食品微生物学实验指导书
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食品微生物学实验指导
（食工、烹饪专业用）
1
目 录
实验一 显微镜的构造及使用方法 ....................................... 5
实验二 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别 ............................. 9
实验三 霉菌的形态观察 .............................................. 11
实验四 细菌的简单染色与形态观察 .................................... 13
实验五 细菌的革兰氏染色与芽孢染色 .................................. 14
实验六 培养基的制备与灭菌 .......................................... 16
实验七 细菌的分离培养及培养性状的观察 .............................. 22
实验八 酵母菌细胞计数 .............................................. 30
实验九 食品中细菌总数的测定 ........................................ 32
实验十 食品中大肠菌群数的测定 ...................................... 37
附录一 常用染色液 .................................................. 44
附录二 常用培养基配方 .............................................. 45
2 实验室安全守则
1.进入实验室工作衣、帽、鞋必须穿戴整齐。
2.在进行高压、干燥、消毒等工作时，实验人员不得擅自离开现场，认真观察温度、时间，蒸馏易挥发、易燃液体时，不准直接加热，应置水浴锅上进行。
3.严禁用口直接吸取药品和菌液，按无菌操作进行，如发生菌液、病原体溅出容器外时，应立即用有效消毒剂进行彻底消毒，安全处理后方能离开现场。
4.实验完毕，两手用清水肥皂洗净，必要时可用（杀菌剂）新洁尔灭、过氧乙酸液浸泡手，然后用水冲洗，工作服应经常清洗，保持整洁，必要时高压消毒。
5.实验完毕，及时清理现场和实验用具，对染菌带毒物品，进行消毒灭菌处理，并填写日常工作记录。
6.每日实验结束，认真检查水、相关电源是否关闭和正在使用的设备运转是否正常，并认真记录。关好门窗，方可离去。
实验室检验总则
一、样品的采集
（一）采样目的
确保采集的样品能代表全部被检验的物质，使检验分析更具代表性。
（二） 采样原则
1.采集的样品要有代表性，采样时应首先对该批食品原料、加工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查，检查是否有污染源存在，同时能反映全部被检食品的组成、质量和卫生状况。
2.应设法保持样品原有微生物状况，在进行检验前不得污染，不发生变化。
3.采样必须遵循无菌操作程，容器必须灭菌，避免环境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，新洁尔灭、酒精等消毒物灭菌，更不能含有此类消毒药物，以避免杀掉样品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可使用。
（三）采样数量
取样数量的确定，应考虑分析项目的要求、分析方法的要求及被检物的均匀程度三个因素。样品应一式三份，分别供检验、复检及备查使用，每份样品数量一般不少于200g。
3 根据不同种类采样数量略有不同，实验室检验样品一般为25克。
（四）采样方法
1．采取随机抽样的方式。
2．直接食用的小包装食品，尽可能取原包装，直到检验前不要开封，以防污染。
3． 如为非冷藏易腐食品，应迅速将所采样品冷却至0－4℃。
4．不要使样品过度潮湿，以防食品中固有的细菌增殖。
5．在将冷冻食品送到实验室前，要始终保持样品处于冷冻状态。样品一旦融化，不可使其再冻，保持冷却即可。
（五）样品的保存和运送
1．样品采集完后，应迅速送往实验室检验，送检过程中一般不超过3h，如路程较远，可保存在1－5℃环境中，如需冷冻者，则在冷冻状态下送检。
2．冷冻样品应存放在－15℃以下冰箱内；冷却和易腐食品应存放在0－5℃冰箱或冷却库内；其它食品可放在常温冷暗处。
3．运送冷冻和易腐食品应在包装容器内加适量的冷却剂或冷冻剂。保证途中样品不升温或不融化。
4．待检样品存放时间一般不应超过36小时。
二、检验样品的制备
（一）样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。
（二）检验冷冻样品前应先使其融化。可在0－4℃融化，时间不超过18小时，也可在温度不超过45℃的环境中融化，时间不超过15分钟。
（三）检验液体或半固体样品前应先将其充分摇匀。如容器已装满，可迅速翻转25次；如未装满，可于7s内以30cm的幅度摇动25次。从混样到检验间隔时间不应超过3min。
(四)开启样品包装前，先将表面擦干净，然后用75％乙醇消毒开启部位及其周围。
1．非粘性液体样品可用吸管吸取一定量，然后加入适量的稀释液或培养基内，吸管插入样品内的深度不应超过2.5cm,也不得将吸有样品的吸管浸入稀释液或培养基内。
4 2．粘性液体样品可用灭菌容器称取一定量，然后加入适量的稀释液或培养基。
3.固体或半固体样品可用灭菌的均质杯称取一定量，再加适量的稀释液或培养基进行均质，从样品的均质到稀释和接种，相隔时间不应超过15分钟。
三、检验
（一）实验室收到样品后，首先进行外观检验，及时按照国家标准检验方法进行检验，检验过程中要认真、负责，严格进行无菌操作，避免环境中微生物污染。
（二） 检验所使用的稀释液、试剂、培养基接触的一切器皿必须经过有效的灭菌。
（三）实验室所用仪器、设备的性能应定期检查和校正。
（四）制备试剂和培养基所用的水，应为无离子水或用玻璃器皿蒸馏的蒸馏水。
（五） 检验结束后，所有带菌的培养基、试剂、稀释液和器皿必须尽快灭菌和洗刷。清洗过的器皿不应残留洗涤剂的痕迹。
四、检验记录和结果的报告
（一）经检验的每份样品都应有完整的检验记录。样品检验过程中所用方法、出现的现象和结果等均要用文字写出试验记录，以作为对结果分析、判定的依据，记录要求详细、清楚、真实、客观、不得涂改和伪造。
（二） 检验结束后，根据检验结果，及时填写检验报告书，签字并经负责人审核签字后发出。
5 实验一 显微镜的构造及使用方法
一、目的要求
1. 了解显微镜的构造、性能及成像原理。
2. 掌握显微镜的正确使用及维护方法。
二、实验器材
1. 显微镜、纱布、绸布
2. 细菌示教标本
三、普通光学显微镜简介
微生物的最显著的特点就是个体微小，必须借助显微镜才能观察到它们的个体形态和细胞结构。熟悉显微镜并掌握其操作技术是研究微生物不可缺少的手段。
显微镜可分为电子显微镜和光学显微镜两大类。光学显微镜包括：明视野显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜、立体显微镜等。其中明视野显微镜为最常用普通光学显微镜，其它显微镜都是在此基础上发展而来的，基本结构相同，只是在某些部分作了一些改变。明视野显微镜简称显微镜。
（一）显微镜的构造
普通光学显微镜的构造可以分为机械和光学系统两大部分。
图1-1 显微镜构造
1.目镜 2.镜筒 3. 转换器 4. 物镜 5. 载物台 6. 聚光器 7. 虹彩光圈
8. 聚光镜调节钮 9.反光镜 10. 底座 11. 镜臂 12. 标本片移动钮
13. 细调焦旋钮 14. 粗调焦旋钮 15.电源开关 16.光亮调节钮 17.光源
1. 机械系统：
（1） 镜座Base：在显微镜的底部，呈马蹄形、长方形、三角形等。
（2） 镜臂Arm：连接镜座和镜筒之间的部分，呈圆弧形，作为移动显微镜时的握持部分。
（3） 镜筒Tube：位于镜臂上端的空心圆筒，是光线的通道。镜筒的上端可插入接目镜，下面可与转换器相连接。镜筒的长度一般为160mm。显微镜分为直筒式和斜筒式；有单筒式的，也有双筒式的。
（4） 旋转器Nosepiece：位于镜筒下端，是一个可以旋转的圆盘。有3~4个孔，用于安装不同放大倍数的接物镜。
6 （5） 载物台Stage：是支持被检标本的平台，呈方形或圆形。中央有孔可透过光线，台上有用来固定标本的夹子和标本移动器。
（6） 调焦旋钮：包括粗调焦钮Coarse adjustment knob和细调焦钮Fine adjustment knob，是调节载物台或镜筒上下移动的装置。
2. 光学系统
（1） 接物镜Objective lens，常称为镜头，简称物镜，是显微镜中最重要的部分，由许多块透镜组成。其作用是将标本上的待检物进行放大，形成一个倒立的实像，一般显微镜有3~4和物镜，根据使用方法的差异可分为干燥系和油浸系两组。干燥系物镜包括低倍物镜（4~10x）和高倍物镜（40~45x），使用时物镜与标本之间的介质是空气；油浸系物镜（90~100x）在使用时，物镜与标本之间加有一种折射率与玻璃折射率几乎相等的油类物质（香柏油）作为介质。
（2） 接目镜Eyepiece lens：通常称为目镜，一般由2~3块透镜组成。其作用将由物镜所形成的实像进一步放大，并形成虚像而印入眼帘。一般显微镜的标准目镜是10x。
（3） 聚光镜Condenser：位于载物台的下方，由两个或几个透镜组成，其作用是将由光源来的光线聚成一个锥形光拄。聚光镜可以通过位于载物台下方的聚光镜调节旋钮进行上下调节，以求得最适光度。聚光器还俯有虹彩光圈（Iris diapHragm）,此调节锥形光拄的角度和大小，以控制进入物镜的光的量。
（4） 反光镜：反光镜是一个双面镜，一面是平面，另一面是凹面，起着把外来光线变成平行光线进入聚光镜的作用。使用内光源的显微镜就无需反光镜。
（5） 光源：日光和灯光均可，以日光较好，其光色和光强都比较容易控制，有的显微镜采用装在底座内的内光源。
（二）显微镜的成像原理
显微镜的放大作用是由物镜和目镜共同完成的。标本经物镜放大后，在目镜的焦平面上形成一个倒立实像，再经目镜进一步放大形成一个虚像，被人眼所观察到（图1-3）。
在油镜系中，载玻片与镜头之间多用香柏油作介质。因香柏油的折射率（n=1.51）与玻璃的折射率（n=1.52）几乎相等，故透过载玻片的光线通过香柏油后，直接进入物镜，而不发生折射。两组物镜光线通路的区别如图1-4所示 图1-2 物镜的各种标记 1——放大倍数
2——数值口径
3——镜筒长度要求
4——指定盖玻片厚度
