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二代测序质控各参数标准一、引言二代测序（Next-GenerationSequencing，NGS）是一种高通量的基因组测序技术，广泛应用于生物医学研究、农业育种、疾病诊断等领域。
在二代测序过程中，质量控制（QualityControl，QC）是至关重要的一步，其中质控参数的设定和标准是关键。
本文将介绍二代测序质控各参数的标准。
二、样本质量评估1.完整性：样本应保持完整，无断裂或降解。
可通过测定样本的分子量、片段长度分布等指标进行评估。
2.浓度：样本浓度应在合理范围内，过高或过低的浓度都可能导致测序质量下降。
3.特异性：样本应具有特异性，不应包含其他杂质序列。
可通过序列特异性指数（Sequence-SpecificityIndex）进行评估。
三、测序数据质量评估1.序列深度：测序深度是指测得的有效序列数量。
理想情况下，测序深度应覆盖目标区域的每个碱基。
2.覆盖度：覆盖度是指测序序列对目标区域的整体覆盖程度。
理想情况下，应具有广泛的覆盖度，以保证准确性和可信度。
3.质量值分布：测序质量值应在合理范围内，过低或过高的质量值都可能导致错误率升高。
4.碱基错配率：碱基错配率是指非特异性碱基的比例。
应尽可能降低错配率，以保证结果的准确性。
四、质量控制标准1.严格控制样本质量和浓度，确保样本具有特异性。
2.确保测序深度和覆盖度达到预期要求，同时关注质量值和错配率。
3.对数据进行多维度分析，包括序列长度、GC含量、突变位点等，以确保结果的全面性和准确性。
4.根据实验需求和样本特性，制定合适的质控参数标准，并定期评估和调整。
5.建立完善的质控流程和标准，确保实验数据的可靠性和可信度。
五、结论二代测序质控各参数标准的设定和评估是质量控制的关键环节。
通过严格控制样本质量和浓度、确保测序深度和覆盖度、关注质量值和错配率、多维度分析数据等措施，可以提高二代测序的准确性和可信度。
同时，建立完善的质控流程和标准，定期评估和调整质控参数，可以确保实验数据的可靠性和可信度，为后续研究提供有力支持。
【新知解读】二代测序核酸质控环节怎么做？看完就懂！核酸质控是NGS（Next Generation Sequencing）实验中必不可少的环节，精确的NGS实验结果也离不开合格的核酸质控。
核酸质控主要是评估核酸的浓度，完整性、纯度及片段大小。
核酸样本涉及的下游实验很多，质控不合格会影响实验结果的准确性，甚至得到错误的结论。
NGS实验中使用质量差，如降解程度高的核酸样本建库可能导致文库浓度低，文库复杂度低，甚至文库构建失败等；文库浓度定量不准确可能导致测序实际分配数据量不均，或簇密度波动甚至导致实验失败。
详情可参考往期内容【新知解读】测序失败风险排查——多的是你不知道的事现在市面上主流的核酸质控方法有紫外可见吸收光度法（UV-Vis）（如Nanodrop）、荧光染料法（如Qubit）、琼脂糖凝胶电泳法（如Gel-electrophoresis）、自动化电泳法（如2100 Bioanalyzer）、荧光定量PCR法（如qPCR）等。
如何挑选合适的核酸质控方法来保证NGS实验的顺利进展？相信是小伙伴们十分关注的问题。
不要担心！今天小石头带大家来回顾各种核酸质控方法的原理及应用。
常用的核酸质控方法01紫外可见吸收光度法生物有机分子中的芳香环，具有紫外吸收的特性。
核酸，蛋白质、多肽、芳香基团、苯酚以及碳氢化合物均可吸收紫外光。
核酸在260 nm波长处具有最高吸收峰，蛋白质在280 nm波长处具有最高吸收峰，碳水化合物在230 nm波长处具有最高吸收峰。
根据朗伯-比尔（Beer-Lambert）光吸收定律：当一束平行单色光垂直入射通过均匀、透明的吸光物质的稀溶液时，溶液对光的吸收程度（K）与溶液的浓度（c）及液层厚度（b）的乘积成正比。
即：A=Kbc，式中K为吸光系数；A为吸光度；b为溶液液层厚度（或称光程长度）；c为溶液浓度。
一般在260 nm下，1 μg/ml DNA溶液在1 cm光径比色皿中的吸光系数为0.020，1 μg/ml RNA溶液在1 cm光径比色皿中的吸光系数为0.022。
2020版：中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识（完整版）病原学诊断始终是感染性疾病诊断中最重要的环节。
传统的病原学诊断是临床医师根据患者的临床表现做出一系列鉴别诊断，然后针对这些进行检测，通常一项检测只能对应一种病原体，而宏基因组学第二代测序(metagenomics next generation sequencing,以下简称二代测序)技术检测能覆盖更广范围的病原体。
本专家共识就二代测序的临床应用范围、样本采集、分析解读和诊断效能等方面进行证据总结和意见推荐。
一、证据强度和证据质量的分级定义证据强度：A为强烈推荐；B为推荐，但其他替代方案也可接受；C为推荐强度低，寻求替代方案；D为从不推荐。
证据质量：Ⅰ为证据来自随机对照试验，Ⅱ为证据来自非随机对照试验，Ⅲ为证据仅来自专家意见。
二、二代测序的临床需求与应用范围(一)背景及概述推荐意见1：若怀疑细菌、真菌、DNA病毒、寄生虫、不典型病原体感染且需进行二代测序检测时，建议采用DNA检测；若怀疑RNA病毒感染时，则建议采用RNA检测(A，Ⅱ)。
推荐意见2：对于临床疑似感染的病重、病危或免疫抑制、免疫缺陷患者，建议在完善传统实验室及分子生物学检测的同时，采集疑似感染部位的标本进行二代测序(B，Ⅱ)。
二代测序检测能覆盖较大范围的病原体，病毒、细菌、真菌、寄生虫都能被同时检测，不论临床样本培养成功与否，只要含有可检测到的DNA 或RNA即可[1,2,3,4,5,6]。
从接收样本至完成数据分析，二代测序的周转时间根据测序技术、方法和生物信息学分析方法的不同而不同，已有报道为6 h至7 d不等(平均48 h)[7,8]。
二代测序在感染性疾病诊断领域中的优势在于其能检测到其他传统手段无法检测到的病原体。
因此，二代测序可能在应用于临床疑难杂症或免疫抑制患者时有更大意义。
另外，二代测序也被报道可用于"排除"检测，即检测阴性有助于排除感染性疾病的诊断，但前提条件是测序覆盖度足够高，能确保样本中存在的病原微生物被检测出来[1]。
《第二代测序技术的发展及应用》篇一一、引言随着人类对生命科学研究的不断深入，测序技术作为生物信息学研究的重要手段，已经逐渐成为生命科学研究领域的重要工具。
第二代测序技术作为当前应用最广泛的测序技术之一，其发展历程和应用领域不断拓展，为生命科学研究提供了强有力的支持。
本文将介绍第二代测序技术的发展历程、原理及特点，并探讨其在不同领域的应用及未来发展趋势。
二、第二代测序技术的发展历程及原理第二代测序技术，也称为高通量测序技术，其发展历程始于2005年。
当时，454测序技术的出现为第二代测序技术奠定了基础。
随后，Solexa（后被Illumina收购）和SOLiD等技术的相继问世，推动了第二代测序技术的快速发展。
这些技术的共同特点是能够同时对数百万个DNA分子进行测序，从而实现了高通量、低成本和高精度的测序目标。
第二代测序技术的原理主要基于大规模并行测序技术。
其基本流程包括DNA文库构建、桥式PCR扩增和碱基识别等步骤。
首先，将待测DNA分子随机打碎成小片段，并通过连接酶和引物等将其与特定的接头连接起来，形成DNA文库。
然后，通过桥式PCR扩增技术对DNA文库进行扩增，形成大量的单链DNA克隆簇。
最后，利用荧光标记的四种碱基和图像识别技术，实现对单个碱基的准确读取。
三、第二代测序技术的特点及应用领域第二代测序技术具有高通量、低成本和高精度的特点，为生命科学研究提供了有力的支持。
其主要应用领域包括：1. 基因组学研究：通过对不同物种的基因组进行测序，揭示其基因结构和功能，为基因编辑、疾病诊断和治疗等提供依据。
2. 转录组学研究：通过对特定组织或细胞在特定条件下的转录产物进行测序，分析其表达水平和调控机制，为疾病发生机制和药物研发提供线索。
3. 表观遗传学研究：通过对DNA甲基化、组蛋白修饰等表观遗传学标记进行测序，揭示基因表达调控的机制和规律。
4. 临床诊断与治疗：通过对患者基因组进行测序，实现疾病的早期诊断和个体化治疗。
在过去几年里，新一代DNA 测序技术平台在那些大型测序实验室中迅猛发展，各种新技术犹如雨后春笋般涌现。
之所以将它们称之为新一代测序技术（next-generation sequencing），是相对于传统Sanger 测序而言的。
Sanger 测序法一直以来因可靠、准确，可以产生长的读长而被广泛应用，但是它的致命缺陷是相当慢。
十三年，一个人类基因组，这显然不是理想的速度，我们需要更高通量的测序平台。
此时，新一代测序技术应运而生，它们利用大量并行处理的能力读取多个短DNA 片段，然后拼接成一幅完整的图画。
Sanger 测序大家都比较了解，是先将基因组DNA 片断化，然后克隆到质粒载体上，再转化大肠杆菌。
对于每个测序反应，挑出单克隆，并纯化质粒DNA。
每个循环测序反应产生以ddNTP 终止的，荧光标记的产物梯度，在测序仪的96 或384 毛细管中进行高分辨率的电泳分离。
当不同分子量的荧光标记片断通过检测器时，四通道发射光谱就构成了测序轨迹。
在新一代测序技术中，片断化的基因组DNA 两侧连上接头，随后运用不同的步骤来产生几百万个空间固定的PCR 克隆阵列（polony）。
每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。
之后进行引物杂交和酶延伸反应。
由于所有的克隆都是系在同一平面上，这些反应就能够大规模平行进行。
同样地，每个延伸所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行，来获取测序数据。
酶拷问和成像的持续反复构成了相邻的测序阅读片段。
Solexa 高通量测序原理--采用大规模并行合成测序法(SBS, Sequencing-By-Synthesis)和可逆性末端终结技术（Reversible Terminator Chemistry）--可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。
--具有高精确度、高通量、高灵敏度和低成本等突出优势--可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究----将接头连接到片段上，经PCR 扩增后制成Library 。
高通量测序技术——第二代测序技术高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。
自从2005年454 Life Sciences公司（2007年该公司被Roche 正式收购）推出了454 FLX焦磷酸测序平台（454 FLX pyrosequencing platform）以来，曾推出过3730xl DNA测序仪（3730xl DNA Analyzer）的Applied BioSystem（ABI）这家一直占据着测序市场最大份额的公司的领先地位就开始动摇了，因为他们的拳头产品毛细管阵列电泳测序仪系列（series capillary array electrophoresis sequencing machines）遇到了两个强有力的竞争对手，一个就是罗氏公司(Roche)的454 测序仪(Roch GS FLX sequencer)，，另一个就是2006年美国Illumina公司推出的Solexa基因组分析平台（Genome Analyzer platform），为此，2007年ABI公司推出了自主研发的SOLiD 测序仪(ABI SOLiD sequencer)。
这三个测序平台即为目前高通量测序平台的代表。
（见表一）这些平台共同的特点是极高的测序通量，相对于传统测序的96道毛细管测序，高通量测序一次实验可以读取40万到400万条序列。
读取长度根据平台不同从25bp到450bp，不同的测序平台在一次实验中，可以读取1G到14G不等的碱基数，这样庞大的测序能力是传统测序仪所不能比拟的。
尽管如此，在这项新的划时代的测序技术刚出现的时候，科学界对这项新技术却并不热衷。
附件1肿瘤相关突变基因检测试剂（高通量测序法）性能评价通用技术审查指导原则一、前言本指导原则旨在指导注册申请人对肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。
本指导原则是针对肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。
本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要详细阐明理由，并对其科学合理性进行验证，提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。
二、适用范围本指导原则所述肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价主要是指基于高通量测序（high-throughput sequencing）即下一代测序（next generation sequencing, NGS），又称为大规模平行测序（massively parallel sequencing, MPS），体外检测人体组织中肿瘤细胞中肿瘤相关基因变异。
用于检测体细胞突变的NGS正在广泛用于肿瘤诊疗相关的分子检测，包括对特定基因的DNA/RNA进行测序，以寻找与肿瘤临床诊疗相关的突变基因的改变。
肿瘤基因突变类型包括点突变、插入、缺失、基因重排、拷贝数异常等广义的基因突变。
基于NGS测序原理的IVD检测可能包括以下步骤：样本收集，处理和保存、DNA提取、DNA处理、文库制备、测序和碱基识别、序列比对/映射、变异识别和过滤、变异注释和解读以及检测报告的生成。
同时，某些产品还可能会包括软件部分，但上述相关步骤并不一定被全部包括，应根据产品的具体设计流程来进行判断。
临床分⼦病理实验室⼆代基因测序检测专家共识临床分⼦病理实验室⼆代基因测序检测专家共识临床分⼦病理实验室⼆代基因测序检测专家共识近年⼆代基因测序（next-generation sequencing，NGS）技术快速发展，其应⽤已进展⾄临床检测，如遗传疾病、实体肿瘤、⾎液肿瘤、感染性疾病、⼈类⽩细胞抗原分析及⾮侵袭性产前筛查等。
国内外有关学会已出台相关共识与指南以推动其在临床中的应⽤。
中华医学会病理学分会和中国抗癌协会肿瘤病理专委会前期组织病理、临床、⽣物信息等专家进⾏了充分讨论，拟在NGS的操作流程、数据处理、结果解读等⽅⾯作规范和建议，以规范NGS在分⼦病理领域的应⽤。
临床分⼦病理实验室NGS样本可采⽤甲醛固定⽯蜡包埋组织（formalin-fixedparaffin-embedded，FFPE）、新鲜组织、各种体液上清液、体液离⼼细胞块、⽯蜡包埋标本和⾎浆/⾎液标本等。
本共识特⾊是基于病理评估的组织样本（FFPE、新鲜）的规范。
测序分析范围基于⽬前临床需求，本共识着重在于⽬标区域测序（panel）分析的实践。
随着技术的更新和应⽤的成熟，本共识将持续更新以满⾜临床需求。
⼀、实验室总体要求NGS检测实验室的总体设计与要求应参考《分⼦病理诊断实验室建设指南（试⾏）》、《医疗机构临床基因扩增检验实验室⼯作导则》、《个体化医学检测质量保证指南》、《肿瘤个体化治疗检测技术指南》、《个体化医学检测实验室管理办法》、《测序技术的个体化医学检测应⽤技术指南（试⾏）》进⾏。
1.NGS检测⼈员的资质要求：NGS检测技术⼈员应具备临床病理学、分⼦⽣物学的相关专业⼤专以上学历，并经过NGS 技术的理论与技能培训合格。
数据分析⼈员应具有临床医学或分⼦⽣物学或遗传学知识背景并经⽣物信息学培训。
最终报告应由中级或硕⼠以上具有病理学背景、经培训合格的本单位执业医师或者授权签字⼈（医学博⼠学位或⾼级职称）审核。
2.NGS检测实验室的区域设置要求：原则上NGS实验室应当有以下分区：样本前处理区、试剂储存和准备区、样本制备区、⽂库制备区、杂交捕获区/多重PCR区域（第⼀扩增区）、⽂库扩增区（第⼆扩增区）、⽂库检测与质控区、测序区、数据存贮区。
二代测序dna样本纯度摘要：I.简介- 二代测序DNA样本纯度的意义II.测序前DNA样本的纯化- 样本类型- 纯化方法1.离心法2.凝胶电泳法3.PCR法III.测序过程中纯度的影响- 测序深度- 数据质量- 变异检测IV.提高纯度的策略- 优化实验流程- 选择适当的纯化方法- 质量控制V.总结- 纯度在二代测序中的重要性- 当前挑战与未来展望正文：二代测序(Next-Generation Sequencing, NGS)技术在基因组学、转录组学、表观遗传学等领域得到了广泛应用。
然而,样本DNA的纯度对于测序结果的准确性和可重复性至关重要。
本文将探讨二代测序DNA样本纯度的相关问题。
测序前DNA样本的纯化是保证样本质量的第一步。
样本类型包括血液、细胞、组织等,不同的样本类型需要采用不同的纯化方法。
常用的纯化方法包括离心法、凝胶电泳法和PCR法。
离心法可以快速分离细胞或组织中的DNA,但无法去除蛋白质和其他污染物。
凝胶电泳法可以对DNA进行定量和纯化,但需要比较专业的设备和技术。
PCR法可以在短时间内扩增DNA,但需要注意引物设计、PCR条件优化等问题。
在测序过程中,DNA样本的纯度对测序深度、数据质量和变异检测等方面都有影响。
如果DNA样本纯度不足,可能会导致测序深度不足、数据质量差、变异检测不准确等问题。
因此,在样本处理过程中需要尽可能提高DNA的纯度,以获得更准确和可靠的结果。
为了提高DNA样本的纯度,可以采取以下策略:优化实验流程,选择适当的纯化方法,进行严格的质量控制。
实验流程的优化包括样本采集、运输、储存等环节,这些环节需要注意防止DNA的降解、污染和突变。
选择适当的纯化方法需要根据样本类型和实验目的进行选择,尽可能去除蛋白质和其他污染物,同时保留DNA的质量和活性。
质量控制是保证样本质量的关键环节,包括对样本的检测、纯度的评估、测序数据的质量控制等。
综上所述,DNA样本纯度对于二代测序结果的准确性和可重复性至关重要。
测序试剂质量标准一、试剂纯度测序试剂的纯度应不低于95%，其中不应含有杂质或污染物。
试剂的纯度将直接影响测序实验的准确性、可靠性和稳定性。
因此，在选择和使用测序试剂时，必须注意检查其纯度。
二、试剂活性测序试剂的活性是保证测序实验成功的重要因素。
活性不稳定的试剂会影响反应速率和产物稳定性。
因此，在选择和使用测序试剂时，应确保其活性稳定，并按照说明书正确保存和使用。
三、试剂稳定性测序试剂的稳定性对其在测序实验中的表现有很大影响。
不稳定的试剂会影响实验结果的可靠性和重复性。
因此，在选择和使用测序试剂时，应关注其稳定性，并按照说明书正确保存和使用。
四、交叉污染测序试剂的交叉污染会导致实验结果不准确或出现误差。
为了避免交叉污染，需要采取一系列措施，如使用一次性手套、器具，避免直接接触试剂等。
此外，应按照说明书正确配制和使用试剂，避免因操作不当导致交叉污染。
五、重复性测序试剂的重复性是指在不同实验条件下，使用相同试剂得到相同或类似结果的概率。
重复性好的试剂可以提高实验的可信度和可靠性。
因此，在选择和使用测序试剂时，应关注其重复性表现。
六、检测范围测序试剂的检测范围是指其能够检测的样本类型和浓度范围。
不同试剂的检测范围可能有所不同，因此在选择和使用测序试剂时，需要根据实际需求选择合适的试剂，并按照说明书正确使用。
七、特异性测序试剂的特异性是指其对目标序列的识别能力。
具有高特异性的试剂可以更准确地检测目标序列，减少误判和干扰。
因此，在选择和使用测序试剂时，需要关注其特异性表现。
八、试剂残留测序试剂的残留可能会对后续实验产生影响，特别是当实验需要重复使用同一批试剂时。
为了减少试剂残留的影响，需要采取一系列措施，如使用一次性器具、按照说明书正确配制和使用试剂等。
此外，还需要对使用过的试剂进行正确的废弃处理。
九、生物安全性测序试剂的生物安全性是指其对环境和实验者的潜在风险。
不安全的试剂可能会对环境和实验者的健康造成威胁。
第二代测序技术检测试剂质量评价通用技术指导原则一、前言本指导原则主要针对第二代测序（next generation sequencing，NGS）技术检测试剂（以下简称“NGS检测试剂”）产品质量提出指导性要求，涉及基本原则、主要原材料、检测流程及性能评价等方面。
本指导原则是对企业和检验人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。
应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制订的，随着法规和标准的不断完善、科学技术的不断发展，其相关内容也将进行适时的调整。
二、适用范围本指导原则适用于基于NGS技术的检测试剂的质量评价。
NGS 检测试剂的预期用途包括但不限于以下内容：肿瘤相关基因异常、遗传疾病相关基因异常、胚胎植入前染色体非整倍体、胎儿染色体非整倍体及病原微生物等临床检测应用。
此类检测试剂涉及的NGS技术包括靶向性测序和非靶向性测序：靶向性测序法是指对样本中的基因组进行部分测序，如靶基因测序、外显子（组）测序等；非靶向性测序是指对样本中潜在生物体的基因组进行测序。
原则上不建议企业应用全基因组测序进行检测，如果企业应用全基因组测序技术，应进行充分的技术适用性验证并提交报告。
待测样本可以是人源样本（如体液、组织、排泄物等）或病原微生物分离培养物（如血培养物、痰培养物等），检测对象可以是脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）或两者的混合物。
本指导原则尽可能覆盖所有的NGS技术原理和测序平台，所讨论和描述的内容不限于某个特定的NGS检测试剂。
但鉴于NGS技术一直在不断升级和更新，可能会有本指导原则未能涉及的新技术。
三、基本要求（一）基本原则1.N GS检测试剂的生产企业应获得《医疗器械生产许可证》。
研制、生产用的各种原料、辅料等应制定其相应的质量标准，并应符合有关法规的要求。
CLIA/CAP 二代测序临床检测标准操作指南2015-04-23自由度精准医疗本临床二代测序操作指南来自于Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) of 1988/College of American Pathologists (CAP) laboratory。
释义：Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) of 1988：美国临床实验室改进修正法规’88 。
这个法规里面有关于医学检验项目的一些质量规范，中国的临床行业很多项目的指标都参考过 CLIA’88 中的内容。
College of American Pathologists (CAP) laboratory：美国病理学家协会。
相较于Sanger测序，二代测序技术（新一代测序技术，NGS）拥有高通量和低单碱基成本的特点，这使其在临床检测领域拥有得天独厚的优势。
过去的数年间，相当数量的NGS服务商迅速成长，而美国病理学家协会却没有及时依照美国临床实验室改进修正法规（CLIA）编制指南来规范这个检测。
基于NGS平台的临床检测是一种新的检测方式，相较于原有检测方法，其复杂程度大大提高，因此迫切需要一个规范标准来指导各实验室进行检测。
CAP于2011年成立了NGS工作部门，商讨NGS临床检测实验检查表的内容。
本次CAP列出共计18条实验室要求的检查表，包含检测的二代测序实验过程和生物信息学分析过程。
二代测序技术（NGS）包含两个部分：实验操作部分（wet bench）和生物信息分析部分（dry bench）。
实验操作部分包括以下部分或所有的流程：病例样本的采集处理、核酸提取、片段化、生物分子标签（barcode）、目标区段/基因捕获富集、连接、扩增、文库构建、上机测序、数据产出。
生物信息分析部分主要依赖于高性能的计算机和不同的生物信息分析方法，主要流程包括：参考序列比对、组装、变异检测、注释、临床解释（依赖于是否运用诊断工具）。
第二代测序技术检测试剂质量评价通用技术指导原则一、前言本指导原则主要针对第二代测序（n ext gen eration seque ncing NGS）技术检测试剂（以下简称“ NGS检测试剂”产品质量提出指导性要求，涉及基本原则、主要原材料、检测流程及性能评价等方面。
本指导原则是对企业和检验人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。
应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制订的，随着法规和标准的不断完善、科学技术的不断发展，其相关内容也将进行适时的调整。
二、适用范围本指导原则适用于基于NGS 技术的检测试剂的质量评价。
NGS 检测试剂的预期用途包括但不限于以下内容：肿瘤相关基因异常、遗传疾病相关基因异常、胚胎植入前染色体非整倍体、胎儿染色体非整倍体及病原微生物等临床检测应用。
此类检测试剂涉及的NGS 技术包括靶向性测序和非靶向性测序：靶向性测序法是指对样本中的基因组进行部分测序，如靶基因测序、外显子（组）测序等；非靶向性测序是指对样本中潜在生物体的基因组进行测序。
原则上不建议企业应用全基因组测序进行检测，如果企业应用全基因组测序技术，应进行充分的技术适用性验证并提交报告。
待测样本可以是人源样本（如体液、组织、排泄物等）或病原微生物分离培养物（如血培养物、痰培养物等），检测对象可以是脱氧核糖核酸（DNA ）、核糖核酸（RNA ）或两者的混合物。
本指导原则尽可能覆盖所有的NGS 技术原理和测序平台，所讨论和描述的内容不限于某个特定的NGS检测试剂。
但鉴于NGS技术一直在不断升级和更新，可能会有本指导原则未能涉及的新技术。
三、基本要求（一）基本原则1.NGS 检测试剂的生产企业应获得《医疗器械生产许可证》。
研制、生产用的各种原料、辅料等应制定其相应的质量标准，并应符合有关法规的要求。
2.试剂生产企业生产质量管理体系应符合《医疗器械生产质量管理规范》及《医疗器械生产质量管理规范附录体外诊断试剂》的要求，并应通过《医疗器械生产质量管理规范体外诊断试剂现场检查指导原则》的核查。
3.试剂生产企业应具有与其技术要求相适应的人员、厂房、设施和仪器设备以及适宜的生产环境。
建立专用实验室，实验室应当严格分区，人员和物品应当单向流动，以最大限度地防止实验过程中样本之间的污染和避免扩增产物的污染。
生产用于病原微生物核酸检测的生产企业应建立符合生物安全要求的设施和措施。
（二）主要原材料NGS 检测试剂的主要原材料包括实验原材料和数据分析原材料。
实验原材料包括引物、探针、酶、参考品或标准品等，企业应提供尽量完整的研究资料，如选择与来源、制备过程、质量分析和质量标准等；数据分析原材料包括数据库（参考序列）、生物信息学分析软件及数据储存中心等。
数据分析原材料能影响检测结果，企业应提供尽量完整的研究资料，如数据库（参考序列）的溯源性、生物信息学分析软件的算法以及数据储存中心的安全性与稳定性等。
对于实验原材料，若企业自己生产，其生产工艺必须相对稳定；若来自市场（从其他单位购买），应提供的资料包括：对供应商审核的相关资料、购买合同、供货方提供的质量标准、出厂检定报告，以及该原材料到货后的质量检验资料。
原材料或其供应商发生变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请，并重新对产品进行性能验证。
对于数据分析原材料，若企业自己提供，应具有完整的生物信息学分析软、硬件能力，制定相应的开发、维护及升级等方案；若来自市场（购买服务或产品），应提供相应的验证资料及后续的维护、升级等方案资料。
如材料发生变更，应重新对产品进行性能验证，并依据国家相关法规的要求进行变更申请。
建议企业提供的详细资料包括但不限于以下内容：1.核酸提取、分离及纯化组分的主要组成、原理介绍及相关的验证资料，需覆盖产品检测涉及的各样本类型。
2.测序文库构建组分的主要组成、原理介绍及相关的验证资料构建测序文库的主要原料（脱氧三磷酸核苷、接头序列、连接酶、聚合酶、逆转录酶、限制性内切酶、引物、探针、接头及其他主要原料）的选择、制备、质量标准及研究资料。
如以上原材料来自市场，企业可提供供应商出具的质检报告。
如供应商提供的原材料为混合体系，可提供针对混合体系的质检报告。
1.1脱氧三磷酸核苷（dNTP）核酸的组成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP;建议提交对纯度、浓度及保存稳定性等的验证资料。
1.2引物、探针及接头引物、探针及接头均是由一定数量的dNTP 构成的特定序列。
探针带有特定的标记物，能与互补核酸序列退火杂交，用于特定核酸序列的探测和捕获。
接头包括条码（barcode）或标签（index）,用于将待测核酸与测序载体连接、区分不同来源的样本等。
建议企业提交序列选择、制备方法、质量标准，以及对分子量、纯度、保存稳定性、功能性实验等的验证资料。
如果为外购，需提供合成机构出具的合成产物的质检证明。
1.3连接酶、聚合酶、逆转录酶及限制性内切酶连接酶、聚合酶、逆转录酶及限制性内切酶应具有相应的酶活性。
建议提交酶活性、热稳定性及工作效率等验证资料。
3.参考品或标准品原料选择、制备、定值过程、稳定性研究及性能验证等资料。
4•核酸类检测试剂的包装材料和耗材应无脱氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染，建议提交相应检测报告。
5.数据库（参考序列）数据库（参考序列）用于NGS 检测试剂的生物信息学分析，辅助测序比对拼接和测序结果确认。
建议企业提交数据库（参考序列）的溯源信息、数据库类型（本地数据库、在线数据库）、完整性、实时性、维护以及升级方案等资料。
6.生物信息学分析软件用于对原始测序结果进行分析并报告最终检测结果。
建议企业提交分析软件的版本、算法、性能验证以及升级方案等资料。
7.数据存储中心用于储存原始和经过分析后的检测结果，可以是本地或云储存中心。
建议企业提交数据存储中心的安全性、稳定性、维护与升级方案以及异常情况处置方案等资料。
（三）检测流程NGS 检测试剂的检测流程可以分为样本收集、样本制备、测序、生物信息学分析及报告和数据库管理等五个环节。
企业在设计开发过程中应充分考虑每个环节的质量控制，并进行验证。
1.样本收集样本可以为人体样本（如体液、组织、排泄物等）或病原微生物分离培养物（如血培养物、痰培养物等）。
样本的获取及预处理方式、保存条件及期限（短期、长期）、运输条件等若有通用的技术规范或指南，则应遵循，并引用；若没有通用的技术规范或指南，则企业应该设立自己内部的标准操作流程，以保证样本的质量，并且防止样本间的混淆与交叉污染。
不同类型的样本所抽提的核酸的质量可能有所差异，对于每一种类型的样本，应当明确检测所需样本的用量。
如样本不符合要求，应重新取样。
企业需明确标识出以下内容，包括产品适用的样本类型、采集时间、采集部位、采集方式、采集量及保存和运输条件等内容。
样本的采集时间的选择需考虑是否受临床症状、用药情况等因素的影响；采集部位应考虑样本的代表性、操作的难易程度及安全性等因素；采集方式应详述具体的操作方法或列出相关操作指南文件以指导使用者（含图示）；企业根据产品预期用途，设计具体的采集量标准，企业应明确采集量判断标准及方法；保存和运输条件应保护样本中的核酸，企业应明确样本的保存条件（温度、湿度等）及期限（短期、长期）、运输条件（温度、湿度等）及反复冻融限制等。
2.样本制备2.1核酸提取、分离及纯化样本中核酸的提取、分离及纯化的主要目的是为了富集核酸浓度并保证核酸序列的完整性。
企业应在NGS 检测试剂的设计开发过程中对配套使用的核酸提取、分离及纯化试剂进行匹配性验证，以确保其性能满足检验的需要。
企业应明确检测所需核酸的最小用量。
企业应该设立核酸抽提及抽提后质量控制的书面标准操作流程，并依据性能验证结果在此给出用于扩增试验的核酸溶液浓度范围要求，以保证核酸样本的质量与浓度符合要求，并且防止样本间的混淆与交叉污染。
企业应当对抽提的每一次核酸样本的各种质控参数有详细的记录，建议包括但不限于核酸体积、质量、浓度、纯度及完整性等。
核酸浓度、纯度检测方法包括但不限于分光光度法、荧光法等；核酸完整性检测方法包括但不限于琼脂糖凝胶法、实时荧光定量PCR 法等。
如果提取、分离及纯化的核酸样本质量不符合要求，应重新取样或扩大样本量再进行核酸分离/纯化。
2.2靶向序列富集及测序文库构建靶向序列富集是指靶向性扩增一定大小的核酸片段，企业应对富集原理及方法进行详细描述。
企业应制定标准操作流程及质量控制方案，记录包括靶向序列片段的浓度、纯度及大小等参数。
企业根据具体的测序平台的性能特点，对核酸序列进行片段化处理，片段的长短应符合后续测序的要求，片段化方法包括但不限于超声法、酶切法等。
企业应制定核酸序列片段化操作流程及质量控制方案，对经过片段化的核酸短序列的浓度、纯度及大小等参数进行检测并详细记录。
2.3添加接头（条码或标签）测序文库中的短核酸片段需要与测序载体连接后才能进行测序反应，这一连接过程需要先给短核酸片段添加接头。
NGS 技术可以实现将多个来源不同的样本混合后在一个测序反应中同步检测，为了区分这些样本，通常采用在每一个原始样本的测序文库中加上唯一的寡核苷酸标签的方法进行标记，这些寡核苷酸标签被称为条码或标签。
条码和标签可以包含于接头序列内，也可以独立于接头序列。
添加接头可以是独立的步骤，也可以在靶向序列富集过程添加。
企业使用条码或标签时，需充分验证并满足测序所需的质量要求，如测序深度、覆盖度等条件。
同时，企业应对潜在的问题进行充分研究，包括但不限于：条码检出率的均匀性、条码互换比率以及条码间相互污染或干扰等因素。
企业应报告有效的条码或标签数量，并对每个条码或标签的序列及其位置有详细、清晰的记录。
1.测序1.1测序平台目前商业上常用的第二代测序平台根据测序原理可分为光学技术（Illumina 公司、华大基因公司为代表）和半导体技术（Thermo 公司为代表）。
每个测序平台都有各自的特异性参数，包括仪器大小、通量、读长、运行时间及测序成本等，企业应结合具体的临床应用需求选择合适的测序平台。
1.2测序及碱基读取企业应根据所选用的测序平台，选择合适的参数指标对测序质量进行监控，制定相应的管理制度及质量标准，并明确失控情况下的纠正措施。
企业应根据具体应用情况，如测序区域的大小及序列特征等因素确定测序所需要的覆盖度及深度。
在测序过程中，企业应建立标准操作流程及质量控制方案监控整个测序过程当中的测序质量。
企业应根据具体的预期用途，制定产品的测序覆盖度和深度，并提供充分的理论依据及验证结果。
