大鼠肺动脉内皮细胞原代培养

生和发展都是以内皮细胞受损为基础，肺微血管内皮细胞在病理条件下，不仅是炎症反应的主要靶细胞，更是活跃的炎症细胞和效应细胞。

其功能和结构的完整性对于维持正常肺功能至关重要，这种特殊的细胞类型是研究肺功能不全及许多肺部疾病发生机制的理想细胞模型来源[4]。

近年，从生物化学、细胞生物学及分子生物学等方面探究内皮细胞生理功能的研究课题日益增多，有助于更全面认识PMVECs并了解其相关机制，进而可对相关疾病进行预防和治疗[5]。

近20年，国内外对PMVECs的研究取得众多成果，但其养困难、成本高、重复性差、易污染等问题，降低了培养成功率，因此建立完整高效的PMVECs培养方法意义重大。

本文总结了PMVECs培养的一般方法，具体流程，见图1。

图1 皮细胞培养一般流程1 肺微血管内皮细胞培养法1.1 原代培养肺微血管内皮细胞原代培养是指从活体生物中将肺组织取下进行培养，在完成首次传代培养之前的细胞都称为原代培养[6]。

国内外研究报道的肺微血管内皮细胞的方法主要有2种，一是组织块贴壁法[7-10]，二是酶消化法[11]。

2种方法各有利弊，组织块法操作简单、细胞成活率高、成本低、可减少因酶消化造成的细胞损伤，但是细胞迁出时间不好把握且组织块去除不彻底会造成其他杂细胞污染等。

酶消化法培养周期快、细胞生长速率快，但是消化时间和酶浓度不好控制，细胞成活率可能会因为消化时间过长受到影响。

1.1.1 组织块贴壁法组织块贴壁法是指将取自活体生物的组织，在无菌条件下剪成1×1×1 mm3小块，平铺在培养器皿中，加入含胎牛血清的培养基在37 ℃5%CO2条件下培养的方法。

组织块贴壁法的一般操作步骤：先去除组织胸膜，将去除胸膜的肺组织剪下1～3 mm左右的肺组织边缘，切成1×1×1 cm3组织块，用基础培养基DMEM清洗多次，至少3次，均匀地贴在25 cm2的培养瓶中，放入5% CO2 37 ℃的培养箱中培养1 h，等组织块贴壁后，加入完全培养基DMEM（20%FBS、ECGS、肝素钠、双抗等），放入培养箱中16 h以上，去除未贴壁的组织块，加入新的培养基，以后每2～3 d更换1次培养基。

大鼠肺血管内皮细胞原代培养技术的改进刘琦;赵明祥;吴珊;朱艳玲【期刊名称】《贵阳医学院学报》【年(卷),期】2006(31)4【摘要】血管内皮细胞是一群异质性很强的细胞，参与了血管再生、分泌血管活性物质、维持血管壁的完整、调节血管壁的通透性和促凝、抗凝功能等一系列生理及炎症反应过程。

肺血管内皮细胞培养常用的方法是组织贴块法和酶消化法，但这两种方法存在着一定缺陷，组织块贴块法引起组织内血凝块容易阻塞血管，妨碍内皮细胞的游出，还需要多次更换培养液去除血细胞；酶消化法又存在着价格昂贵，操作步骤复杂、胶原酶对细胞的毒性作用等。

2004年10月综合组织贴块法的优点和酶消化法灌流的思想，对原有的方法进行了改进，以求找到一种简单、有效获取大鼠肺血管内皮细胞的方法，为进一步实验打下基础。

【总页数】3页(P379-381)【作者】刘琦;赵明祥;吴珊;朱艳玲【作者单位】贵阳医学院,医学科学研究所,贵州,贵阳,550004;贵阳医学院,医学科学研究所,贵州,贵阳,550004;贵阳医学院,医学科学研究所,贵州,贵阳,550004;贵阳医学院,医学科学研究所,贵州,贵阳,550004【正文语种】中文【中图分类】Q813.11【相关文献】1.改良大鼠肺微血管内皮细胞原代培养技术及细胞鉴定 [J], 刘勇军;王萍萍;马婕;欧阳彬;陈娟;管向东2.原代大鼠脑微血管内皮细胞培养方法的改进 [J], 徐平湘;齐特;陆莉;薛明;肇玉明3.大鼠肺微血管内皮细胞原代培养方法的改进及细胞鉴定 [J], 李颖川;江伟;周明;薛瑛;李亚春4.大鼠肺微血管内皮细胞原代细胞制备及纯化的方法改进 [J], 陈巧红;盛楠;孙静;冯波;胡格5.大鼠肺微血管内皮细胞原代细胞制备及纯化的方法改进 [J], 陈巧红[1];盛楠[1];孙静[2];冯波[1,3];胡格[1,2,3]因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

大鼠肺微血管内皮细胞编号名称规格北京派瑞金GK1001大鼠肺微血管内皮细胞5×105cells/瓶为能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。

派瑞金提供的大鼠肺微血管内皮细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。

研发的大鼠肺微血管内皮细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。

同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。

大鼠肺微血管内皮细胞简介：1、名称：大鼠肺微血管内皮细胞2、组织来源：大鼠肺血管组织3、规格：5×105cells/25cm2培养瓶4、细胞简介：大鼠肺微血管内皮细胞分离自正常大鼠肺血管组织，血管内皮细胞密切参与包括再生、发育、伤口愈合等一系列生理及炎症反应。

细胞呈梭形或多角形,形成单层后呈典型的鹅卵石样或铺路石样排列。

肺微血管内皮细胞构成半选择性屏障，该屏障对于肺气体交换，调节液体和可溶物在血液与肺间质之间的流动具有重要意义。

本公司生产的大鼠肺微血管内皮细胞总量约为5×105cells/瓶，细胞纯度75%~85%，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

5、培养基信息：1）培养基类型：1640培养基(GIBCO，添加NaHCO31.5g/L，Sodium Pyruvate0.11g/L) 2）添加因子：优质胎牛血清10%，细胞生长因子等大鼠肺微血管内皮细胞使用方法：收到细胞后，请按照以下方法进行操作。

1.取出25cm2培养瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中静置6-8小时或者过夜，以稳定细胞状态。

2.待细胞达到80%汇合时准备进行传代培养。

大鼠肺动脉内皮细胞的简易培养鉴定准备工作：玻璃平皿（过酸高压）一次性平皿（1%明胶铺底4℃过夜用前2h移入孵箱用前培养液冲洗）手术器械（高压或紫外照射+酒精浸泡）PBS（高压后4℃预冷）超净台内操作冰袋原代1. 200-300g健康雄性大鼠2. 腹腔麻醉（10%水合氯醛3.5-4ml/kg）颈动脉放血3. 整个大鼠浸泡于75%酒精2-3s4. 剪开胸腔将心、肺一并切除放入PBS或Hanks液中备用（含青霉素200u/ml，链霉素200ug/ml）5. PBS冲洗分离并剪下肺动脉主干冲净血管内血液纵行剪开肺动脉平展在塑料管上切成1.5mm * 1.5mm的小动脉片以内膜面贴于灭菌的35mm培养皿6. 置孵箱微干涸2h7. 加入培养基2ml8. 放入孵箱（37℃5%CO2湿度100%）9. 72h后细胞可达一定密度除去动脉片换液一次10. 以后每2d换液一次每次换1/2 继续培养6-10d 形成细胞单层（内皮纯度达95%）传代1. 0.08%胰蛋白酶消化每瓶1ml 常温5min2. 终止消化后加入3ml培养基3. 吹打混匀后吸出0.1ml 细胞计数将细胞数调整为（2.5-3.0）* 105个/ml4. 25cm2培养瓶每瓶接种3ml细胞悬液5. 继续培养依次传代鉴定1. 细胞消化后800r/min 5min 除去培养液PBS（温）重悬取少许悬液薄涂于玻片上吸水纸吸干甲醇固定5-10min 取出备用2. VIII 因子相关抗原间接荧光染色PBS（0.01mol/L pH7.2）洗3min *3次加一抗：VIII 因子相关抗原抗血清50ul （0.01 mol/L pH7.2 PBS稀释）37℃密封孵育30minPBS 洗3min *3次加二抗：50ul37℃密封孵育30minPBS 洗3min *3次吸干缓冲甘油封片荧光显微镜观察（对照片不加一抗用PBS代替）3. 异植物血凝素结合试验PBS冲洗吸干加荧光标记的异植物血凝素（25ug/ml）50ul室温密封孵育30minPBS冲洗3min *3次吸干缓冲甘油封片荧光显微镜检。

大鼠肺微血管内皮细胞培养及鉴定*谢　崧　杨晓静　钱桂生　王关嵩(第三军医大学新桥医院,　重庆　630037)摘要　取大鼠周边肺组织进行肺微血管内皮细胞培养。

将肺组织切成小块,用含有20%新生牛血清、肝素90L g/ ml、L-谷胺酰胺4mmol、青霉素100U/ml和链霉素100L g/m l的R PM I-1640培养基培养。

血细胞立即从肺组织周围游出。

继而是肺微血管内皮细胞。

成纤维细胞及其他细胞72h才游出。

培养60h后取出肺组织块,培养瓶中只有微血管内皮细胞和血细胞。

后者可通过传代除去。

获得的肺微血管内皮细胞具有规律的鹅卵石样形态和对异植物血凝素结合试验及八因子相关抗原免疫荧光染色均阳性。

关键词　大鼠　肺循环　微循环　内皮细胞　细胞培养　肺微血管在生理和病理情况下都起着重要作用,如与成人呼吸窘迫综合征、肺动脉高压[1]等的发生有关。

目前仅限于肺动脉内皮细胞的研究,而肺微血管和大血管之间据文献报道在表型和功能有着显著的不同[2]。

故有培养和研究肺微血管内皮细胞的必要。

虽然肺有大量的血管内皮细胞,但同时存在40多种类型的细胞尤其成纤维细胞和平滑肌等细胞的迅速生长,使内皮细胞生长受抑制。

分离和培养纯的肺微血管内皮细胞较为困难。

国内未见肺微血管内皮细胞培养的报道。

本文采用简单的方法成功地分离和培养出大鼠肺微血管内皮细胞。

1　材料和方法1.1　主要试剂　RPM I-1640培养基为美国Gibco 公司产品。

新生牛血清由华西医科大学公共卫生学院生产。

兔抗人八因子相关抗原抗血清为DAKO公司产品,华美分装。

荧光标记异植物血凝素为Sigm a 公司产品。

荧光标记羊抗兔1gG由卫生部上海生物制品研究所生产。

抗菌素为青霉素钠盐和硫酸链霉素。

L-谷氨酰胺为第二军医大学分装。

胰蛋白酶和肝素钠均为上海生化试剂商店提供。

大鼠肺动脉内皮细胞按本研究所建立的方法[3]培养。

1.2　取材　选重200-300g健康雄性Wistar大鼠,10%乌拉坦(10L l/mg)腹腔麻醉。

大鼠血管内皮细胞培养
1、劲椎脱臼处死大鼠，75%酒精中浸泡1分钟，打开胸腔，分离主动脉，放在无菌的D-Hanks 液培养皿中。

2、用眼科剪和镊子出去血管外周的脂肪和纤维组织，用含抗生素的D-hanks冲洗血管内外凝血数次，再放入另一无菌培养皿中。

3、用眼科剪纵向剪开血管，用手术刀将其切成1立方毫米大小的动脉植块，然后种植到培养皿中（培养皿用1%明胶37℃下过夜，使用前2h移入二氧化碳培养箱中，用时可以先经含10%小牛血清的培养液冲洗）。

将动脉植块的内膜面与皿底接触，种植密度约1块/立方厘米。

4、培养皿中静置2h（干贴壁），然后加入0.5ml含25%胎牛血清的培养液，略微盖过动脉植块内膜面。

24h后，更换培养液，加入2-3ml培养液。

5、72h左右，当观察到内皮细胞充分长出，而成纤维细胞刚要长出的时候，将动脉植块除去，刮出成纤维细胞，换培养液1次，以后每两天换液1次，每次换1/2 —1/3的液量。

继续培养8-10d，细胞融合成单层即可传代。

基金项目:国家自然科学基金资助项目(No .30370561);河北省自然科学基金资助项目(No .C2004000639)作者单位:075029　河北张家口,河北北方学院病理生理教研室第一作者简介:陈瑞华(1966-),男,汉族,张家口人,副教授。

主要从事危重病的病理生理学研究。

△通信作者:ncylxf@s ohu .com文章编号:100728568(2007)0120016204・实验研究・大鼠肺微血管内皮细胞的培养陈瑞华,赵自刚,牛春雨△,张　静,张玉平【摘要】　目的　建立简单有效地获取大鼠肺微血管内皮细胞(P MVEC )的培养方法。

方法　从实验动物、培养基、植块方法、胎牛血清浓度等方面对植块培养法进行改进,应用W istar 雄性大鼠的肺组织,进行P MVEC 的原代培养并传代培养;通过倒置显微镜、扫描、透射电镜观察其形态,并进行免疫组织化学鉴定。

结果　体外培养的大鼠P MVEC 呈梭形或多角形,形成单层后呈典型的鹅卵石样或铺路石样排列,获得的血管内皮细胞纯度较高,抗Ⅷ因子阳性反应,成功建立了P MVEC 的原代培养方法。

结论　改进的植块培养法简便、可靠,获得的P MVEC 纯度高,生长状态良好,保持了内皮细胞的结构和功能,可用于其功能特性的进一步研究。

【关键词】　肺微血管;内皮细胞;细胞培养中图分类号:Q25 文献标识码:BCulture of Pul m onary M i crova scul ar Endotheli a l Cells i n Ra ts CHEN R u i 2hua,ZHAO Z i 2gang,N I U Chun 2yu,ZHAN J ing,ZHAN G Yu 2ping .D epa rt m en t ofPa thophysiololgy,Hebei N orth U n iversity,Z hang jiakou 075029,China【Abstract 】　O bjecti ve T o devel op a si m p le and rep r oductable method for the is olati on and p ri m aryculture of pul m onary m icr ovascular endothelial cells (P MVECs )of rats .M ethods The tissue bl ock pasted culture method was i m p r oved in experi m ent ani m al,culture -mediu m,tissue bl ock method,fetal bovine ser 2u m (F BS )and s p reading slide method .Rats P MVECs were p ri m ary cultured with lung tissue bl ock pasted methods using lung tissue of male W istar rats,and the cell mor phol ogy was observed using inverted m icr oscope and electr on m icr oscope,and identified using i m munohist oche m ical methods .Results The cultured P MVECs of rats in vitr o showed fusif or m shape or polygon,and the monolayer cultures dis p layed a typ ical cobblest one or pavingst one mor phol ogy and were inhibited when contacted each other,the P MVECs exp ressed fact or Ⅷass o 2ciated antigen.And the p ri m ary culture of P MVEC was established successfully .Conclusi on The pure pul 2monaryMVECs of rats can be attained rap idly and easily by the described method .The method is si m p le,eco 2nom ic and reliable,availability of these cells will facilitate further functi onal character studies .【Key words 】　Pul m onary m icr ovessel;Endothelial cell;Cell cultivati on 微血管内皮细胞衬附于血管内壁,定位于进行血液-组织交换的微血管,它不仅是构成血管组织间屏障的重要成分,而且在调节机体内环境的稳定、维持正常生理和免疫功能,以及介导疾病的发生、发展和转归等方面都发挥主要的作用。

肺动脉平滑肌细胞原代培养操作流程1、健康雄性SD大鼠一只，4周大，重约200g。

2、 75％消毒用酒精2瓶，无菌0.01MPBS溶液500ml，DMEM培养基100ml（含20%胎牛血清、20万IU/L青霉素、20万IU/L链霉素）。

3、解剖板1个（含4条固定用绳子），1L烧杯1个，培养皿2个，培养瓶1个，1ml吸管3根，弯头吹打管3根，眼科剪3把，眼科镊3把，解剖镊3把，止血钳4把，手术刀1把，刀片若干，吸头若干、棉签纱布若干，口罩帽子及无菌手套若干。

二、操作步骤1、洗手，戴口罩帽子及手套。

2、酒精喷洒并擦拭生物安全柜1，放入培养皿1个（倒入PBS并盖好）、手术刀1把、组织剪1把、止血钳4把及纱布若干（均经蒸汽灭菌消毒）。

3、处死大鼠（断颈法），完全浸泡于盛有75%的1L烧杯中3min，换手套，取出大鼠，固定于解剖板上，放入生物安全柜1，打开紫灯消毒30min。

4、酒精喷洒并擦拭生物安全柜2，于左侧放培养瓶、吸管及弯头吸管，眼科剪3把，眼科镊3把，中间放培养皿4个（打开，共8个，其中5个倒入PBS），以上物品均经蒸汽消毒灭菌，除培养皿外均应装入消毒饭盒内防止污染。

左侧放解剖镊1把（泡入酒精中，取吸管时用）。

打开紫灯消毒30min。

5、打开生物安全柜1，开吹风机10min，再一次消毒老鼠。

6、换手套，用手术刀、止血钳、解剖镊、组织剪等开胸，取出完整的心肺组织放入培养皿内，盖好。

7、打开生物安全柜2，开吹风机10min，放入装有心肺培养皿。

8、换手套，用眼科剪眼科镊仔细分离出肺动脉。

9、将取出的肺动脉（长约0.5cm）放入无PBS的培养基中，去除纤维外膜，用眼科剪将其剖开，用PBS冲洗3次至无血迹，（原则上还应刮除肺动脉内皮细胞，但因组织太小不好操作，且内皮细胞在M199培养基中不易生长，故此操作可省略）。

10、在无PBS的培养皿中将肺动脉剪成1mm3大小的组织块（剪碎的组织块常粘在一起，故应用十分锋利的眼科剪才好操作）。