确性和可靠性，有几个操作要点和注意事项需要特别关注和遵守。
一、试剂准备在开始实验之前，需要准备好以下试剂：1. 抗体：根据实验需要选择适当的一抗和二抗。
一抗用于识别待检测的抗原，二抗则与一抗结合形成免疫复合物，发出荧光信号。
2. 样品：包括细胞、组织等待检测的样品。
3. 荧光染色试剂：根据实验需要选择适当的荧光染色试剂。
常用的有荧光染料如荧光素、多聚荧光素等。
4. 细胞或组织培养基：提供细胞或组织的生长和营养。
二、标本处理1. 样品固定：使用适当的固定液对细胞或组织样品进行固定，一般常用的固定液有乙醛或甲醛。
2. 膜通透：使用适当的溶液对固定后的样品进行膜通透处理，常用的膜通透液有Triton X-100等。
三、抗体反应1. 一抗孵育：将适当稀释的一抗添加到样品中，充分反应一段时间，使一抗与待检测的抗原结合。
2. 洗涤：使用洗涤缓冲液对样品进行洗涤，去除未结合的一抗。
3. 二抗孵育：将适当稀释的二抗添加到样品中，与已结合的一抗形成免疫复合物。
4. 再次洗涤：使用洗涤缓冲液对样品进行洗涤，去除未结合的二抗。
四、荧光染色和观察1. 加入荧光染色试剂：将所选的荧光染色试剂加入样品中，使其与免疫复合物结合。
2. 温度和时间控制：根据荧光染色试剂的要求，控制反应温度和时间，确保荧光信号的强度和稳定性。
3. 洗涤：使用洗涤缓冲液对样品进行洗涤，去除未结合的荧光染色试剂。
4. 观察和分析：使用荧光显微镜观察样品，记录和分析荧光信号的分布和强度。
注意事项：1. 试剂保存：保持试剂的储存条件和有效期，使用前检查试剂的颜色和透明度，避免使用已失效的试剂。
免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS 1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。
将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1 (TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。
（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
8、 DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。
去除PBS 后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
免疫荧光双标原理免疫荧光双标原理是一种生物分子标记技术，主要用于分析和检测细胞和组织中的蛋白质等分子。
该技术结合了免疫学和生物荧光学的原理，基于细胞或组织中特定分子与特异性抗体结合的反应，将其标记荧光染料，从而实现对细胞或组织中分子的探测和定位。
免疫荧光双标原理的基本步骤包括抗体标记、标本制备、光学检测和数据分析等几个方面，下面将逐一介绍。
1. 抗体标记抗体标记是免疫荧光双标技术中最关键的一个环节。
通常采用的方法是将荧光染料与抗体分子关联，制成荧光标记的免疫调控试剂盒。
这些试剂通常被称为“荧光标记抗体”，标记染料有多种不同的荧光颜色，以适应不同的检测需求。
标记抗体的荧光染料通常是有机染料或金属螯合剂，如罗丹明（Rodamine）、荧光素（Fluorescein）和荧光钴（Fluorescent Co）等。
2. 标本制备标本制备是免疫荧光双标技术中的一个关键步骤，它决定了标本质量的好坏。
通常先将标本切片或离心，然后用甲醛或其他交联剂固定细胞和组织样品，使其保持原来的形态，并同时固定荧光抗体标记。
之后，需要将细胞膜孔洞或核孔进行透射和渗透，以使标记分子能够穿过细胞膜，进入细胞内部或核内。
这样，形成的免疫荧光双标标本就可以被用于后续的检测和分析。
3. 光学检测光学检测是免疫荧光双标技术中的另一关键步骤。
它利用激光束或正常的光源激发标记染料产生荧光，从而实现对标本分子的检测和分析。
光学检测通常基于荧光显微镜、光谱仪或光电显微镜等设备，这些设备可以直接观察和记录样品中的荧光信号，获取图像信息和/或光谱数据。
4. 数据分析数据分析是免疫荧光双标技术中的最后一个步骤。
它涉及对荧光信号数据的处理和解释，以提取有用的生物学信息。
数据分析通常基于计算机软件，可以将荧光信号转化为图像、数字和/或图形表示，以实现对标本中分子数量、定位和相关性的计算和分析。
总之，免疫荧光双标技术是一种高灵敏度、高精度、高通量的生物分子探测和定位技术，已广泛应用于细胞和分子生物学研究、临床诊断和药物研发等领域。
免疫荧光（单标和双标）注意事项及具体方法一、技术简介免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
二、实验流程免疫荧光单标记方法免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。
但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。
具体染色方法如下。
1. 所需材料与试剂：a. 培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60%-70%的细胞。
b. 一抗、FITC或TRITC标记的二抗。
c. 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃预冷20 min)。
d. 封闭液。
e. 0.01mol／LPBS缓冲液。
2. 染色方法：a. 取出培养有细胞的盖玻片或glass-bottom培养皿，用0.01MPBS洗2-3遍。
b. 加入0.3%的Tritonx-100，37℃，30 rain。
c. 加入4%多聚甲醛试问固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。
d. 正常阻断血清1:20封闭试问20-30 min，抑制IgG的非特异性结合。
阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。
e. 去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃过夜。
抗体以0.01mo/LPBS稀释（理想的抗体浓度需经试验而定）。
f. 用0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5min，0.01 M PBS洗5 rain。
精心整理免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。
冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤孵育过夜。
（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
8、 DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。
去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
抗荧光淬灭封片剂封片。
10、镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。
（紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm）石蜡切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C 孵育过夜。
（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
8、 DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。
去除PBS后在圈内滴加DAPI 染液，避光室温孵育10min。
抗荧光淬灭封片剂封片。
10、镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。
（紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm）1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
免疫荧光双标染色法意义在生物医学研究领域，免疫荧光双标染色法是一项重要的实验技术。
该方法通过同时检测两种不同的标记物，帮助科研人员更深入地了解细胞或组织中的复杂生物过程。
本文将详细介绍免疫荧光双标染色法的意义及其在科研中的应用。
一、免疫荧光双标染色法简介免疫荧光双标染色法是一种基于荧光标记的免疫组化技术。
它通过特异性抗原与抗体结合，利用荧光染料标记的抗体来显示细胞或组织中的特定分子。
与传统的免疫组化染色方法相比，免疫荧光双标染色法具有更高的灵敏度和更广的适用范围。
二、免疫荧光双标染色法的意义1.同时检测两种不同的标记物免疫荧光双标染色法最大的优势在于可以同时检测两种不同的标记物。
这在研究细胞或组织中的复杂生物过程时具有重要意义。
例如，在研究肿瘤细胞与免疫细胞相互作用的过程中，可以同时检测肿瘤标志物和免疫细胞标志物，从而更深入地了解两者之间的关系。
2.精确定位细胞内分子免疫荧光双标染色法具有较高的空间分辨率，可以精确定位细胞内分子。
这有助于揭示细胞内分子之间的相互作用和信号传递路径，为疾病发病机制的研究提供有力支持。
3.提高实验效率免疫荧光双标染色法可以在同一实验中同时完成两种标记物的检测，大大提高了实验效率。
此外，该方法操作简便，实验周期较短，有利于科研人员快速获得实验结果。
4.适用于多种样本类型免疫荧光双标染色法适用于多种样本类型，如细胞爬片、组织切片、细胞悬液等。
这为科研人员提供了广泛的实验选择，有助于研究不同类型的生物样本。
5.可视化细胞动态过程通过免疫荧光双标染色法，可以实时观察细胞内分子的动态变化，如细胞迁移、细胞凋亡等。
这有助于揭示细胞在生理和病理过程中的重要作用。
三、免疫荧光双标染色法在科研中的应用免疫荧光双标染色法在生物医学研究中具有广泛的应用，如：1.肿瘤研究：通过检测肿瘤标志物和免疫细胞标志物，研究肿瘤微环境中的相互作用。
2.神经科学研究：揭示神经元之间的联系和信号传递机制。
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。
直接法简便可靠，但灵敏度较低。
(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。
使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。
条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。
6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。
二、注意事项1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照：(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物; (2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物; (3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
三、免疫荧光双标的经验之谈1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。
免疫荧光双标操作方法及注意事项一、试剂准备及实验准备1.标记抗体：根据实验需要，准备需要标记的一抗和二抗。
常用的标记物有荧光染料如FITC、TRITC等。
2.细胞或组织标本的固定：将要检测的细胞或组织标本用4%的多聚甲醛（PFA）或其他固定剂进行固定，并进行透明化处理如脱水和透明剂浸泡。
3. 阻断剂和洗涤缓冲液：准备含有蛋白质如BSA、牛血清白蛋白（BSA）和非离子表面活性剂如Tween-20的阻断剂和洗涤缓冲液。
4.标本处理：将固定的标本在洗涤缓冲液中进行多次洗涤，去除多余的固定剂。
5.孵育液：准备含有特定抗体和荧光标记抗体的孵育液，同时加入阻断剂以防止非特异性结合。
6.孵育：将洗涤后的标本用孵育液进行孵育，一般在室温下孵育1-2小时或在4℃下过夜。
二、显微镜观察及图像获取1.滴加反褪色剂：孵育完毕后，用洗涤缓冲液多次洗涤标本，之后加入反褪色剂如DAPI，并在黑暗中孵育15-30分钟。
2.洗涤和封片：用洗涤缓冲液洗涤标本多次，之后将标本转移到玻片上，加入封片剂后盖上盖片。
3.显微镜观察：将玻片放到显微镜上，使用荧光显微镜进行观察。
根据实验需要调整荧光滤镜和荧光强度。
4.图像获取：使用相机或图像分析软件获取荧光图像。
根据需要可以拍摄彩色图像，并使用图像处理软件进行图像调整与分析。
注意事项：1.实验卫生：在实验过程中需要保持实验台面和工作区干净，避免污染。
2.阻断非特异性结合：在孵育液和洗涤缓冲液中加入阻断剂，以防止非特异性结合，提高荧光信号的特异性。
3.控制实验参数：在进行实验时，需要控制实验参数的一致性，例如处理时间、温度、孵育液的浓度等。
4.标本固定：固定标本的时间和浓度需要根据标本类型和目的进行优化，过度固定可能会导致蛋白质的损失，而过轻固定则会导致识别困难。
5.孵育液的选择：根据实验需要选择好的一抗和二抗，合理选择荧光染料和孵育液，以获得明亮而清晰的荧光信号。
6.显微镜观察：根据实验目的和样本特点，选择适当的荧光滤镜和荧光强度，避免背景信号过强或过弱。
免疫荧光实验方法（连续双标法）石蜡切片1)烘片▷在60℃烘箱放置2-4小时，使蜡流失。
2)脱蜡、脱水▷二甲苯溶液中脱蜡，2次，每次5min▷100%乙醇，2次，每次3min▷95%乙醇，1次，每次3min▷90%乙醇，1次，每次3min▷85%乙醇，1次，每次3min▷H2O，1次，每次3min3)固定▷样本切片在冰的甲醇中放置10min (甲醇溶液在-80℃预冷)▷用冰的PBS溶液洗2次，每次3min (PBS溶液在-20℃短暂预冷)4)透化▷用含0.25%Triton X-100的PBS孵育石蜡切片10min (200mlPBS+500ul Triton X-100)▷用PBS溶液洗3次，每次5min5)第一荧光标记▷用PBST配置1%的BSA封闭液，将切片在封闭液中孵育1h▷4℃冰箱，一抗过夜（1%BSA稀释，名称、货号、使用浓度Anti-G3BP2 antibody ab86135 8ug/ml）▷用枪吸走一抗液体，PBS溶液洗3次，每次5min▷二抗室温1h (避光，1%BSA稀释，名称、货号、使用浓度Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (FITC) ab97063 1:400)▷用枪吸走二抗液体，PBS溶液洗3次，每次5min（避光条件下进行）6)第二荧光标记▷4℃冰箱，一抗过夜（避光，1%BSA稀释，名称、货号、使用浓度Anti-Fibronectin antibody ab2413浓度1:200？OR Anti-alpha smooth muscle Actin antibody ab5694浓度1:100？）▷用枪吸走一抗液体，PBS溶液洗3次，每次5min▷二抗室温1h (避光，1%BSA稀释，名称、货号、使用浓度Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor® 555)ab150074浓度1:500？)▷用枪吸走二抗液体，PBS溶液洗3次，每次5min（避光条件下进行）7)DAPI对比染色▷2µg/ml的DAPI，15min▷用PBS冲洗3次8)封片▷用移液枪吸中性树脂一小滴，盖上盖玻片，用指甲油涂抹边缘，待风干后显微镜照相。
培养细胞的免疫荧光标记方法
培养细胞用PBS分三次取代培养皿中的培液，取出盖玻片置于PBS中，在预冷的4%PFA 中4︒C固定30min，PBS洗去固定液。
1、培养细胞的免疫荧光反应：（免疫荧光反应在密闭避光的湿盒中进行，以保持抗体作用浓度、及稳定性）
经固定的培养细胞盖玻片
↓
0.05%Triton 室温5min
↓
PBS 5min ⨯ 2
↓
含0.5%NS、1%BSA的PBS中室温封闭30min~1hr
↓
一抗（稀释过）室温1~1.5hr或4︒C 过夜
↓
PBS 10min ⨯ 3
↓
二抗-荧光基团（稀释过）室温30min~1hr
↓
PBS 10min ⨯ 3
↓
DAPI（稀释过）室温5-10 min
↓
PBS 5min ⨯ 2
↓
荧光封固剂封片
↓
4︒C或-20︒C避光保存
2、培养细胞的免疫荧光双标记方法：
免疫标记方法与上述方法相同，不同种属来源的两个一抗可同时加入反应液中，同样，两种相应的二抗也可同时加入反应液中。
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。
直接法简便可靠，但灵敏度较低。
(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。
使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下： 1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。
条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。
6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。
二、注意事项 1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照：(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物; (2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物; (3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
三、免疫荧光双标的经验之谈 1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项来源：生物谷 2008-6-27 访问量：9826评论（0）分享一、免疫荧光的标本制作的基本程序同DAB显色的免疫组化，不同点如下：1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其它相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片使用专用封片剂或甘油：0.01MPBS（1：1）。
5、条件许可可以购买防淬灭的试剂加入封片剂中，标本可以保存更久。
6、荧光抗体的孵育以及后续处理需要闭光。
7、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要设定阳性和阴性对照。
二、注意事项1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，会使荧光减弱。
2、每次试验时，需设置以下三种对照：（1）阳性对照：阳性血清+荧光标记物（2）阴性对照：阴性血清+荧光标记物（3）荧光标记物对照：PBS+荧光标记物三、免疫荧光双标的经验之谈1、选取prima ry antibod ies时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，seconda ry antibod ies则是不同荧光信号标记的，我用的是don key anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。
2、我的做法是两种primar y antibod ies同时孵育，然后两种sec ondaryantibod ies同时孵育。
抗体浓度、孵育时间要认真摸索，我感觉prim ary antibod ies 4度孵育过夜比较好，背景比较干净。
3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是rabit t和rat的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。
直接法简便可靠，但灵敏度较低。
(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。
使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。
条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。
6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。
二、注意事项1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照：(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物;(2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物;(3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
三、免疫荧光双标的经验之谈1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。
免疫荧光单标记和双标记的方法免疫荧光单标记和双标记的方法l免疫荧光单标记方法免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。
但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。
具体染色方法如下。
1)所需材料与试剂(1)培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60％一70％的细胞。
(2)一抗、FITC或TRITC标记的二抗。
(3)4％多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液(一20℃预冷20min)。
(4)封闭液。
(5)0．01mol／LPBS缓冲液。
2)染色方法(1)取出培养有细胞的盖玻片或glass—bottom培养皿，用0．01MPBS洗2—3遍。
(2)加入0．3％的TritonX—100，37℃，30rain。
(3)加入4％多聚甲醛室温固定30min或冷丙酮4℃固定10min。
(4)正常阻断血清1：20封闭室温20～30min，抑制IgG的非特异性结合。
阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。
(5)去掉正常血清，直接加入一抗，37C孵育1h或4℃过夜。
抗体以0．01mol／LPBS稀释(理想的抗体浓度需经试验而定)。
(6)0．3％TritonX—100洗5min，0．01mol／IPBS洗5min，0．3％TritonX 5min，0．01MPBS洗5rain。
(7)加入FITC—二抗或TRITC—二抗，37℃，孵育1h。
(8)0．3％TritonX—100洗5rain，0．01mol／LPBS洗5min，0．3％TritonX 5min，0．01mol／LPBS洗5mln，用滤纸吸干。
(9)90％甘油(PBS配制)封片。
(10)激光扫描共焦显微镜下观察，或于4℃避光保存。
2．免疫荧光双标记方法免疫荧光的双标记是指同时标记细胞内两种蛋白质分子，当怀疑某种配体与已知受体结合后可用此方法加以证明。
此方法稍微复杂一些，首先应注意所用的一抗必须是来自不同种属动物的两种特异性抗体(例如：A抗体为多克隆抗体，来自家兔；B抗体为单克隆抗体，来自小鼠)。
免疫荧光（单标和双标）注意事项及具体方法免疫荧光（单标和双标）注意事项及具体方法一、技术简介免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
二、实验流程免疫荧光单标记方法免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。
但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。
具体染色方法如下。
1. 所需材料与试剂：a. 培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60%-70%的细胞。
b. 一抗、FITC或TRITC标记的二抗。
c. 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃预冷20 min)。
d. 封闭液。
e. 0.01mol／LPBS缓冲液。
2. 染色方法：a. 取出培养有细胞的盖玻片或glass-bottom培养皿，用0.01MPBS洗2-3遍。
b. 加入0.3%的Tritonx-100，37℃，30 rain。
c. 加入4%多聚甲醛试问固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。
d. 正常阻断血清1:20封闭试问20-30 min，抑制IgG的非特异性结合。
阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。
e. 去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃过夜。
抗体以0.01mo/LPBS稀释（理想的抗体浓度需经试验而定）。
f. 用0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5min，0.01 M PBS洗5 rain。
免疫荧光步骤（双标）1.冰冻切片制备将脱水后的脊髓标本放于冰冻托盘上，加OCT使组织被完全包埋，置于冰冻切片机中，调节箱体温度为-22℃，冷冻头温度为-23℃。
观察OCT冻成白色固态状时，将其放置于冷冻头，准备切片。
设置切片厚度为8µm，必要时用刷子辅助将切好的OCT薄片贴附于载玻片上。
室温下晾干载玻片后保存于-20℃冰箱。
2.免疫荧光染色（1）室温下晾干切片15min，待完全晾干后放置于湿盒内，PBS冲洗浸泡5min/次，3次（以除去OGT）。
（2）抗原修复液(1X)（双蒸水稀释），95-100℃加热约20分钟(加热时间可以控制在10-30分钟内)。
20-30分钟内冷却至室温。
PBS冲洗5min/次，3次。
（3）用滤纸吸干玻片上残余PBS，用免疫组化笔在标本周围画一适当大小圆圈，避免接触标本，将配置好的封闭液（5%驴血清=920ulPBS+50ul驴血清+30ul 10%trition）加入圆圈内，室温下封闭1h。
（4）用滤纸吸去封闭液，向标本加入相应一抗：（1%BSA）兔源一标：兔抗IL-33（1：50）小鼠源二标：小鼠抗NeuN（1：500，神经元）小鼠抗GFAP（1：300，星形胶质细胞）小鼠抗OX42（1：100，小胶质细胞）小鼠抗OLIG2（1: 25，少突胶质细胞）一抗于4℃静置过夜孵育。
（5）次日，PBS洗去一抗，10min/次，3次，用滤纸吸干PBS，之后操作均需避光，向标本加入相应二抗：Dylight 488标记驴抗兔IgG（1：300），Dylight 594标记驴抗小鼠IgG（1：300），二抗室温静置避光孵育2h。
（6）PBS清洗二抗，10min/次，3次，清洗后晾干后滴加DAPI封片，加盖玻片后于荧光显微镜下拍摄图片并保存。
计划：1.IL-33组：1）IL-33/NeuN X2个配比浓度2）IL-33/GFAP X23）IL-33/Iba-1 X24）只孵二抗X22.Sham组：1）IL-33/NeuN X12）IL-33/GFAP X13）IL-33/Iba-1 X14）只孵二抗需要购买：Triton-100，驴血清，一抗：小鼠抗RBFOX3/ NeuN、小鼠抗GFAP、小鼠抗OX42，二抗：Dylight 488标记驴抗兔IgG，BSA(牛血清白蛋白)注意：1、细胞固定和通透为达到最佳的检测效果，细胞需要经过固定和通透。
之阳早格格创做正在共一构造细胞标本上需要共时检测二种抗本时，需举止单沉荧光染色.单沉免疫荧光标记表记标帜法(double immunofluorescence labeling method)也分为间接法战间接法.(1)间接法单沉免疫荧光标记表记标帜：将标记表记标帜有二种分歧荧光素的抗体(如抗A战抗B)以适合比率混同，滴加正在标本上孵育，而后洗去已分离的荧光抗体，正在荧光隐微镜下分别采用二种相映的激励滤片瞅察，即可对于二种抗本举止定位战定量.间接法简即稳当，然而敏捷度较矮.(2)间接法单沉免疫荧光标记表记标帜：用已标记表记标帜的二种特同性第一抗体孵育构造或者细胞，洗去多余的第一抗体后，再用二种分歧的荧光素分别标记表记标帜的第二抗体孵育构造或者细胞，洗去多余的第二抗体，后正在荧光隐微镜下分别采用二种相映的激励滤片瞅察，进而对于二种抗本举止定位战定量.使用此法应注意二种特同性第一抗体必须根源于分歧种属，且荧光标记表记标帜第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配.免疫荧光单标技能中支配重心战注意事项一、免疫荧光技能中标本创造的基础步调近似于酶免疫组化，分歧面如下： 1、免疫荧光不需要使用单氧火处理，启关战一抗孵育与其相共. 2、免疫荧光的二抗使用分歧荧光标记表记标帜的二抗孵育，孵育时间根据抗体的处事浓度决定. 3、二抗孵育之后充分洗片后即可揭片、启片战瞅察. 4、免疫荧光正在启片常常使用博用启片剂或者苦油：0.01M PBS (1：1).条件许可，提议买买抗淬灭的启片液，使标本不妨保存更暂. 5、荧光抗体的孵育以及后绝处理需要躲光. 6、荧光抗体染色假阳性大概会多，需要分别设定阳性战阳性对于照.二、注意事项 1、荧光染色后普遍正在1h内完毕瞅察，或者于4℃保存4h，时间过少，大概会使荧光提前出落. 2、屡屡考查均需树立以下三种对于照：(1) 阳性对于照：阳性血浑+荧光标记表记标帜物; (2) 阳性对于照：阳性血浑+荧光标记表记标帜物; (3) 荧光标记表记标帜物对于照：PBS+荧光标记表记标帜物.三、免疫荧光单目标体味之道 1、采用一抗时，央供根源于二种分歧的动物，尔用的是根源于家兔战大鼠的抗体，二抗则是分歧荧光旗号标记表记标帜的，尔用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)战donkey anti-rat-Tex-Red(黑). 2、尔的干法是二种一抗共时孵育，而后二种二抗共时孵育.抗体浓度、孵育时间要自尔摸索，尔感觉一抗4℃孵育过夜比较佳，背景比较浑晰. 3、尔的阳性对于照采与的是阳性构造切片，阳性对于照则分别是家兔战大鼠的IgG，荧光标记表记标帜物对于照是PBS+荧光标记表记标帜物. 4、启关血浑是二抗根源动物的平常血浑，尔用的是10%平常donkey血浑. 5、其余事项共免疫荧光单标支配.免疫组化单沉染色要领战步调正在死物医教战临床钻研考查中，常常需要检测二种分歧物量是可正在共一般品中共存或者共一种细胞中共存，果此出现了免疫构造化教单沉染色.此要领有几种典型，包罗免疫酶构造化教战免疫荧光细胞化教法分离;共十足片的再度染色法(先对于第一种抗本染色，阳性部位拍照，再用酸处理使抗本抗体解离，继之，对于第二种抗本染色、拍照);二种酶标抗体3又沉染色(分别用辣根过氧化物酶战碱性磷酸酶标记表记标帜第二抗体.用间接法分别隐现A战B抗本，如二种一抗去自共一种属，常有沉叠染色);分歧种属根源的抗体单沉染色.暂时，最常常使用的是末尾一种要领.分歧种属根源的抗体单沉染色，二种抗体间无接又反应.特同性较下，纵然细胞内抗本量很少也能检测.然而是，当二种抗本存留于共一部位而其中之一浓度较下，占千万于劣势时将妨碍另一种抗本染色，此种情况应分别染色，最先染色含量较少的抗本，再隐现含量歉富的抗本.正在该要领中应用最多的是把SABC法或者SP 法的真验过程沉复二次，其中二种分歧特同性抗体(不妨是小鼠或者大鼠单克隆抗体战兔多克隆抗体的所有二个拉拢)，与一抗对于应的分歧种属死物素化二抗战二种分歧隐色系统.即可将分歧部位或者相共部位的二种抗本隐现出去.该要领用于石蜡切片时应试虑所采用的二个抗体的建复要领该当普遍或者一个抗体的建复对于另一个抗体的染色截止不做用.SP法单沉染色步调1～6步调与SABC法相共，然而无需使用死物素阻断剂：7.切片加进A特同性抗体(如兔抗A抗体)，4=C过夜孵育后，PBS浑洗3次，屡屡5分钟8.滴加死物素化二抗(如抗兔二抗)，室温孵育切片10分钟，既而PBS浑洗3次，屡屡5分钟;9.滴加链霉菌抗死物素蛋黑—碱性磷酸酶，室温孵育10分钟，PBS浑洗3次，屡屡5分钟10.碱性磷酸酶隐色液(BCIP/NBT)隐色(紫蓝色).PBS浑洗3次，屡屡5分钟;11.滴加0.05%盐酸，室温10分钟(可预防已隐色的抗本褪色);12.滴加抗小鼠二抗共种属的非免疫血浑，37~C孵育10分钟;13.滴加B特同性抗体(如小鼠抗B抗体)，4~C过夜孵育.PBS浑洗3次，屡屡5分钟;14.滴加死物素化抗小鼠二抗，室温孵育切片10分钟.PBS浑洗3次，屡屡5分钟：15.滴加链霉菌抗死物素蛋黑—过氧化物酶，室温孵育10分钟，PBS浑洗3次，屡屡5分钟16.过氧化物酶隐色液(AEC)隐色(陈黑色).PBS浑洗3次，屡屡5分钟17.苏木粗复染细胞核;18.火溶性启片剂启片. 正在使用SP法单沉染色之前需要对于待测抗本的本量、二抗的种属典型战隐色系统举止仔细安排.买买免疫组化单染试剂盒时;应采用与安排规划相共的配套试剂.正在采用一抗时应预防定位正在细胞的共一部位(如胞核、胞浆战胞膜)的二种抗本，如果不可预防，最佳采用免疫荧光构造细胞化教单沉染色要领，果为二种分歧颜色的荧光沉叠后浮现另一种颜色的荧光(如黑色荧光与绿色荧光沉叠浮现黄色荧光)，它比SP法的隐色系统更简单辨别战辨别阳性截止. 正在举止单沉染色之前，必须对于所采用的一抗分别举止单独染色预真验，预真验条件必须与单染条件相共，正在瞅察预真验截止战抗体定位粗确后，再举止单染真验.。
免疫荧光双标记在心肌石蜡切片中的应用陈绪军肖明第吕志前卢成宝薛松袁忠祥徐根兴作者单位：200080 上海市第一人民医院心血管外科细胞性心肌塑型术（cellular cardiomyoplasty）用于缺血性心肌病的治疗受到人们越来越多的关注［1］，在证实移植的人干细胞在缺血/损伤的环境中分化为人心肌细胞方面，免疫荧光技术的运用逐渐增多，但多用的是新鲜冰冻切片，在石蜡心肌切片中应用较少，而且多是单一抗原的荧光标记［2］。
有研究表明，酪胺信号放大( tyramide signal amplifications, TSA)技术可以提高反应的灵敏性［3］。
为此，我们以人心肌石蜡切片标本为例，运用TSA－免疫荧光法与常规间接免疫荧光法分别对人心肌连接蛋白(connexin-43，Cx-43)蛋白及肌凝蛋白（myosin）进行标记，旨在为心肌石蜡切片建立一个免疫荧光双标记的方法。
一、材料与方法1. 主要试剂：兔抗人肌凝蛋白（myosin）多克隆IgG抗体购自美国Chemicon 公司，标记异硫氰酸酯荧光素（FITC）的驴抗兔多克隆IgG抗体与标记有辣根过氧化物酶（HRP）的驴抗小鼠多克隆IgG抗体均购自美国Jackson Immunity 公司, 小鼠抗人Cx-43单克隆抗体、碘化丙啶(PI)与牛血清白蛋白（BSA）购自美国Sigma 公司，酪胺 (tyramide)-coumrian 结合物试剂盒购自美国PerkinElmer公司。
2．标本的取材、固定、切片及抗原修复: 人心肌取自一例6岁先天性心脏病小孩右房耳，中性福尔马林固定，4°C过夜固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，5 μm石蜡切片。
石蜡切片常规脱蜡、梯度酒精浸泡后行抗原修复：浸入0.01 mol/L的柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中，95℃，浸泡30 min, 室温冷却10 min。
3．Cx-43的免疫荧光标记：采用TSA-免疫荧光法［4］，按试剂盒说明书进行。
磷酸盐缓冲液（PBS）室温洗涤2次，每次5 min。
置入3% 过氧化氢/甲醇溶液中，室温，孵育10 min。
再室温PBS洗涤3次，每次5 min。
3%的BSA室温孵育30 min。
加入小鼠抗人Cx-43单克隆IgG抗体，4℃孵育过夜。
TnT缓冲液（0.1 mol/L Tri-HCI, pH 7.5, 0.15 mol/L NaCl, 0.05% 吐温-20）室温洗涤3次，每次5 min。
加入标记有HRP的驴抗小鼠IgG抗体，室温孵育1 h。
TnT液室温洗涤3次，每次5 min。
配制酪胺-coumrian 工作液：将酪氨-coumrian 结合物加入放大缓冲液中配成酪胺-coumrian 工作液（1∶50），避光，室温孵育15 min。
再次TnT液洗涤3次。
4． Myosin的免疫荧光标记：接上一步。
采用间接免疫荧光法［5］。
兔抗人肌凝蛋白多克隆IgG抗体（1∶20）， 37°C孵育1 h，PBS洗涤3次。
加入标记FITC的驴抗兔多克隆IgG抗体(1∶100)，避光，室温孵育1 h。
PBS室温洗涤3次，每次5 min。
5．PI染细胞核：加入碘化丙啶（PI/PBS，1 μg/ml），室温避光孵育3 min。
PBS室温洗涤3次后甘油封片。
6．荧光显微镜观察：运用带有3通道的AX-80型Olympus 荧光显微镜镜检：绿通道中观察FITC信号；蓝通道中观察coumrian信号；红通道中观察PI信号。
图像的编辑采用Advanced SPOT 软件。
二、结果在3通道的AX-80型Olympus 荧光显微镜中红、绿、蓝通道中分别可以观察到PI、FITC 及coumrian的信号，再经Advanced SPOT 软件叠加得到图1~4，红色代表PI标记的人心肌细胞核，绿色代表FITC标记的人心肌肌凝蛋白蛋白，蓝色为coumrian标记的人心肌Cx-43蛋白。
图1显示为未加myosin抗体而加Cx-43抗体的人心肌石蜡切片; 图2中均加myosin 抗体与Cx-43抗体; 图3中加myosin抗体而未加入Cx-43抗体；图4均未加入 myosin抗体与Cx-43抗体。
三、讨论1.心肌石蜡切片的免疫荧光双标记：在本研究中，图1与图2相比，人心肌石蜡切片中，不加myosin抗体的心肌纤维不着色，而加了myosin抗体的心肌纤维呈绿色，这表明心肌纤维被成功地标记上抗人myosin抗体，而且特异性高。
Cx-43蛋白位于心肌细胞的周围，在本研究中由图1、图2与图3可以观察到，加Cx-43抗体的人心肌Cx-43蛋白呈图1人心肌石蜡切片未加肌凝蛋白抗体而加Cx-43抗体，PI复染×200 图2人心肌石蜡切片均加肌凝蛋白抗体与Cx-43抗体，PI复染×200 图3人心肌石蜡切片加肌凝蛋白抗体而未加Cx-43抗体，PI复染×200 图4人心肌石蜡切片均未加肌凝蛋白抗体与Cx-43抗体，PI复染×200蓝色，而未加Cx-43抗体的人心肌Cx-43蛋白不着色, 这表明心肌成功被标记上抗人Cx-43抗体。
图2与图4相比，加入2种抗体，人心肌纤维与 Cx-43蛋白均着色，而不加抗体者均不显色；这说明本研究在人心肌石蜡切片中采用的免疫荧光双标记的方法是成功的，而且特异性高。
在本研究中，标记myosin 采用间接免疫荧光技术，这种方法较直接免疫荧光技术灵敏。
在本研究中，两种一抗分别来源于兔与小鼠，由于二抗是多克隆的，都可以与两种一抗结合，故必须是先标记Cx-43后再标记myosin，不能将两种二抗混合在一起加入，否则会出现交叉污染。
2.本研究方法有以下优点：（1）特异性较单荧光标记强。
在细胞性心肌塑型术中单荧光标记有一定的假阳性率，而采用本研究的双荧光法，能同时观察到移植的人的干细胞表达两种心肌抗原，假阳性率大大减低。
（2）目前，报道的人心肌免疫荧光双标记的方法较少，而且多需要特殊的设备如激光共聚焦扫描显微镜等［7］，本研究仅用普通的荧光显微镜就可以，易于掌握、使用方便。
3．心肌石蜡切片免疫荧光双标记的意义：成体心肌细胞再生能力非常弱［6］，移植干细胞到缺血/损伤的心肌内，以便参与心肌的修复与再生是当前国内外研究的热点［7］。
由于不同种属来源的干细胞的分化能力有较大的差异［8］，因此，人的干细胞在运用于临床之前，还需要将人的干细胞植入动物心肌内，以观察植入的人干细胞是否分化为人的心肌细胞［9］。
同新鲜冰冻切片相比，石蜡切片可以保持良好的组织形态，但在石蜡切片中运用免疫荧光检出抗原信号的灵敏性明显减低。
myosin是心肌肌纤维的重要组成部分，Cx-43又称为闰盘、缝隙连接蛋白。
如果观察到移植的人干细胞表达myosin与 Cx-43，那么就可以认定移植的人干细胞向人心肌细胞分化，而且可以在心肌细胞的电兴奋活动中与其他心肌细胞协同收缩［6］。
本研究建立了一种人心肌石蜡切片荧光双标记的方法，我们相信这种方法将在研究人的干细胞移植和心肌的修复与再生方面发挥重要作用。
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