荧光免疫层析技术原理进展 ppt

荧光效率
定义:荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率
计算公式: 荧光效率=
发射荧光的光量子荧 数光 （强度） 吸收光的光量子数发 （光 激强度）
荧光寿命
➢定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程 度时所用的时间。 ➢各种荧光物质的荧光寿命不同。
荧光淬灭
• 定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发 射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。
• 霍乱弧菌—霍乱—烈性肠道传染病 • 甲胎蛋白(AFP）-肝癌的特异性指标。
3 量子点
• 量子点( quantum dots，QDs)，主要 指主族Ⅱ～ Ⅵ( 如 CdSe) ，Ⅲ～ Ⅴ( 如 InP、InAs、GaSe) ，副族化合 物以及 Si 等元素组成的纳米颗粒
• ①QDs 有可精确调 谐的发射波长，通
（Y2O2S,GdO2S）、
氟化物(YF3,GdF3）、 S2
A2
硅酸盐
(YSi2O5,YSi3O7）...
• 吸收子Yb3+ Er3+ Sm3+ S1
A1
• 发射子Er3+ Ho3+ Tm3+
UCP独特的优势
• ①高敏感性，有报道 UCP 的灵敏度可达胶体金的 100 倍。
• ②高稳定性，UCP 的发光信号不受检测环境或样 品腐蚀或标志物自身衰变等的影响，可长期存放 和可重复。
• 两种不同镧系元素离子( 分别作为光 吸收子和发射子) 掺杂入亚微米尺寸 的陶瓷颗粒( 作为主基质) 中，会构成 一类能上转发光产生荧光的特殊材 料。—— UCP( up-converting phosphor，UCP) 颗粒。
• UCP 颗粒主要含有如 A3 下三种成分:
• 主基质：氧硫化物
结合垫
免疫层析法检测的实物 图
双抗原夹心法
双抗原夹心反应模式阳性检测（左）与阴性检测（右）
• 利用荧光免疫层析试纸条可以实现对待测 物的定性或者定量检测.
其他 碳纳米管
胶体金 标记物
量子点 镧系元素
纳米磁性材料
有机纳米粒子
胶体金
• 金颗粒之间存在的静电斥力使其在水中保持相 对稳定的状态，形成稳定的水溶性胶体，即称 为胶体金
• 典型的是以磁性材料四氧 化三铁.
• 表面引入活性基团，通过 耦联反应与酶、抗体等生 物分子结合形成生物标志 物.
• 超顺磁性.
6碳纳米管
• 碳纳米管( carbon nanotubes，CNTs) 的结构可看成 是石墨的六角形网格结构发生一定弯曲而形成的空间 拓扑结构。
• CNTs 作为生 物分子标志物 的原理与胶体 金类似，其明 显的黑色在定 性或半定量检 测中肉眼即可 见。
④生物相容性好 物理结合
化学偶联
量子点在免疫层析中的应用
• 量子点是一种新的荧光标记物，目前在免疫层析 中得应用相对UCP，胶体金较少见报道。
• 张国华，赖卫华等，量子点标记免疫层析试纸条 快速检测莱克多巴胺的研究[J]，2009，以CdSe 为标记物，对莱克多巴胺(一种苯酚胺类β-肾上腺 素激动剂)快速定量检测。
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过调整粒子尺寸可
得到不同发射光谱，
即可使用大小不同 的同种 QDs 颗粒实 现不同颜色标记。
• ②较大的Stokes 位移和狭 窄对称的荧光谱峰。
• 使得用同一激发光源可同 时激发不同大小的量子点， 产生不同发射光谱，使同 步检测多样本成为可能。
• ③QDs 荧光性质稳定，可 长期保存，经受反复多次 激发。
荧光免疫层析技术的原理与进展
荧光免疫层析技术的基本原理
层析法(chromatography)的原理是利用混 合物中各组分的物理性质之差(如吸附力、 分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、 分配系数等)而建立来的一种分离技术。 层析系统是由固定相(stationary phase)和 流动(Mobile Phase)相组成。
免疫层析法
• 免疫层析技术是建立在层析技术和抗 原一抗体特异性免疫反应基础上的一 项新兴免疫检测技术。
• 免疫层析技术以固定有检测线和控制线的条状纤 维层析材料为固定相，测试液为流动相，通过毛 细作用使待测物在层析条上移动。
• 待测物在T线处发生特异性免疫反应。
• 游离物在C线处发生免疫反应。
待
常用荧光免疫层析法
夹心法
竞争法
•双抗原夹心法 双抗体夹心法
竞争法
待测物中的某种抗原与T（检测线）线处同 种抗原竞争性地与标记抗体相结合的过程。
竞争法
结合垫
含抗原 A
免疫层析法检测的实物 图
Y1:A的单抗与标记物的偶联体 Y2：抗原A Y3:羊抗鼠二抗
夹心法
• 待测物中某种抗体（抗原）与T线处抗原A （抗原A）以及荧光标记的抗原（抗体）特 异性相结合的过程，在T线处形成抗体A+抗 原+抗体B形式的夹心结构。
• 引起荧光淬灭的因素：有如紫外线照射、 高温、某些硝基化合物、重氮化合物等。
• 免疫层析技术以固定有检测线和控制线的条状纤 维层析材料为固定相，测试液为流动相，通过毛 细作用使待测物在层析条上移动。
• 待测物在T线处发生特异性免疫反应。
• 游离物在C线处发生免疫反应。
待
层析方向
免疫反应
测
物
T
C
免疫层析技术基本原理示意图
• 固定相是固体物质或固定于固体物质上的 成分。
• 流动相是可以流动的物质，如水或各种溶 剂。
• 层析过程：当待分离混合物随流动相通过 固定相时，由于混合物各组分的理化性质 的差异，与固定相相互作用弱的组分随流 动相移动时受到的阻滞作用小，向前移的 速度快；与固定相相互作用强的组分向前 移动的速度慢。从而实现混合物中各组分 的分离。
• ③使用简便，安全无毒，可适用于定量分析与多 重分析，在一般的实验室或野外现场都可轻松应 用.
UCP应用举例
• 中科院报道了一种用 于免疫活性检测的 UCP试纸条读数计， 采用半导体激光器作 为光源，CCD作为光 电接收器，步进电机 带动控制试纸条移动 的装置
• 军事医学科学院研 制出一种UPT十通 道免疫层析试纸盘， 同时检测多种抗体 以确证是否感染鼠 疫菌
层析方向
免疫反应
测
物
T
C
免疫层析技术基本原理示意图
荧光（fluorescence）
• 荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃
迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式 释放出能量，称为荧光。
发射光谱和激发光谱
➢ 发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下 记录的样品发射荧光的强度。
➢ 激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波 长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射 强度。
• 目前无论用何种方法制备 CNTs，均难以去 除其中混杂的无定形碳、石墨碳碎片等杂 质，这些杂质与 CNTs 混杂在一起，严重 限制了 CNTs的研究与应用[1].
• [1]王倩倩，颜红侠，李朋博，等． 碳纳米管的纯化、性 能及应用［J］． 化学工业与工程，2010，27( 3) : 259265．
• ③结果判断只需普通光学仪器或直接肉眼 观察。
胶体金作为标记物的应用
试孕纸
应用（定量）
• 08天津大学精密仪器 与光电子工程学院与 天津市进出口检验检 疫局合作开发研发一 种便携式仪器。
• 竞争法原理 • 用于农药残留定量检
测
2 镧系元素
• 镧系元素又称为稀土金属元素，指元素周 期表中原子序数 57～71 的所有元素。
• 胡华军，付 涛等，CdTe / ZnSe 核壳量子点免疫 层析试纸条检测克伦特罗的研究，2010,检测克伦 特罗( Clenbuterol，CLE) —属于 β-兴奋剂类药物, 又称“瘦肉精”
4有机纳米粒子
• 荧光素衍生物等荧光染料类有机纳米粒子是早期 常用于免疫层析技术中的一大类标志物，如异硫
• 胶体金既有明亮的色彩， 又有高电子密度，可以吸 附生物大分子，且不影响 生物分子的活性，故可作 为生物分子的标志物，用 于免疫反应中抗原或抗体 的标记定位，定性甚至定 量研究。层析试纸标记用 金颗粒的直径大多在 20～ 40 nm，呈深红色。
• 胶体金标记蛋白质的过程是蛋白被动吸附到金颗 粒表面的过程。
• 由于蛋白分子牢固地结合在金颗粒表面，形成一 个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触势:
• ①几乎可标记所有的蛋白分子，过程简单， 效率高，用量少，便宜，基本不改变被标 记蛋白的活性。且稳定，无毒，使用方便， 保质期长。
• ②不同直径的纳米金可以用于多重标记。
结合垫
免疫层析法检测的实物 图
双抗体夹心法
待测液含抗原Ag
(k)Ab1-Ag
(k)Ab1-Ag-Ab2
Ab3-(k)Ab1
(k)Ab1
阳性结果T,C均有颜
Ab2
色
T
C
待测液，不含抗原 Ag
(k)Ab1 (k)Ab1
(k)Ab1 Ab2
Ab3-(k)Ab1
阴性结果T无颜色， C有颜色
T
C
双抗体加心法检测原理图 K代表某一标记物
• 氰酸酯荧光素，标记原理基本都是利用荧光分子 中的异硫氰酸根为反应基团，与蛋白分子中的氨 基结合，实现对蛋白的标记，同时以分子中的荧 光素为检测信号，早期应用研究较多。有机纳米 粒子的荧光发射依赖于粒子本身的化学发光集团 不具有无机纳米粒子的波长可调控的尺寸效应。
5纳米磁性颗粒
• 纳米磁性颗粒( magnetic nanoparticle，MNs) 也被称为超顺磁颗粒，它结合了磁性粒子和纳米 材料的优点，具有粒径小、超顺磁性和比表面积 大等特性。