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时间分辨荧光免疫层析技术原理
时间分辨荧光免疫层析技术（TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，利用
镧系元素标记抗原或抗体，通过时间分辨技术测量荧光。
具体来说，当含有待测抗原（抗体）的样品滴在加样区时，待测样品中的抗原（抗体）与结合垫中的荧光纳米微球标记的抗体（抗原）结合并通过毛细作用向前层析。
当达到检测区后，与检测线上固定的抗体（抗原）结合，形成微粒-抗体-抗原-抗体夹心复合物并被固定在检测线上，而多余的荧光微
球标记物继续向前层析，与固定在质控线上的二抗结合。
反应结束后，用紫外光源（340nm）对检测区扫描检测，检测线和质控线
上荧光纳米微球发出高强度的荧光（615nm），且衰变时间也较长。
通过
测量延缓时间，待样品基质中自然发生的短寿命荧光（1-10ns）全部衰变后，再测量稀土元素的特异性荧光，这样就可以排除非特异本底荧光的干扰。
通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值，即可分析出样品中待测物的浓度。
这种技术具有高灵敏度、高特异性和可定量分析等特点。
以上内容仅供参考，如需更多信息，建议查阅时间分辨荧光免疫层析相关文献或咨询该领域专家。
时间分辨免疫荧光微球1. 引言1.1 背景介绍时间分辨免疫荧光微球是一种新型的生物标记技术，可以对免疫学实验数据进行高效、准确的检测分析。
随着生物技术的发展和应用，对于细胞分析和药物筛选等领域的需求日益增加，传统的免疫荧光检测方法已经不能满足科研和临床的需求。
研究人员开始探索新的技术手段来提高实验的灵敏度和准确度。
时间分辨免疫荧光微球具有高灵敏度、高通量和高分辨率的特点，可以同时检测多种生物标记物，实现快速、准确地定量分析。
其原理基于微球上包裹有特定的免疫荧光标记物，当这些微球与待测样品中的靶分子结合时，通过流式细胞仪等仪器可以实时监测免疫反应的强度和时间，从而获得更精确的实验数据。
通过时间分辨免疫荧光微球技术，研究人员可以更加深入地了解细胞内的免疫反应过程，快速筛选药物的活性和副作用，为疾病诊断和治疗提供重要的参考依据。
随着该技术在生命科学领域的不断应用和发展，相信将会有更多的创新和突破出现，为人类健康和生命的发展带来积极的影响。
1.2 研究目的研究目的是通过研究时间分辨免疫荧光微球，深入探究其在生物医学领域中的应用潜力。
通过了解其原理和实验方法，我们的目的是揭示其在疾病诊断、药物递送和细胞标记等方面的优势和局限性，为其未来的应用前景做出预测。
通过这项研究，我们希望能够为生物医学领域的研究和临床实践提供新的技术手段和思路，为推动医疗健康行业的发展做出贡献。
2. 正文2.1 原理介绍时间分辨免疫荧光微球是一种新型的生物分析技术，利用微球作为载体，结合免疫荧光标记技术，实现对不同生物标记物的高灵敏、高特异性检测。
其原理基于时间分辨光谱技术，通过采集微球悬液中的荧光信号，在不同时间点进行检测和分析，从而实现对样品中不同荧光标记物的准确识别和定量测定。
在时间分辨光谱技术中，光谱仪器以一定的时间间隔对样品中的荧光信号进行连续检测，通过对这些时间点上的信号强度和波长进行分析，可以区分出不同的荧光标记物并消除背景信号的干扰。
时间分辨荧光微球说明书一、产品简介本产品是针对免疫层析检测(lateral flow immunoassay)试剂设计，采用时间分辨荧光染料与苯乙烯共聚而成。
具有stokes位移大、聚集时不会发生内淬灭效应、检测信号强、荧光染料包在微球里面，不易受外界环境影响、荧光稳定等特点，是免疫荧光定量层析理想的标记物。
二、微球参数1、成分：稀土元素铕的荧光配合物修饰的改性聚苯乙烯微球2、固含：1%（1ml悬浮液中含有10mg微球）3、平均粒径：300nm4、粒径均一性：CV<5%5、官能团：羧基、硫酸基等6、羧基含量：300±20μmol/g7、荧光性能：激发波长365nm，发射波长：610nm8、荧光寿命：720μs9、密度：1.05g/cm310、折射率：1.59（589nm，25℃）11、外观：白色乳液三：微球保存保存条件：2-8℃避光、密封保存，不能反复冻融。
四、使用方法（一）活化步骤：1、超声分散微球，约2min，然后手工摇匀；2、在2mL的EP管中，加入100μL微球（固含1%），再加超纯水（或MES缓冲液）900μL，待用；3、配制：10mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)乙醇溶液A液10mg/ml 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)乙醇溶液B液注意：NHS、EDC均易吸潮，称量前这两种试剂需复温30min以上。
4、在微球悬液中加入5μl的A液、混匀，再加入5μl的B液、再次混匀，室温反应15～30min；5、12000r/min，离心15min，去上清，加入1ml超纯水（或抗体偶连缓冲液），然后超声分散均匀。
注意：一定要彻底分散，否则交联抗体后的微球极易团聚，跑条带很差。
（二）抗体交联特别注意交联所用的抗体是否产生沉淀，如果产生沉淀则需对抗体进行离心或者过滤处理，否则将导致交联后的微球发生团聚。
过滤处理或者离心处理的抗体需要重新测定抗体浓度。
微球表面交联抗体的量为：抗体/微球=10～50μg/mg，最佳标记量一般为20μg/mg。
时间分辨荧光微球免疫层析法定量检测克伦特罗赖科洋;陈媛【摘要】建立了一种定量检测克伦特罗的时间分辨荧光微球免疫层析法.对抗体标记量、微孔中克伦特罗抗体-时间分辨荧光微球探针的体积以及检测线上抗原浓度进行了优化.通过时间分辨荧光微球试纸条检测仪读取试纸条上检测线和质控线的信号强度,以克伦特罗标准品的浓度为横坐标,以检测线和质控线信号强度的比值为纵坐标建立标准曲线.结果表明:该方法定量检测范围为0.01～0.81μg/L,检测限为0.004μg/L,半抑制率为0.06μg/L.本检测方法具有简便、灵敏度高、快速和可定量等特点,适合于大批量样品的现场筛查.【期刊名称】《江西科学》【年(卷),期】2018(036)002【总页数】4页(P244-247)【关键词】时间分辨荧光微球;克伦特罗;检测;免疫层析【作者】赖科洋;陈媛【作者单位】南昌市第三中学,330029,南昌;南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,330047,南昌【正文语种】中文【中图分类】O657.30 引言克伦特罗(Clenbuterol,CLE)是一种β-肾上腺素受体激动剂，最初作为一种饲料添加剂用于畜牧业养殖，能够显著地提高动物瘦肉率，俗称“瘦肉精”[1]。
人食用残留有CLE的肉制品后会引起如心悸、头晕、心跳加快等中毒症状[2]，对人的身体健康造成危害。
因此，我国明文禁止CLE用于饲料添加剂，规定在动物性食品中不得检出CLE[3]。
目前，分析CLE残留常用的方法有气相色谱串联质谱法[4]、液相色谱串联质谱法[5-6]、高效液相色谱法[7]、酶联免疫吸附法[8-9]和胶体金免疫层析法(Colloidal gold lateral flow assay,CGLFA)[10-11]等。
前4种方法具有灵敏度高、准确性好、特异性强的优点，不过检测时间长、操作复杂、费用高，不适合大量样本的现场筛查。
CGLFA具有快速、简便和费用低等优点[12]，但该检测方法灵敏度较差，一般只用于定性分析。
时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析(time-reso1vedfIuoroimmunoassay,TRFIA)是80年代初问世的一种超灵敏度的标记免疫检测技术。
其主要特点是以锢系元素铺(Eu3υ等标记抗体或抗原为示踪剂，利用增强液的荧光放大作用和时间分辨荧光法排除样品或试剂中非特异性荧光物质的干扰，最大限度地提高了检测方法的灵敏度和特异性，还具有量程宽,操作简便,标记物容易制备，稳定性好，保存期长等诸多优点。
一、基本原理与放免分析相似，总体上分为竞争法和非竞争法两类，前者多用于小分子半抗原，后者用于大分子化合物。
铺系元素第(Eu).彭(Sn1)、轼(Tb)和钛(Nd)通过双功能螯合剂，在水溶液中很容易与抗原或抗体分子以共价双键结合。
经抗原、抗体间特异性的免疫结合反应，测定免疫复合物的荧光强度，就可推算待测物质的浓度。
辆系离子的荧光信号极弱，需要在酸性条件下，解离出铺系离子，然后与荧光增强液中的B-二酮体生成新的螯合物，经紫外光激发可产生强而持久的荧光信号，其增强效力可达100万倍，故又称解离增强铺系荧光免疫分析(dissociation-enhanced-1anthanidefIuoroimmunoassay,DE1FIA)o锢系元素的发光时间延长，如Eu*和Snr的荧光衰变时间分别达到 4.3×IOns和4.1×10,ns,而样品和试剂中的自然本底荧光的衰变时间仅为4-10ns,通过延迟测量时间，使信号不受本底荧光影响。
此外，锢系元素螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，StOkeS位移大，有利于排除非特异性散射光的干扰，进一步提高荧光信号的特异性。
二、试剂组成(一)EuS标记物：可分为标记抗体、标记抗原，要求有较高的纯度、比活性和免疫活性。
密封后4。
C或-20。
C保存，但应避免反复冻融。
若发现蛋白质聚合，非特异性结合升高，则应停止使用。
(二)固相抗体或抗原：固相载体多用聚苯乙烯微孔条，要求透明度高，吸附性能好，材质均匀，孔间差异小，不同品牌甚至不同批号的微孔条间都会有明显的性能差异，应引起注意。
荧光免疫法和免疫荧光层析法一、免疫标记法及其分类1.荧光免疫法原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。
底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min内得出结果。
结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。
该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。
以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。
除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。
洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。
最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。
传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2.放射免疫法放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。
然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。
RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng／ml水平。
但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。
近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。
3.酶联免疫法(ELISA)ELISA法有竞争法和夹心法两种。
竞争法是基于标准或血清Mb 和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg／L，线性范围达1 000ug ／L。
夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r＝0.92)。
ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。
时间分辨荧光免疫层析技术原理
时间分辨荧光免疫层析（Time-Resolved Fluorescence Immunoassay，TRFIA）是一种高灵敏度、高特异性的生物分析技术，广泛应用于生物医学领域。
该技术基于免疫层析原理，结合了荧光
标记和时间分辨测量的特点，能够实现对微量生物分子的快速、准
确检测。
TRFIA技术的原理基于稀土金属离子的荧光特性。
在实验中，
检测物质（例如蛋白质、激素、抗体等）会与特定的荧光标记结合
形成复合物，然后通过免疫层析柱进行分离。
随后，样品中未结合
的荧光标记物会被洗脱，而复合物则被保留在柱中。
接下来，通过
加入特定的激发光源激发样品，荧光标记物会发出特定的荧光信号。
与常规荧光免疫层析不同的是，TRFIA采用时间分辨荧光测量技术，通过延迟时间来排除非特异性的背景信号，从而提高了检测的特异
性和灵敏度。
TRFIA技术具有许多优点。
首先，由于时间分辨测量可以排除
大部分非特异性背景信号，因此TRFIA具有极高的特异性。
其次，
由于稀土金属荧光物质具有长寿命的特性，可以在激发光停止后仍
然发出荧光信号，因此TRFIA具有极高的灵敏度。
此外，TRFIA还
可以同时进行多重检测，提高了检测效率。
总之，时间分辨荧光免疫层析技术以其高特异性、高灵敏度和多重检测的优势，成为生物医学领域中重要的分析技术，为生物分子的快速、准确检测提供了有力的工具。
