第六章多克隆抗体传统的抗体制备方法是将一种天然抗原经不同途径免疫动物，由于抗原性物质具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物，所以称这种免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体(polyclonal antibody，PcAb)。
多克隆抗体的亲和力较一般单克隆抗体高。
多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为制备高效价和高特异性的多克隆抗体，必须要有理想的免疫原、适宜的动物及切实可行的免疫方法。
本章主要介绍多克隆抗体的制备及相关技术。
第一节动物选择实验动物是生物医学中的重要组成部分。
目前常用于生物医学科学研究的实验动物种类很多，主要包括有两栖纲的青蛙、蟾蜍，鸟纲的鸡、鸭、鸽等，哺乳纲啮齿目的小鼠、大鼠、豚鼠等，兔形目的家兔，食肉目的猫、狗，有蹄目的羊、猪和灵长目的恒河猴、猩猩、绒猴等。
其中最常用和用量最大的是哺乳纲啮齿目动物，其次是兔形目和食肉目等。
一、实验动物的生物学特性实验动物选择得当与否是实验研究成败关键之一。
掌握实验动物的生物学特性，则能以最佳的设计选择实验动物，进行科学实验，从而获得预期的实验结果。
1. 小鼠小鼠是啮齿目中体型较小的动物。
新生小鼠1.5g左右，21天断乳时12～15g，1.5至2月龄体重达20g以上，可供实验使用。
成年雌小鼠体重18~35g，成年雄鼠体重20~40g。
小鼠性情温顺，易于捕捉，对外来刺激敏感，喜群居于阴暗环境。
2．兔草食性动物，性情温顺，胆小易惊，喜居安静、清洁、干燥、凉爽、空气新鲜的环境，耐冷不耐热，耐于不耐湿。
兔耳大，表面分布有清晰的血管。
有特殊的血清型和唾液型，血清型分为α'、β'、α'β'和O型四种。
α'、α'β'型易产生人A型抗体，β'、O型易产生人B型抗体。
唾液型分两种：排出型与非排出型。
排出型易获得人血细胞A型物质，非排出型不易获得，这种A型物质与A型抗体产生能力有关。
因此，要获得A型抗体，应选用排出型的α'、α'β'血清型兔。
由于抗原刺激机体后，体液免疫应答反应强烈，故兔被广泛用于制备高效价的特异性强的免疫血清。
3．豚鼠草食动物，性情温顺，胆小，对外界刺激极为敏感，喜居干燥、清洁的环境。
自动调节体温的能力较差，对环境温度变化较为敏感，最适宜的温度为18~20℃，对抗生素敏感。
4．羊草食动物，性情温顺，合群，易于接近，喜居干燥、清洁的环境，怕潮湿，怕热不怕冷，寿命为15年。
山羊可用于生产多种抗血清，也可用于营养学、免疫学、微生物学、生理学等方面的研究。
绵羊常用作制备抗血清，其红细胞是血液学诊断中最常用的材料。
二、选择实验动物的原则1．3R原则3R指的是reduction(减少)、replacement(替代)和refinement(优化)。
“减少”指减少实验用的动物和实验的次数；“替代”指尽可能采用可以替换实验动物的替代物；“优化”指对待实验动物和动物实验工作应做到尽善尽美。
2．从微生物学和寄生虫学标准去选择实验动物要求选用三级的实验动物，原因是三级实验动物已经排除了人兽共患疾病，排除了实验动物本身的传染病，也排除了影响实验研究的相应微生物和寄生虫，使实验研究处于没有或很少有外源干扰的情况下进行。
3．从遗传学的观点选择实验动物即根据动物的不同生物学特性选择适宜的实验动物。
4．不能忽略的一些因素如性别、年龄、体重、营养状况、饲养环境等。
三、免疫动物的选择可作为免疫用的动物主要是哺乳类和禽类，常选用的有家兔、绵羊、豚鼠、马、鸡等。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗体的数量和用途，如制备抗γ-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清。
具体选择时，应考虑以下因素：(一)动物种系免疫学理论研究已经证实：机体的免疫应答受遗传基因的控制。
同一种系不同个体对不同抗原的免疫应答以及不同种系对同一抗原的免疫应答均不尽相同。
一般认为，抗原与免疫动物种属的差异越远越好，亲缘关系太近不易产生抗体应答(如兔一大鼠之间，鸡-鸭之间)。
实验中最常用的动物是家兔，因它与人类的交叉较少。
(二)动物个体的选择由于个体差异的存在，同一抗原免疫同一种系不同个体的动物，产生的抗体效价有很大的差异，这与动物的年龄及营养状况密切相关。
用于免疫的动物应适龄、健壮、无感染性疾患，体重合乎要求，如用家兔，应选择年龄在6个月以上，体重以2-3kg为宜。
(三)抗血清的需要量需要大量制备免疫血清时，应选用马、驴、绵羊等大型动物，如一头成年马反复采血可获得10 000ml 以上的抗血清。
若需要量不多，则可选用豚鼠、家兔等小动物。
(四)抗原性质不同种类的动物对同一种抗原有不同的免疫应答表现。
因此，对不同性质的免疫原，所选用的动物有所不同。
蛋白质类抗原对大部分动物皆适合，常选用家兔和山羊。
但在某些动物体内有类似的物质或其他原因，对这些动物免疫原性极差，如IgE对绵羊，胰岛素对家兔，多种酶类(如胃蛋白酶原等)对山羊等，免疫时皆不易出现抗体，这些物质有时可用豚鼠(如胰岛素等)、火鸡，甚至猪、狗、猫等做试验免疫。
(五)免疫血清的要求按免疫动物的种类不同，所获免疫血清可分为两大类，即R型(rabbit)和H型(horse)。
R型是用兔及其他动物免疫产生的抗体，H型是用马以蛋白质类抗原免疫获取的抗体。
在免疫扩散实验中，R型免疫血清能和很小量的抗原结合，形成肉眼可见的沉淀线，具有较宽的抗原抗体合适比例范围，只有抗原过量时才形成可溶性复合物，使沉淀线减弱或消失。
而H型免疫血清的抗原抗体适合反应的比例范围较狭窄，抗原或抗体过量时易形成可溶性复合物，均不出现可见的沉淀反应，在沉淀反应中难以掌握，因而极少应用，人和许多大型动物皆属此型。
此外，动物免疫后还要认真做好编号、标记、管理和记录，注意动物的体温、体重、呼吸、粪便是否正常，注射部位的变化及是否有其他异常表现等。
第二节抗原的剂量与免疫途径抗原初次进入具有应答能力的动物体内需经过一段较长的潜伏期(一般为7～10天)才能出现抗体，经过一段高峰期后，抗体量逐渐下降直至消失，这段时间总的抗体生成量是较低的，主要成分为IgM，称为机体对抗原的“初次应答”。
但当相同抗原再次进入同一动物体内时，血清中的抗体很快出现，并迅速到达高峰期，持续较长时间后才逐渐下降。
这一次抗体的含量远高于初次应答，其成分主要是高亲和力的IgG，称为“再次应答”。
由此可知，要获得高效价的抗血清，不仅与免疫剂量有关，而且免疫方法、接种途径和免疫的间隔时间等均至关重要。
一、抗原剂量抗原剂量的选择应考虑抗原性强弱、分子质量大小、注射途径、免疫时间及动物的个体状态等因素。
抗原剂量过低不能形成足够强的免疫刺激，剂量过高，又有可能造成免疫麻痹。
在一定范围内，抗原量与免疫反应强度成正相关。
一般而言，对于蛋白质抗原，小鼠首次剂量为50~400μg／次，大鼠为0.1～1mg ／次，兔为0.2～1mg／次；对于细胞抗原，每次用于免疫羊的细胞数一般不低于1×108，免疫兔不低于1×107，免疫小鼠不低于1×106。
第一次免疫剂量宜小，随后可增大抗原剂量。
加强注射剂量，依据抗原的性质不同而不同。
有的抗原用量与首次剂量相同或增加一倍，有的则减少一半。
加强免疫通常用不完全佐剂乳化。
如果抗原的免疫原性弱，需多次加强才能获得满意的抗血清。
为了增强免疫反应，可以把免疫佐剂注射到接种抗原结合部位的附近或对侧，或者先注射佐剂，再注射抗原。
如用可溶性蛋白质抗原免疫家兔，在加用佐剂后一次注入量一般为0.5~1mg／kg。
如不加佐剂，则抗原剂量应加大10～20倍。
用半抗原免疫时，使用的载体必须始终相同，以免影响淋巴细胞的识别功能。
下面是几种成功的免疫方案。
1．家兔初次免疫用50～200μg蛋白加入福氏完全佐剂，在背部皮下注射6～8点，每点0.1～0.2ml，也可肌内或皮内注射。
每隔10天用50～200μg蛋白于PBS或福氏不完全佐剂中，在肌内、皮下、静脉或腹腔内注射加强免疫一次，每点0.25～2ml。
2．豚鼠和大鼠初次免疫用10～100μg蛋白加入福氏完全佐剂，在背部皮内注射4~6点，每点0.1ml，也可肌内或皮下注射，每隔7~8天用10~50μg蛋白于PBS或福氏不完全佐剂中，在肌内、皮下或静脉注射，加强免疫一次，每点0.25～2ml。
3．小鼠与大鼠一样，但每次免疫量用5~50μg蛋白。
4．绵羊或山羊初次免疫用0.5~10mg蛋白加入福氏完全佐剂，在肌内、皮下或皮内注射4~6点，每点0.2～2ml。
14～28天后用0.5~10mg蛋白于PBS或福氏不完全佐剂中，在肌内、皮下或静脉注射，加强免疫一次，每点0.25～2ml。
有时可用较少量的抗原，特别是在免疫间隔较长的情况下。
二、免疫途径抗原的进入途径决定了抗原吸收、分布和代谢的速度，吸收越快，分解代谢越快，对机体的影响时间越短。
吸收越快，单位时间内的有效抗原量就越大，机体的免疫应答就越强，不良反应也越强。
应根据不同抗原及实验要求选择不同的注射途径。
注射途径多种多样，常用的注射途径有皮内、皮下、肌内、静脉、腹腔、脾脏、淋巴结。
对抗原的吸收速度为：静脉=脾脏=淋巴结>腹腔>肌内>皮下>皮内。
途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
免疫时一般采用多点注射，如足掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。
皮内易引起细胞免疫反应，对提高抗体的产生很有利。
通常认为半抗原适宜采用皮肤多点注射(一般注射40点左右)。
但皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入(因佐剂加入后黏度较大)。
静脉或腹腔注射后抗原能很快进入血流，一般多用于颗粒性抗原的免疫和加强注射，如抗原昂贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10～100μg抗原即可获得较好的免疫效果。
方法是先用不完全佐剂在动物足部做基础免疫，10~15天后可见肘窝处有肿大的淋巴结(有时可在腹股沟处触及)，用两手指固定好淋巴结，消毒后用微量注射器直接注射人抗原(一般不需要佐剂)。
三、间隔时间免疫间隔时间也是重要因素之一。
第一次免疫后，因动物机体正处于识别抗原和B细胞增殖阶段，如很快接着第二次注入抗原，极易造成免疫抑制。
一般以间隔10～20天为好。
两次以后每次的间隔一般为7～10天，不能太长，以防刺激变弱，产生的抗体效价不高。
对于半抗原的免疫间隔则要求较长，有的报告1个月，有的长达40～50天，这是因为半抗原是小分子，难以刺激机体发生免疫反应之故。
免疫的总次数多，多为5~8次。
如为蛋白质抗原，第8次免疫未获得抗体，可在30～50天后再追加免疫一次；如仍不能产生抗体，则应更换动物。
