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食品微生物实验指导书

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实验四酸奶/泡菜中乳酸菌的分离、纯化

一、 实验目的

1、 巩固无菌操作的基本环节和几种接种技术；

2、 了解微生物分离和纯化的原理；

3、 掌握分离纯化乳酸菌的方法。

二、 实验原理

乳酸发酵是指微生物将己糖分解产生乳酸的生物学工程。能够引起乳酸发酵的微生物种

类很多，其中主要是细菌，常见的乳酸细菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。乳酸细菌生成的乳酸，能抑制一些腐败细菌的活动。这类菌在自然界分布广泛，乳制品、葡萄酒、泡菜、酸奶等都可以分离到乳酸菌。乳酸菌常用的分离培养基有麦芽汁碳酸钙培养基、BCP 培养基和西红柿碳酸钙培养基等，在选用培养基时不能只局限于一种培养基，以免乳酸菌某些菌株在个别培养基上不生长而造成分离失败。

乳酸菌是兼性厌氧微生物，菌体细胞通常不运动，不产芽孢，是革兰氏阳性菌。它们生物合成能力较差，需要有糖存在的习性，营养要求包括多种氨基酸、维生素和微氧。这类菌缺乏卟啉和细胞色素，接触酶（过氧化氢）阴性，不能使 H2O2 分解。

三、 实验器材

培养基：BCP 培养基（乳糖 5g、蛋白胨 5g、酵母膏 3g、琼脂 15-20g、溴甲酚紫 0.05g、蒸馏水 1000mL，pH6.8-7.0，115℃灭菌 20min）；西红柿碳酸钙培养基（葡萄糖 10g、酵母膏

7.5g、蛋白胨 7.5g、磷酸二氢钾 2g、碳酸钙 15-20g、吐温 80 0.5mL、琼脂 20g、番茄汁

100mL（新鲜番茄洗净切碎放入烧杯中，4℃静置 8-12h，取出纱布过滤即可）、蒸馏水

900mL， pH7.0，121℃灭菌 20min）；BCG 牛乳培养基[A 液：脱脂乳粉 100g、水 500mL、1.6%溴甲苯酚绿乙醇溶液 1mL（1.6g 溴甲苯酚绿溶于 20mL 无水乙醇，再加水定容至

100mL）、80℃ 灭菌20min；B 液：酵母膏 10g、水 500mL、琼脂 20g，pH6.8、121℃灭菌20min；A液和B 液以无菌操作趁热混匀]。

材料：酸奶或泡菜汤、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、无菌培养皿、培养箱等。 四、 操作步骤与内容

1、 培养基的配制

① 每组配制各 150mL BCP 培养基和西红柿碳酸钙培养基（放灭菌锅中保温）；

② 盛 9mL 蒸馏水的 3 支试管、6 套培养皿、10mL 移液管 3 支、盛 90mL 蒸馏水的三角瓶（9 个），包扎，于 121 高压蒸汽灭菌 20min。（灭菌完冷却至室温）

2、 菌悬液的配制

按 10 倍稀释度的方法稀释，先用盛 90mL 无菌水的三角瓶进行稀释，分别稀释成 10-1、

10-2 和 10-3 稀释液，再用盛 9mL 无菌水进行稀释，分别稀释成 10-4、10-5、10-6 和 10-7。

3、 倒平板（稀释混合平板法直接做 4-②步骤，西红柿碳酸钙培养基倾倒时摇匀）

① 稀释涂布平板法

做 2 个稀释度 10-5、10-6 和 10-7，每个稀释度做 2 个平行并表明编号（10-5、10-6、10-7），将灭菌好的培养基冷到 45℃左右，按无菌操作倒平板（每皿 15mL），待凝固。

② 平板划线法

做 2 个稀释度 10-2 和 10-3，每个稀释度做 3 个平行并表明编号（10-2、10-3），将灭菌好的培养基冷到 45℃左右，按无菌操作倒平板（每皿 15mL），待凝固。

4、 分离（1~3 组涂布、4~7 组稀释混合、8~10 组划线）

① 稀释涂布平板法 用 1mL 无菌吸管分别吸取 0.2mL 的 10-5 和 10-6 稀释液，对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀（图 3）。

② 稀释混合平板法

此法与稀释涂布平板法基本相同，无菌操作也一样，先分别吸取 1mL 的 10-5、10-6 和

10-7 稀释液，对号放入已写好稀释度的平板中，然后再倒入熔化后冷却到 45℃左右的培养基，边倒入边摇匀，使样品中的微生物与培养基混合均匀（图 4），冷凝成平板。

图 3 稀释涂布平板法图 4 平板摇匀方式

③ 平板划线法

划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述 10-2 和 10-3 的菌悬液一环在平板上划线。划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。常用的划线方法有下列二种：

a．用接种环以无菌操作挑取菌悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线 3-4

条，再转动培养皿约 70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于培养箱培养（图 5）。 图 5 平板划线分离操作示意图 b．将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。划线完毕后，盖上皿盖，倒置培养箱培养。

5、培养与鉴定

BCP 培养基和西红柿碳酸钙培养基分别放置 25℃、37℃恒温箱中倒置培养 48h，在

BCP 琼脂平板上，因产酸使培养基由紫色变为黄色，而在西红柿碳酸钙培养基，因产酸使碳酸钙溶解形成透明圈，将 3%过氧化氢溶液滴于菌落上，无气泡产生。将上述特征的菌落进行革兰氏染色，呈阳性杆菌或链球菌，则可将其连续传代 3 次（脱脂乳试管：脱脂乳 10g、蔗糖

5g、水 95mL，115℃、15min），最终筛选出 3~6h 能凝固的牛乳管做菌种待用。注：期间都需要严格的无菌操作。

乳酸菌菌落形态保加利亚乳杆菌 嗜热链球菌某品牌乳酸菌

五、 实验结果

1．在你所实验的培养基平板上长出的菌落生长情况？简述它们的菌落形态特征并拍照。

2．单个菌落低倍镜显微镜图。

3．分离结果图（平板全图）及革兰氏染色图。

六、 思考题

1．在平板划线法中，为什么每次都需将接种环上的剩余物烧掉？

2．为什么要将培养皿倒置培养？

3．列表比较各种接种方法的特点和用途？

4．酸奶或泡菜中大量生长的乳酸菌来自何处？为何它们能成为优势菌群？

实验五 D 值的测定

一、实验目的

1、 巩固培养基的配制、灭菌、仪器的包扎、倒平板； 2、 测定 D 值二、实验原理

1、 微生物致死间曲线与 D 值

人们对微生物死亡的动力学研究表明，其死亡速度属一级过程，在一定温度下符合下述方程式：

Kt log Nt  log N0

2.303

式中：N0—为原始微生物数；

Nt—为残存的微生物 t 时残存的微生物。

残存数的对数时间作图，得一条直线，直线的斜率＝K/2.303，K 为速度常数，单位为时间。为了方便起见，引用 D，并定义 D 为一定温度下杀死被灭菌物品中微生物娄 90％所

需时间，则

2.303 2.303

Dlog100log10

K K

因此，D 也可定义为降低微生物一个十位数或一个对数值（如 log100 降低到 log10）所需的时间，如图 1 所示。D 值因微生物的种类、环境、灭菌温度不同而各异（表 1）。

2、 Z值一旦在不同温度下对特定的微生物的在特定介质或环境中求得D 值后，就可用 logD

值对温度作图，在一定温度范围内，logD 与 T 呈直线关系，直线的斜率=logD2-logD1／T2-T1。

由于此斜率为负值，为避免引入负数，而提出 Z 值的概念，Z= T2-T1/logD2-logD1，故定义 Z 值为降低一个 logD 值所需的温度数，如图 2 的单位为温度，也可以认为 Z 值是降低微生物数 90％所需要的温度数，表 2 一些药物溶液的 Z 值。 图 1

logNt 与 t 的关系图图 2 logD 与 T 关系图表 1 不同灭菌法不同微生物的 D 值

灭菌方法 微生物 温度/℃ 介质或样品 D 值/min

蒸汽灭菌 嗜热脂肪芽孢杆菌 105 5％葡萄糖水溶液 87.8

蒸汽灭菌 嗜热脂肪芽孢杆菌 121 5％葡萄糖水溶液 2.4

蒸汽灭菌 嗜热脂肪芽孢杆菌 121 注射用水 3.0

蒸汽灭菌 产芽胞梭状芽孢杆菌 105 5％葡萄糖水溶液 1.3

干热灭菌 枯草芽孢杆菌 135 纸 16.6

红外线灭菌 枯草芽孢杆菌 160 玻璃板 18 秒

表 2 不同溶液中嗜热脂肪芽孢杆菌的 Z 值

溶液 Z 值（℃）

5％葡萄糖水溶液 10.3

注射用水 8.4

5％葡萄糖乳酸盐林格氏溶液 11.3

pH7.0 磷酸缓冲液 7.6

三、 实验器材

菌种大肠杆菌（Esaherichia Coli.）的新鲜培养液（150mL、含活菌数不大于 107 个/ ml）。

培养基葡萄糖牛肉膏蛋白胨固体培养基（3g 牛肉膏、10g 蛋白胨、5g NaCl、5g 葡萄糖、18-20g 琼脂、蒸馏水 1000ml、pH7.0-7.2）；葡萄糖牛肉膏蛋白胨液体培养基，分装 250mL

三角瓶，每瓶装 90mL。

材料水浴锅、平板、吸管、三角瓶、无菌水、试管、试管架等。

四、 操作步骤和内容

1．每组需制 150mL 固体培养基和 90mL 液体培养基分别装于三角瓶中、盛 9mL 蒸馏水的试管 6 支，培养皿 6 套，10mL 移液管 1 支，包扎。 2、 1mL 移液枪头，包扎。

3、 上述包扎好的实验器材于 121℃灭菌 15min。

4、 打开水浴锅，设置温度为 60℃。

5、 灭完菌后，固体培养基于灭菌锅中保温，而液体培养基冷却至 60℃左右。

6、 将液体培养基置于 60℃的水浴锅中预热 20min（注意不要把纱布弄湿）。

7、 分别吸取大肠杆菌培养液 10ml，接种于上述预热后的液体培养基中（超净台里操作），混匀成 10-1 菌悬液，放入 60℃的水浴锅中，开始计时。

8、 分别按保温 0min（10 组）、5 min（9 组）、10 min（8 组）、15 min（7 组）、20 min（6

组）、

30 min（5 组）、40 min（4 组）、50 min（3 组）、60 min（2 组）、70min（1 组）后，取出菌悬液，水龙头上迅速冷却（注意不要把纱布弄湿）。

9、 先将平板编号（如 8~10 组，每 2 个平板编成 10-5，10-6，10-7）。按 10 倍稀释法将上述菌

悬液稀释成 10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，选取 10-5，10-6，10-7 稀释度（8~10 组）、10-4，

10-5，10-6 稀释度（5~7 组）、10-1，10-2，10-3 稀释度（1~4 组），每个稀释液分别注入两个培养皿，每皿 1mL 稀释液。

10、 采用混合稀释法，将固体培养基倒入已注入 1mL 稀释液的培养皿中（固体培养基

15-20mL），混合均匀。（注意：因超净台、移液枪有限，请不要急于冷却固体培养基，带有空时，方可冷却培养基，以免培养基凝固。为了数据准确，从第 9 步梯度稀释到第

10 步固体培养基混匀需 20min 内完成）。

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食品出厂检验指导书及检验报告

食品出厂检验指导书及检验报告

食品出厂检验指导书及检验报告

概述

本文档旨在提供一份食品出厂检验指导书及检验报告。该检验指导书适用于食品生产企业，其目的是确保生产的食品符合相关法律法规的要求，并保证其品质和安全性。

检验项目

以下是常见的食品出厂检验项目：

1. 外观检验：包括颜色、形状、气味等外观特征的检查。

2. 感官评估：通过尝试和嗅闻来评估食品的口感和气味。

3. 包装检验：检查食品包装的完整性和卫生情况。

4. 标签合规性检验：检查食品标签上的信息是否准确、完整且符合相关法规。

5. 化学分析：对食品中的成分、添加剂和污染物进行检测。

6. 微生物检验：检测食品中的微生物数量和种类。

7. 营养分析：对食品中的营养成分进行定量分析。

8. 保质期评估：评估食品的保质期和贮存条件。

检验方法

食品出厂检验应根据不同的食品类型和检验项目选择相应的方法和标准。以下是一些常用的检验方法：

1. 目测检查：使用肉眼进行外观检查，例如颜色、形状和纹理等。

2. 实验室分析：使用仪器和设备对食品进行化学、微生物和营养等方面的定量分析。

3. 传感器技术：利用传感器设备对食品进行快速、准确的检测和分析。

4. 有机化学分析：使用精密仪器对食品中的有机成分进行定性和定量分析。

5. 统计学分析：对检验结果进行统计学处理和分析，以评估食品质量和安全性。

检验报告

食品出厂检验报告应包含以下内容：

1. 企业信息：列出食品生产企业的名称、地址和联系方式。

2. 检验项目：描述进行的检验项目和方法。 3. 检验结果：对每个检验项目的结果进行详细说明，并与相应的标准进行对比。

4. 结论：评估食品符合与否，并提供建议措施（如不符合要求）或认可（如符合要求）。

5. 签字和日期：检验报告需要由检验员签字，并注明日期。

注意事项

在进行食品出厂检验时，请注意以下事项：

1. 确保检验设备和仪器的准确性和可靠性。

2. 不要将食品样品与其他物质或样品混淆。

蛋糕实验报告

蛋糕实验报告

亲水胶体对鸡蛋蛋清打发性和海绵蛋糕比容的影响

【实验目的】

1、 掌握海绵蛋糕的基本做法，对烘焙食品制作流程有一定的了解。

2、 研究亲水胶体对鸡蛋蛋清打发性的影响。

3、 研究亲水胶体对海绵蛋糕比容影响。

【实验原理及背景】

亲水胶体通常是指能溶解于水中,并在一定条件充分水化形成粘稠、滑腻或胶冻液的大分子物质,俗称“胶”。在食品体系中需要的亲水胶体添加量甚微,通常为千分之几,但却能有效经济地改善体系稳定性。其化学组成大多是天然多糖和蛋白质，本次试验我们用的是cmc和海藻酸钠，均为多糖类。

图1.2 羟甲基纤维素钠的分子结构

所有亲水胶体都具有一定粘度,具有增稠效果,此时亲水胶体分子水化后不发 生相互作用。一般说来,在溶液中容易形成网状结构或具有较多亲水基团的食用胶都具有较高的粘度。同一种食用胶，分子量越大，相同质量浓度的体系粘度就越大。食用胶浓度增大,粘度都会或多或少地有所增加。离子性食用胶的粘度受体 系电解质、的影响比非离子性食用胶的要大。

食品中菌落总数能力验证结果分析

食品中菌落总数能力验证结果分析

食品中菌落总数能力验证结果分析

作者：袁维道 冯晨韵 陈彩霞 王雪吟

来源：《食品安全导刊》2024年第02期

摘 要：目的：為了加强食品中菌落总数检验能力，促进实验室内部质量控制，本实验室参加了中国检验检疫科学研究院测试评价中心组织的ACAS-PT1582（2023）食品中菌落总数计数能力验证。方法：依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》（GB

4789.2—2022）和能力验证作业指导书对两个样品进行检测。结果：样品A812菌落总数为1.4×103 CFU·mL-1，样品Y109菌落总数为5.0×103 CFU·mL-1。经评价，两个考核样品的|Z|值均小于2，结果满意。结论：实验室具备食品中菌落总数的检测能力。 关键词：能力验证；菌落总数；计数；食品

Analysis of Validation Results for Total Bacterial Count in Food

YUAN Weidao， FENG Chenyun， CHEN Caixia， WANG Xueyin

（Hainan Academy of Inspection and Testing， Haikou 570203， China）

Abstract： Objective： In order to strengthen the ability to detect total bacterial count in food

and promote internal quality control in the laboratory， our laboratory participated in the ACAS-PT1582 （2023） validation of the ability to count total bacterial count in food organized by the

食品微生物能力验证霉菌酵母菌计数—检验方法比较

食品微生物能力验证霉菌酵母菌计数—检验方法比较

食品微生物能力验证霉菌酵母菌计数—检验方法比较

霉菌酵母菌在自然界中分布极广，种类繁多，食品中易受到不同程度的污染。食品中霉菌酵母菌的增殖一般会导致营养价值下降、酸败变味或外观恶化等，影响货架期及口感，若霉菌、酵母菌含量较高，且日摄入量较多，会影响人体肠胃内的微生物平衡，甚至造成肠胃不适，可能引起疾病发生。霉菌对干食品的最大风险主要是在适宜的条件下(产毒株、数量、温度、湿度、水分活度等），能产生霉菌的有毒代谢产物—霉菌毒素，引起过敏反应等各种急、慢性中毒及可能的致癌作用。因此，人们愈来愈重视食品中霉菌及酵母菌污染对人体造成的危害。

在我国国家部分食品产品及卫生标准中，把霉菌和酵母菌作为常见指示菌进行监测和控制，如饮料、坚果制品、米面制品、糕点类等食品。霉菌和酵母的检测被列入国标4789 系列食品安全微生物常规检测项目之一 , 霉菌酵母菌的检验方法看似简单，但由于食品种类繁多成分复杂，食品中存在的霉菌种类较多，对环境温湿度及营养成分的要求有所不同，要在同等条件下把所有的霉菌培养出来，反映出样品的真实情况，实属不易，且霉菌前期生长速度缓慢，后期菌丝急剧增加，特别是毛霉的蔓延，给霉菌和酵母菌的同时计数带来一定的困难，如何能更准确、快速提离食品中霉菌检测数目是食品卫生部门面临的一个严峻问题。

能力验证是利用实验室间的比对判定实验室的特定校准、检测能力，以考察实验室检验能力的外部质量活动,组织方提供试验的样本，一般会考虑增加检测难度。为了更准确更全面得出能力验证结果，本实验室综合了多种方法进行同步检测，主要是考虑霉菌、酵母菌总数检测是通过平板中生长的菌落数目直接计数推算，培养基的质量和培养方式直接影响了检测的结果，因此，选择两种常用的霉菌酵母培养基，采用正置和倒置培养法进行试验，比较分析不同培养基、不同培养方式对霉菌酵母菌计算结果的差异，进而得出较为准确的试验结果进行上报。

2 材料与方法

2.1 样品