乙酰胆碱酯酶活性测定

K 0K t 吸光度A实验二乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药目前有机磷、氨基甲酸酯类农药是我国大量使用的杀虫剂，虽然这类农药与过去使用的有机氯农药相比，降解速度较快，但在果蔬中的残留仍然较为严重。

由于该类农药能抑制人体内乙酰胆碱酯酶的生理活性，神经传导因此受阻，引起神经麻痹乃至死亡，对人类健康造成极大危害。

对于果蔬中的农药通常采用气相色谱等方法进行分析，但分析时间长，操作步骤烦琐，适用于实验室分析。

长期以来在大部分果蔬市场中，通常采用乙酰胆碱酯酶抑制法进行快速检测，即以乙酰胆碱酯酶作为检测试剂，采用农药残留检测仪，根据乙酰胆碱酯酶活性变化的程度来测定果蔬样品中的残留农药。

一、 实验目的1． 了解果蔬中残留农药的分析方法；2． 掌握酶抑制分析方法的原理及操作方法； 3． 理解农药残留性评价的意义。

二、 实验原理有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶的活性，造成神经传导介质乙酰胆碱的积累，影响正常传导，使昆虫中毒致死，酶抑制法就是根据这一昆虫毒理学原理，对农药残留进行检测。

以乙酰胆碱为底物，在乙酰胆碱酯酶（ACHE ）的作用下，乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，胆碱和二硫双对硝基苯甲酸（DNTB ）产生显色反应，使反应液呈黄色（于410nm 处有最大吸收峰）。

根据酶促反应动力学原理，在没有有机磷和氨基甲酸酯类农药存在时，底物在酶的催化作用下发生水解，反应速率可以用吸光度值随时间的变化率K 0来表示。

当有机磷和氨基甲酸酯类农药加入到酶的显色体系中时，农药抑制了酶的活性，影响显色体系的反应速度，此时体系吸光度随时间的变化率为K t ，则有机磷和氨基甲酸酯类农药对酶的活性的抑制率Y 的计算公式如下：%10000⨯-=K K K Y tK 0：空白样品的吸光度随时间变化曲线的斜率值K t ：样品溶液的吸光度随时间变化曲线的斜率值其中K 0和K t 都可通过以下过程进行推导和计算。

酶动力学实验报告酶动力学实验是一项旨在研究酶的活性与反应速率之间关系的实验。

本次实验旨在通过测定不同底物浓度对酶反应速率的影响，进一步了解酶的催化作用和动力学特性。

实验采用乙酰胆碱酯酶（AChE）为模型酶，选择丙酮胆碱作为底物。

1. 实验目的本实验旨在探究酶动力学的基本原理，并通过测定不同底物浓度对酶反应速率的影响，建立酶底物反应速率的动力学方程。

2. 实验原理乙酰胆碱酯酶（AChE）是一种具有催化分解乙酰胆碱能力的酶。

实验中，我们将通过测定乙酰胆碱被AChE分解产生的胆碱的量，来间接测定酶反应速率。

3. 实验步骤3.1 制备实验溶液依次向一组试管中加入0.5 ml pH 7.4磷酸盐缓冲液、0.1 ml AChE溶液、0.1 ml不同浓度的丙酮胆碱底物溶液，并用蒸馏水稀释至1 ml。

3.2 酶反应体系的建立将制备好的试管放入恒温水浴中，并将温度维持在37°C恒温条件下。

在反应开始前，将所有试管放在水浴中预热5分钟，确保反应体系温度均匀。

3.3 反应开始在预热后的试管中，迅速注射0.1 ml乙酰胆碱底物溶液，并用计时器计时，开始测量反应时间。

3.4 反应停止在不同反应时间点，取出等体积试管放入冷水中，停止酶反应。

不同试管的停止时间需控制在一定时间范围内。

3.5 测定胆碱产量将反应停止后的试管转移至离心机中，以10000 r/min的速度离心5分钟，离心后取出上清液，用比色皿测定胆碱的含量。

4. 数据处理与分析4.1 曲线拟合根据测得的胆碱产量数据，绘制初始速率随底物浓度变化的曲线。

采用非线性拟合方法，拟合酶底物反应速率的动力学方程。

4.2 动力学方程分析拟合出的动力学方程，推导出酶底物反应速率的相关参数，如最大速率（Vmax）和底物浓度为一半时的速率（V0.5）等。

4.3 酶动力学分析通过分析动力学参数，了解酶的催化活性和抑制效果等信息，进一步研究酶的机制和性能。

5. 结果与讨论根据实验数据，绘制了初始速率与底物浓度的曲线。

实习三有机磷经皮染毒对全血胆碱酯酶活性的影响（一）目的和意义1、学习经皮染毒技术，掌握急性经皮毒性试验的方法。

2、观察有机磷经皮肤吸收后对机体的急性毒性作用。

3、掌握全血胆碱酯酶活性的测定方法及原理。

（二）仪器1．解剖剪刀、弯剪、镊子、灌胃针。

2．恒温水箱(37±0.5℃)。

3．离心机。

4．分光光度计，10mm比色皿。

5．血红蛋白吸管（20μl）；刻度吸管（5.0ml，2.0ml，1.0ml）；离心管（10ml）；容量瓶（10ml，100ml）；试管（10ml）、烧杯等。

（三）试剂1．受试物：有机磷（由指导教师自定）；溶剂，根据受试物的理化性质选定。

2．磷酸盐缓冲液(1/15m mol/L，pH7.40)：称取9.07g无水磷酸二氢钾(KH2PO4)，用水溶解并稀释至1000mL(甲液)；称取23.87g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，用水溶解并稀释至1000mL(乙液)。

取甲液19.2mL与乙液80.8mL混合即得。

3．生理盐水：氯化钠8.5g/L。

4．硫代乙酰胆碱(ASCh)：称取72.3mg ASCh(生物试剂)溶于生理盐水中，并稀释到10mL；置冰箱中保存，临用时以生理盐水稀释10倍。

5．5，5′－联硫代－双－2－硝基苯甲酸(DTNB)溶液：称取19.8mg DTNB，滴加磷酸盐缓冲液(4.2)，搅拌，直至完全溶解，溶液透明(大约加2mL)，再用生理盐水(4.3)稀释至10mL，置冰箱中保存，临用时以生理盐水稀释10倍。

出现黄色即弃用。

6．抑制剂毒扁豆碱：取1mg左右柳酸毒扁豆碱，溶于0.5mL生理盐水(4.3)，临用时配制，严防污染其他试剂及器材。

7．1m mol/L谷胱甘肽标准溶液：精确称取3.07mg还原型谷胱甘肽用水溶解，移入10mL容量瓶中，稀释至刻度。

此液1mL相当于1μmol谷胱甘肽。

因其易被氧化，应于用时配制，水必须先经煮沸去氧冷却后使用。

（四）实验步骤1．实验动物的选择实验动物可选择健康豚鼠或家兔，也可用大鼠。

乙酰胆碱酯酶酶活的测试作者：陈志坚1 准备工作0.1mol/L pH=8.0的磷酸缓冲液：NaH2PO4 1.68g，Na2HPO4 12.21g溶于1L水。

2 酶液制备SD大鼠，断头处理后，冰台快速取大脑，放入玻璃皿中，玻璃皿加入少量冰冻的磷酸盐缓冲液( 磷酸盐缓冲液漂洗，用干净的滤纸吸去大脑组织表面的水分和血液，称质量) ，用眼科剪尽快剪碎组织块。

将剪碎的组织倒入玻璃匀浆器中，再用少许冰冻磷酸盐缓冲液冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆器中进行冰浴匀浆。

然后再加入冰冻的磷酸盐缓冲液，按脑组织质量与匀浆总体积1:10的比例，稀释混匀。

将制备好的10%脑匀浆以3000r/min离心15min，取上清液待测。

3 酶活性抑制测试3.1 配药液参照脲酶实验3.2DTNB 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、ATCh碘化硫代乙酰胆碱0.0314mol/L DNTB，0.0314mol/L ATCH3.3 酶活测试在3.00ml磷酸盐缓冲液(0.lmol/L,pH=8.0)中加入20uL酶液,混匀后37℃保温20min后, 依次加入100ulDTNB溶液(终浓度1.0mmol/L)和20uLATCh溶液(终浓度1.0mmol/L),充分混合,反应体积为3.14mL。

在412mn处用1cm比色皿，每隔0.5min读数,连续测定3min。

酶活力定义为每克脑蛋白每分钟水解底物的umol数。

这是未加药酶活力为E1。

在2.98ml磷酸盐缓冲液(0.lmol/L,pH=8.0)中加入20uL酶液，并加入不同浓度的药物（一个浓度测定一次），依次加入100ulDTNB溶液(终浓度1.0mmol/L)和20uLATCh溶液(终浓度1.0mmol/L),充分混合,反应体积为3.14mL。

在412mn处用1cm比色皿，每隔0.5min读数,连续测定3min。

计算出此时酶活，为E2。

抑制率计算公式为I（%）=(E1-E2)/E1*100%得到一系列不同浓度的抑制率以后，利用SPSS计算出药物的IC50。

[试验简报]小菜蛾乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶活力测定周先志，刘波*（福建省农科院生物技术中心）1前言通过田间三龄小菜蛾幼虫与网室内长期饲养的三龄小菜蛾幼虫的乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶的活性作比较，并测定不同温度下饲养的三龄小菜蛾幼虫的羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶的活力，发现抗性产生的原因。

通过测定小菜蛾不同龄期幼虫以及蛹和成虫的羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶的比活力，发现其酶活差异，并找出其酶活最小的发育阶段，即耐药性最差的发育阶段，指导田间用药，并将田间三龄小菜蛾幼虫与网室内长期饲养的三龄小菜蛾幼虫的乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶的活性作比较，发现抗性产生的原因。

2 材料与方法羧酸酯酶比活力测定参考Van Asperen(1962)的方法；乙酰胆碱比活力测定参考Ellman(1961)的方法；酶源蛋白质含量测定参考Bradford (1976)记述的考马斯亮蓝G-250染色法测定。

3结果与分析3.1 不同龄期小菜蛾幼虫及蛹和成虫α-NA羧酸酯酶活力由表1可知不同龄期的小菜蛾幼虫α-NA羧酸酯酶的总活力和比活力均随龄期的增大而增大，四龄小菜蛾幼虫的总活力和比活力最大，一龄小菜蛾幼虫总α-NA羧酸酯酶活力的最小，蛹的α-NA羧酸酯酶的比活力最小，蛹期的总活力要高于一龄幼虫，但比活力要低于一龄幼虫，这是由于一龄小菜蛾幼虫的蛋白质浓度要低于蛹。

小菜蛾蛹、成虫和一龄幼虫的α-NA羧酸酯酶比活力差异不显著，四龄小菜蛾幼虫的总活力和比活力与一龄小菜蛾幼虫的相比差异较大，分别是一龄的7.32和5.31倍。

表1 不同龄期小菜蛾幼虫以及蛹和成虫α-NA羧酸酯酶活力虫龄 总活力umol.min.头比值 比活力umol.min.mg比值1 2 3 4 蛹成虫2.0421×108.3993×10-31.1393×10-21.4943×10-24.8466×10-32.947×10-31.004.115.587.322.371.446.519×102.1454×10-23.2283×10-23.4630×10-25.231×10-36.6749×10-31.003.294.955.310.801.023.2 不同龄期小菜蛾幼虫以及蛹和成虫乙酰胆碱酯酶活力由表2可知，不同龄期的小菜蛾幼虫的乙酰胆碱的总活力和比活力均随虫龄的增大而增大，蛹的乙酰胆碱总活力高于四龄幼虫，但比活力低于四龄幼虫。

胆碱酯酶（CHE）测定操作规程一、用途本产品用于体外定量测定血清、血浆样品中胆碱脂酶（CHE）的活性。

二、临床意义（一）概述胆碱脂酶可以分为乙酰胆碱酯酶和假性胆碱酯酶，前类亦称真性胆碱酯酶，主要存在于胆碱神经末梢突触间隙。

乙酰胆碱酯酶可以在神经末梢、效应器接头或突触间隙等部位终止乙酰胆碱作用。

（二）临床意义1. 病理性升高：肾病综合征，甲状腺功能亢进，糖尿病，脂肪肝，原发性家族性高CHE血症，血清CHE变异，原发性肝癌等。

2. 病理性降低：重症肝炎，慢性肝炎活动型，肝硬化，肝脓肿，各种癌，低蛋白血症(营养不良，贫血，感染，皮肌炎，急性心肌梗死)，遗传性血清CHE异常症，有机磷中毒(轻度中毒降低30%，中度中毒降低50%，重度中毒降低70%)，溃疡性结肠炎，肾功能不全，天疱疮，烧伤等。

（三）检验原理胆碱酯酶催化S-碘化丁酰基硫代胆碱水解，生成丁酸与硫代胆碱，硫代胆碱与黄色的铁氰化钾[Fe(CN)6]3-反应后形成无色的[Fe(CN)6]4-，在405nm吸光度下降的速率与标本中胆碱酯酶活性成正比。

四、样品血液样品原则上采集晨起空腹血（禁食12小时）；患者处于平静、休息状态，减少患者由于运动、饮食带来的影响；静脉采血时患者应取坐位或卧位；止血带使用后1分钟内采血，回血后立即松开；正确使用抗凝剂；防止溶血；防止过失性采样。

样品运送过程中应防止过度振荡、防止样品容器的破损、防止样品被污染、防止样品及唯一性标志的丢失和混淆，防止样品对环境的污染、水分蒸发。

CHE测定样品为不溶血的血清、血浆（肝素抗凝）。

样品应在低温条件下运输并及时测定。

不能使用EDTA抗凝剂的标本。

五、试剂（一）试剂组成不同批号试剂中各组份不能互换。

（二）试剂准备R1和R2试剂为即用型液体试剂，开瓶装载即可使用，用后应及时冷藏保存。

（三）试剂的保存及稳定性1. 不能冰冻试剂。

2. 未开瓶的R1和R2试剂应在2～8℃密闭避光贮存，稳定期为瓶签标示的有效期。

乙酰胆碱酯酶活性测定全血胆碱酯酶活性的测定全血胆碱酯酶活性的测定——羟胺三氯化铁法实验目的1. 掌握三氯化铁比色法的实验原理、分析步骤及酶测定的临床意义。

2. 了解常见全血胆碱酯酶活性测定方法的优缺点、注意事项。

3. 学会末梢血的采集。

实验原理血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。

未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱和碱性羟胺反应，形成红色羌酸铁络合物。

颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。

在波长520nm比色定量，由水解的乙酰胆碱的量计算胆碱酯酶活性。

试剂和材料蒸馏水分光光度计盐酸溶液(1＋2) 10mL比色管碱性羟胺溶液漏斗磷酸盐缓冲液(PH＝7.20) 恒温水浴箱，控温±0.5℃三氯化铁溶液采血针头氯化乙酰胆碱标准液血色素吸管采样、运输和保存用血色素吸管，取指血20μL，注入比色管中(事先加入0.98mL磷酸盐缓冲液)，立即进行测定。

实验步骤A 样品管+0.98mL 磷酸盐缓冲液+0.02mL全血37℃水浴+1.0mL乙酰胆碱应用液37℃水浴30minB 对照管0.98mL磷酸盐缓冲液+0.02mL全血37℃水浴5min +1.0mL水37℃水浴30minC 标准管1.0mL 磷酸盐缓冲液37℃水浴5min + 1.0mL 乙酰胆碱应用液30minD 空白管 1.0mL 磷酸盐缓冲液37℃水浴+1.0mL水37℃水浴30min水浴之后对A、B、C、D四个试管分别进行以下操作：1.加入4.0mL 碱性羟胺溶液，充分振摇2min；2.加入2.0mL 盐酸溶液，充分振摇2min；3.加入2.0mL 三氯化铁溶液，充分振摇；4.滤纸过滤，520nm比色。

实验结果表1-1 520nm波长下样品的吸光度样品编号 A B C D吸光度0.299 0.003 0.538 0.000结果计算①计算酶活性的绝对值带入得：Xs=0.538+0.003-0.299⨯7=3.149μ0.538molXs：水解乙酰胆碱的浓度，μmol(0.02mL37℃30min)；A：试剂空白为参比的在波长520nm处样品管的吸光度值；以B：以试剂空白为参比的在波长520nm处对照管的吸光度值；C：以试剂空白为参比的在波长520nm处标准管的吸光度值。